全 文 ：第 25卷　第 3期
2007年 9月 　　　　
广西师范大学学报:自然科学版
Journa l o f Guangx i No rmal Univ ersity: Na tural Science Edition
　　　　　　 Vol. 25　 No. 3
Sep. 2007
收稿日期: 2007-03-08
基金项目: 广西自然科学基金资助项目 (桂科自 0542040)
作者简介: 秦新民 ( 1956- ) ,男 ,广西灵川人 ,广西师范大学教授 ,博士。
罗汉果性别相关的 RAPD标记
秦新民1 , 黄夕洋 2 ,蒋水元 2
( 1. 广西师范大学生命科学学院 ,广西 桂林 541004; 2.中国科学院广西植物研究所 ,广西 桂林 541006)
摘　要:应用随机扩增多态性 DN A( RAPD)技术寻找与罗汉果性别相关的分子标记 ,筛选了 130个 10 bp的随
机引物 ,发现有 4个引物 ( S60、 S90、 S100、 S343)能在雌、雄株 DNA间扩增出 5条差异性片段 ,大小在 300～
1 300 bp之间 ,表明这些特异带可被用来作为性别鉴别的特异性分子遗传标记。
关键词: 罗汉果 ;性别 ; RAPD标记
中图分类号: Q78　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1001-6600( 2007) 03-0109-04
罗汉果 Siraitia grosvenorii ( Sw ing le) C. Jef f rey属葫芦科 Cucurbi taceae罗汉果属 Siraitia ,为多年生草
质藤本植物 ,主要产于我国广西临桂、永福、龙胜等县。罗汉果味甘 ,性凉 ,有清热解暑、润肺止渴功用 ,临床
上可用于治疗高血压、肺结核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性气管炎和急慢性扁桃腺炎等疾病 ,在我国民间用
药历史已达 300多年。目前栽培面积约 2. 33 hm2 ,年产量 15亿个左右 ,主要出口销往美国、韩国、新加坡等
欧美及东南亚的二十几个国家和地区。近年来 ,随着种植面积的扩大 ,罗汉果病虫害的种类也在增多 [1～ 3 ] ,
严重危害和影响罗汉果的质量与产量。因此 ,急需开展罗汉果抗病品种的育种和优良品种雌、雄单株的选
育工作。但罗汉果为雌雄异株植物 ,在未开花之前雌雄难辨 ,杂交育种的种子多数为雄性。 利用种子进行
遗传转化、新品种培育、扩大繁殖以及生产上合理的雌雄株配置都需要对罗汉果雌雄株进行鉴别。因此 ,对
罗汉果性别标记的研究在生产及理论上均有重要意义。
RAPD标记是建立在 DNA水平上的分子标记 ,由于其许多优点 ,已被广泛应用于栽培植物品种的分
类研究 [4～ 6 ]。 近年来 , DN A分子标记技术被应用于植物性别鉴定中 ,特别是 RAPD技术因其具有操作简
单、迅速、可靠、不需特异性引物、模板需要量小等优点 ,在猕猴桃 [ 7, 8]、大麻 [9, 10 ]、番木瓜 [11～ 13 ]、黄瓜 [14, 15 ]、
银杏 [16, 17 ]等植物的性别研究上取得了令人满意的结果。我们利用 RAPD技术对罗汉果性别进行研究 ,旨
在为罗汉果雌、雄单株的鉴定、雄性基因的克隆等方面提供分子标记。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
罗汉果 (青皮果品种 )雌、雄株新鲜成熟叶片。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　 DNA提取。罗汉果雌雄各 10株叶片的总 DNA提取 ,参照 Sambrook等 [ 18]的方法略加修改 ,提取的
总 DNA经过酚、氯仿、异戊醇抽提和 RNase纯化。
1. 2. 2　 PCR扩增。 RAPD反应体系为 25μL,其中CMg2+为 1. 5 mmol /L, dN TP为 0. 2 mmol /L,引物为 0. 5
μmo l /L, Taq DN A聚合酶单位为 1 U,模板 DNA约 20～ 100 ng , 10× Buffer缓冲液 2. 5μL,用双蒸水补足
至 25μL。RAPD扩增在 Biometra UNOⅡ PCR仪上进行 ,反应程序为: 94℃预变性 5 min; 94℃变性 1 min,
36℃退火 1 min, 72℃延伸 2 min,共进行 40个循环 ;最后 72℃延伸 10 min。 PCR扩增完成后 ,取 8μL反
应液点样于 1. 5%琼脂糖凝胶上 ,于 1× T AE缓冲液中电泳检测 ,经 EB染色后的凝胶在复日科技 FR-200
生物电泳图像分析系统上照相。
DOI : 10. 16088 /j . i ssn. 1001 -6600. 2007. 03. 025
2　结果分析
