全 文 ：①本文为吉林省科技厅资助项目(20080913)
作者简介:王丽君(1964年-),女 ,硕士, 教授 ,主要从事天然药物化
学成分及生物活性的研究 , E-mail:lijun0926@163.com。
doi:10.3969/ j.issn.1000-484X.2010.12.006
龙牙 木多糖诱导人肝癌 SMMC-7721细胞凋亡机制研究①
王丽君　石莉萍　(北华大学化学与生物学院 ,吉林 132013)
　　中国图书分类号　R735.7　R392.1　R730.1　　文献标识码　A　　文章编号　1000-484X(2010)12-1082-04
[ 摘　要] 　目的:探讨龙牙 木多糖(AEPS)对体外培养人肝癌 SMMC-7721细胞凋亡的影响 , 并探讨其可能的作用机制。
方法:荧光显微镜观察细胞形态学变化 , 流式细胞术(FCM)检测 SMMC-7721 细胞的凋亡率;Western blot检测不同浓度 AEPS 作
用 36小时凋亡蛋白 survivin 、caspase-3 及 bcl-2的表达情况 。结果:与对照组比较 , AEPS 不同浓度剂量组 Hoechst 33258/PI荧光
染色出现典型的凋亡形态学改变;FCM 检测表明 SMMC-7721细胞凋亡率各实验组均明显高于对照组(P <0.01),且呈时间剂
量依赖性;Western blot显示与对照组相比 ,各实验组 AEPS 可显著下调 SMMC-7721 细胞 survivin 和 bcl-2 的表达(P <0.01), 而
caspase-3 的表达显著增加(P<0.01)。结论:AEPS 能明显诱导人肝癌 SMMC-7721 细胞凋亡 , 其机制可能与改变凋亡相关基因
survivin 、caspase-3 及 bcl-2 的表达有关。
[ 关键词] 　龙牙 木多糖;凋亡;survivin;caspase-3;bcl-2
AEPS induces apoptosis in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells and its mecha-
nism
WANG Li-Jun , SHI Li-Ping.College of Chemistry and Biology ,Beihua University , Jilin 132013 , China
[ Abstract] 　Objective:To study the mechanism of apoptosis induced by AEPS in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells.Methods:
The fluorescent microscope was utilized to observe the morphological changes of apoptosis , apoptosis rate were detected with flow cytometry.
Western blot was utilized to detect the expression of survivin , caspase-3 and bcl-2.Results:Typical morphological changes of apoptosis in
SMMC-7721 cancer cells could be observed by the fluorescence microscope.Compared with that of the control cells , apoptotic rate of the cells
treated with AEPS was increased signifcantly(P<0.01)and in a dose-and time-dependent manner.Western blot showed that survivin and bcl-
2 expression was signifcantly decreased(P<0.01), whereas caspase-3 expression was signifcantly increased(P <0.01)in SMMC-7721 can-
cer cells treated with AEPS.Conclusion:AEPS can markedly induce apoptosis in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells.The mechanism
might be related to the change of survivin , caspase-3 and bcl-2 expression.
[ Key words] 　Polysaccharide of Aralia elata Seem(AEPS);Apoptosis;survivin;caspase-3;bcl-2
　　龙芽 木(Aralia elata Seem.A.mandshurica Max)
又名辽东 木 ,系五加科 木属植物。主要分布于
我国东北 ,朝鲜 、日本等地亦有分布 ,资源丰富。其
性味辛苦 ,有小毒 ,药用部分主要是根皮 、树皮及叶 。
具有补气安神 、强精滋肾 、驱风活血 、除湿止痛的功
能 ,用于治疗神经衰弱 、风湿性关节炎 、肝炎 、糖尿
病 、胃痉挛 、便秘 、外伤出血等症[ 1] 。近年来 ,龙芽
木在化学成分和药理活性研究方面取得很大进展 ,
但对其研究主要集中在皂苷类化合物 、黄酮类化合
物和挥发油类化合物等方面[ 2] 。作者前期研究了龙
牙 木多糖(AEPS)抑制 S180肉瘤细胞 、A549肺癌细
胞 、SMMC-7721肝癌细胞的增殖 ,并探讨了其抑制肿
瘤细胞增殖的免疫机制。然而植物多糖抗肿瘤作用
的机制目前存在着多种理论和推测[ 3] :(1)增强宿主
免疫功能而发挥抗肿瘤作用;(2)诱导细胞凋亡与诱
导细胞分化;(3)抗突变作用;(4)改变瘤体细胞膜的
生长特性;(5)抑制肿瘤血管形成。不同的研究思路
和研究结果显示 ,各种途径 、机制在许多方面是相互
联系 、相互交叉的。而且多数观点认为诱导细胞凋
亡是植物多糖防治肿瘤的重要机制[ 3] 。因此从诱导
细胞凋亡的角度探讨 AEPS抗肿瘤的机制引起了我
们极大的兴趣 。本文以 SMMC-7721肝癌细胞为体
外模型 ,研究AEPS 诱导人肝癌细胞凋亡 ,探讨其作
用机制 ,以求为肝癌的治疗寻求新的有效方法 、策略
提供基础研究资料 。
1　材料与方法
1.1　主要材料与仪器　AEPS(纯度 96.83%)由本
实验室制备 ,SMMC-7721肝癌细胞(中国科学院上海
·1082· 中国免疫学杂志 2010年第 26卷
细胞生物学研究所),DMEM 培养基(美国 Gibco BRL
公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司),
碘化丙啶(PI)(美国 Caltag 公司),β-actin 、bcl-2 , sur-
vivin 、caspase-3抗体(Santa Cruz Biotechnologies公司),
流式细胞仪(FCM)(美国 Beckman coulter 公司),An-
nexin/PI 凋亡检 测试剂 盒(北京宝 赛公司),
Hoechst33258/PI 荧光染色试剂盒(美国 Sigma 公
司),BX51TF 荧光显微镜(日本 Olympus公司)。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　SMMC-7721肝癌细胞株培养在
10%胎牛血清的 DMEM 培养基(含 100 U/ml青霉素
和100 U/ml链霉素)中 ,于 37℃、5%CO2 的细胞培
养箱中培养 ,用 0.25%的胰酶消化传代 ,取对数生
长期细胞进行实验。
1.2.2　荧光显微镜观察 SMMC-7721肝癌细胞凋亡
　将 1×106细胞接种于 6孔细胞培养板中 ,培养 24
小时后 ,分别加入 50 、100 、200 μg/ml的 AEPS ,同时
设对照组 , 48 小时后行常规细胞涂片 , 固定 ,
Hoechst33258/PI染色后封固 ,荧光显微镜下观察 ,记
录细胞形态变化情况 ,拍照。
1.2.3　Annexin V-FITC/PI 双染法流式细胞仪检测
细胞凋亡　选取对数生长期细胞接种于 24孔板中 ,
加入AEPS使其终浓度分别为50μg/ml(低剂量组)、
100μg/ml(中剂量组)、200 μg/ml(高剂量组),处理
细胞 12 、24 、36 、48 小时后 ,用 0.25%胰酶+0.02%
EDTA消化 ,计数后取约 5×105 个细胞 ,1 000 r/min
离心 5分钟后弃上清液 ,用预冷 PBS洗涤 2次 ,按试
剂盒说明书加入 Annexin V-FITC 10 μl和 PI 5 μl ,避
光室温反应15分钟 ,在 1小时内用流式细胞仪检测
凋亡细胞比率。使用 CellQuest软件获取细胞信息 ,
Winmdi软件分析细胞凋亡 。实验重复 3 次 ,另设空
白对照组 。
1.2.4 　Western blot 检测 survivin 、caspase-3 和 bcl-2
蛋白表达　应用Western blot技术 ,以 β-actin作为内
照物 ,比较各组 survivin 、caspase-3和 bcl-2 蛋白表达
水平的改变 。作用 36小时后分别收集空白对照组 、
AEPS 50 、100 、200μg/ml剂量组的细胞 ,PBS洗 3次 ,
加入预冷的细胞裂解液 ,裂解后离心取上清 , 用
Bradford法测定各种蛋白的浓度。分别取蛋白样品 ,
按体积比4∶1加入上样缓冲液 ,100℃、5分钟变性 ,
经 SDS-PAGE(5%的浓缩胶 ,18%的分离胶)电泳分
离后 ,将蛋白电转印于硝酸纤维素膜经脱脂奶粉封
闭液封闭 ,将硝酸纤维素膜分别加入稀释后一抗 ,再
用相应辣根过氧化物酶(HPR)标记的二抗稀释液孵
育 ,用 ECL 发光法检测不同样品各种蛋白表达状
况 。图像以 Bio-Rad 图像分析系统分析 ,用目的蛋
白条带的平均光强度值与 β-actin条带的平均光强
度值的比值表示该蛋白表达的相对强度。
1.3　统计学分析　实验数据以 x— ±s 表示 ,采用
SPSS10.0 软件处理系统进行单因素方差分析 。
2　结果
2.1　Hoechst33258/PI双染法观察细胞凋亡形态学
改变　AEPS 50 、100 、200 μg/ml处理 SMMC-7721 细
胞 48小时 , Hoechst 33258/PI荧光染色结果见图 1。
不同浓度 AEPS处理 SMMC-7721细胞 48小时后 ,出
现典型的凋亡形态学改变。染色质分布均匀的蓝色
细胞为正常细胞。细胞核染色质凝集 、分布不均 、产
生强烈荧光为凋亡细胞 ,染成红蓝色为晚期凋亡细
胞 ,染成红色荧光为坏死细胞 。50 、100 、200 μg/ml
处理过的凋亡率均显著高于对照组 ,但坏死率也高
于对照组。
2.2　FCM 检测 AEPS 对SMMC-7721细胞凋亡率的
影响　各组细胞在AEPS 作用12小时后即出现凋亡
现象(图 2),低 、中 、高剂量组凋亡率分别为(10.14±
0.91)%、(12.32±1.50)%和(14.53±1.97)%,与空
白对照组细胞(5.31±0.65)%比较 ,差异有统计学
意义(P <0.01);其余时间点各组比较 ,AEPS 处理
组凋亡率均高于对照组 ,差异有统计学意义(P <
0.01);另外 ,随着时间的延长 ,细胞凋亡的现象越来
图 1　荧光显微镜观察 SMMC-7721 肝癌细胞凋亡(×400)
Fig.1　The apoptosis of SMMC-7721 cells were observed by the fluorescent microscope(×400)
Note:A.Control group;B.50μg/ml;C.100μg/ml;D.200μg/ml AEPS for 48 h.
·1083·王丽君等　龙牙 木多糖诱导人肝癌 SMMC-7721细胞凋亡机制研究　第 12期
图 2　SMMC-7721 细胞经不同浓度 AEPS处理 12 小时后凋亡情况
Fig.2　Apoptosis rate in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of AEPS for 12 h
Note:A.Control group;B.50μg/ml;C.100μg/ml;D.200μg/ml.
图 4　AEPS对 SMMC-7721细胞 survivin、 caspase-3 及 bcl-2 蛋白表达的影响
Fig.4　The expression levels of survivin, caspase-3 and bcl-2 in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of
AEPS
Note:n=3 , x—±s.＊.P<0.05, ＊＊.P<0.01 vs control group(0μmol/ L).
图 3　SMMC-7721 细胞经不同浓度 AEPS处理后凋亡情况
Fig.3　Apoptosis rate in SMMC-7721 cells after treatment with
various concentrations of AEPS
Note:n=3 , x—±s.＊.P<0.01 vs cont rol group(0μmol/L).
越明显 ,同时在同一时间点随着 AEPS 浓度增加 ,细
胞凋亡率亦增加 ,呈现明显的剂量/时间正向依赖关
系(图 3)。
2.3　AEPS对 SMMC-7721细胞 survivin 、 caspase-3及
bcl-2蛋白表达的影响　Western blot检测显示经 50 、
100 、200 μg/ml AEPS处理 SMMC-7721细胞 36小时 ,
结果见图 4A。蛋白条带相对强度图表明 (图 4B),
不同浓度的 AEPS 作用 SMMC-7721细胞后 , survivin
和 bcl-2的蛋白表达均呈现下调的趋势 , 200 μg/ml
AEPS 作用 SMMC-7721细胞几乎完全抑制 survivin的
表达 ,而 caspase-3 的表达却显著升高 , 其效应均具
有浓度梯度依赖性 。
3　讨论
肿瘤的发生是一个多基因 、多步骤 、多阶段的复
·1084· 中国免疫学杂志 2010年第 26卷
杂过程 ,细胞凋亡在肿瘤的发生发展中主要起负调
控作用[ 4] 。细胞凋亡受抑是肿瘤的发病机制之一 ,
细胞凋亡的失衡导致肿瘤发生并影响肿瘤的生物学
行为[ 5 ,6] 。首先 ,本研究检测了 AEPS 处理 SMMC-
7721细胞后的凋亡情况 ,结果显示与对照组比较 ,
AEPS不同浓度剂量组 Hoechst33258/PI 荧光染色出
现典型的凋亡形态学改变;FCM 检测表明 AEPS 处
理细胞 12 小时后 ,SMMC-7721 细胞即出现凋亡现
象 ,且存在剂量 、时间效应关系 。由此推测诱导细胞
凋亡是AEPS抗肿瘤作用机制之一。
survivin是新发现的一种凋亡抑制蛋白家族成
员 ,也是迄今发现的最强的凋亡抑制因子 , survivin
的过度表达抑制了细胞凋亡 ,有利于细胞的异常增
殖和恶性转化。 caspase-3是 caspase 家族中重要的
凋亡执行者之一 ,抑制 caspase-3的活性或拮抗其功
能可使细胞凋亡受抑。功能强大的凋亡抑制基因
survivin主要在凋亡通路的下游抑制 caspase-3 发挥
抗凋亡的效应[ 7] 。为此 ,我们采用Western blot检测
了相关凋亡蛋白 survivin 和 caspase-3的表达情况 。
结果显示抑制凋亡蛋白 survivin 在 AEPS 诱导下出
现了表达显著下调 ,而致凋亡蛋白 caspase-3的表达
显著增加 ,从而导致 SMMC-7721细胞凋亡 。
bcl-2蛋白的功能是阻遏细胞凋亡 ,并能协助细
胞抵抗免疫系统的监视作用 ,最终导致肿瘤的形成 ,
其过度表达已被证实存在于多种肿瘤组织中 。本研
究结果表明AEPS可显著下调SMMC-7721细胞bcl-2
的表达(P<0.01),提示AEPS诱导SMMC-7721细胞
凋亡还可能与 bcl-2的表达下调有关 。
caspase 家族是细胞凋亡中发挥关键作用的酶 ,
许多凋亡诱导剂可通过 caspases 依赖的方式诱导 。
Survivin 家族凋亡相关基因通过调节线粒体途径影
响凋亡的发生 , survivin 可直接与 caspase-3 、caspase-7
结合并抑制它们的活性[ 8 ,9] 。bcl-2家族成员与线粒
体膜通透性相关并调结膜的完整性[ 10] 。本研究中
AEPS 诱导的 SMMC-7721 细胞凋亡 ,一方面可能与
下调 survivin 和 bcl-2表达有关 , 另一方面还可能通
过增加 caspase-3 的表达。这些研究结果提示 ,线粒
体途径可能是AEPS诱导SMMC-7721细胞凋亡的主
要机制之一 。
4　参考文献
1　江苏新医学院.中药大辞典[ M] .上海:上海人民出版社 , 1997:
2583-2589.
2　孙　涛 ,张国荣 ,王　彦 et al.龙芽 木化学成分 、药理作用和食
用价值的研究进展[ J] .人参研究 , 2009;1:78-81.
3　姜建芳 ,王思平 ,何新军.中药多糖抗肿瘤作用研究进展[ J] .中国
现代应用药学杂志 , 2008;25(7):616-618.
4　Mitza A ,McGuirkM ,Hockenberry T N et al.Human survivin i s negative-
ly regulated by wild-type p53 and part icipates in p53-depend apoptotic
pathway[ J] .Oncogene ,2002;21(17):2613-2622.
5　Viard-Leveugle I , Veyrenc S , French L E et al.Frequent loss of Fas ex-
pressin and function in human lung tumors with overexpression of FasL in
small cell lung carcinoma[ J] .J Pathol ,2003;201(2):268-277.
6　Daniel J C , Smythe W R.The role of Bcl-2 fami ly members in non-small
cell lung cance[ J] .Semin Thorac Cardiovasc Surg , 2004;16(1):19-27.
7　Shin S , Sung B J , Cho Y S et al.An anti-apoptotic protein human surviv-
ing is a direct inhibitor of caspase-3 and 7[ J] .Biochem , 2001;40(4):
1117-1123.
8　Oliver C L ,Miranda M B , Shangary S et al.Gossypol acts directly on the
mitochondria to overcome Bcl-2-and Bcl-X L mediated apoptosis resistance
[ J] .Mol Cancer Ther , 2005;4(1):23-31.
9　Xu Z X , Zhao R X , Ding T et al.Promyelocytic leukemia protein 4 in-
duces apoptosis by inhibition of survivin expression[ J] .J Biol Chem ,
2004;279(3):1838-1844.
10　Adams J M , Cory S.The Bcl-2 protein family:arbiters of cell survival
[ J] .Science , 1998;281:1322-1326.
[收稿 2010-08-27]
(编辑　张晓舟)
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·1085·王丽君等　龙牙 木多糖诱导人肝癌 SMMC-7721细胞凋亡机制研究　第 12期