2. 1　 DNA提取与随机引物的筛选
对雄性和雌性罗汉果植株叶片样品进行总 DNA提取 ,所提取的 DNA量较一致 ,没有拖尾及弥散现
象 ,纯度较高 ,达到了 RAPD反应要求。将所有罗汉果雌、雄株总 DNA,采用 Michelmo re[19 ]集群分离分析法
( BSA法 )分别取等量的个体 DNA组成雄性 DNA池和雌性 DNA池 ,用 130个 10 bp随机引物 (上海生物工
程技术服务有限公司 )对两性 DNA池进行 RAPD-PCR扩增 ,筛选与性别性状相关的 RAPD标记 ;但由于
遗传背景的复杂 ,个体间仍有较大差异 ,所以之后再用雄性和雌性单株个体 DNA对表现多态性的随机引
物做了进一步验证 ,重复 3次。
2. 2　罗汉果雌雄株间的 RAPD分析
从 130个随机引物中最后筛选出了 4个引物 ( S60、 S90、 S100、 S343) ,能在雄性 DNA池、雌性 DNA池
和雌、雄单株中均扩增出一致的特异性条带 ,扩增结果见图 1～ 4。
图中均可清晰地看出雌雄之间存在明显的特异性条带 (箭头标出 ) ,而且无论是在雌雄 DNA池还是在
各个雌雄单株个体间 , RAPD扩增出的图谱均是一致的。由 S60、 S90、 S100和 S343这 4个随机引物扩增出
的多态性是稳定且重复性好的 ,并且特异带明显易于分辨。表 1为这 4个随机引物的序列和各自相对应的
PCR特异性条带的大小。
图 1　罗汉果雌、雄株 DNA用引物 S60扩增结果
Fig. 1　 Results of am plifica tion o f ma le and female DNA w ith the primer S60
0泳道为空白对照 ( ddH2O代替模板 DN A) ; 1泳道为雄性 DN A池 ; 8泳道为雌性 DNA池 ; 2～ 7泳道为雄性单株
DN A; 9～ 14泳道为雌性单株 DN A; Marker为 DN A Marker13
图 2　罗汉果雌、雄株 DNA用引物 S90扩增结果
Fig. 2　 Results of am plifica tion o f ma le and female DNA w ith the primer S90
1泳道为雄性 DN A池 ; 8泳道为雌性 DNA池 ; 2～ 7泳道为雄性单株 DNA; 9～ 14泳道为雌性单株 DNA; Marker为 DN A Marker13
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图 3　罗汉果雌、雄株 DN A用引物 S100扩增结果
Fig. 3　 Results of amplification of ma le and fema le DN A with the primer S100
0泳道为空白对照 ( ddH2O代替模板 DN A) ; 1泳道为雄性 DN A池 ; 7泳道为雌性 DNA池 ; 2～ 6泳道为雄性单株
DN A; 8～ 14泳道为雌性单株 DN A; Marker为 DN A Marker13
图 4　罗汉果雌、雄株 DN A用引物 S343扩增结果
Fig. 4　 Results of amplification of ma le and fema le DN A with the primer S343
1泳道为雄性 DN A池 ; 8泳道为雌性 DNA池 ; 2～ 7泳道为雄性单株 DNA; 9～ 14泳道为雌性单株 DNA; Marker为 DN A Marker13
表 1　罗汉果雌雄株间存在特异带的随机引物及其特异带大小
Tab. 1 The random primers and specif ic bands and sizes amplif ied
随机引物号 引物序列 特异带的大小
S60 5′ACCCGGTCAC3′ 约 700 bp,为雄性特异带
S90 5′AGGGCCGTCT3′ 一条约 400 bp,另一条约 300 bp,均为雄性特异带
S100 5′TCTCCCTCAG3′ 约 600 bp,为雄性特异带
S343 5′TCTCCGC TTG3′ 约 1 300 bp,为雄性特异带
　　从表 1可看出 ,这 4个随机引物所扩增出来的特异带位置 ,都是与罗汉果性别紧密连锁的 RAPD标记。
3　讨论
分子标记是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记 ,随机扩增多态性 DNA( RAPD)技术为常
用的 DNA分子标记之一。 它是以 PCR技术为背景 ,每个扩增片段代表基因组上一个位点 ,这些扩增产物
的多态性反映了基因组相应区域 DNA的多态性 ,只要筛选足够多且具有多态性的引物 ,就可以得到与性
别性状有用的信息。
本实验选筛了 130个随机引物 ,结果发现只有引物 S60 ( 5′ACCCGGTCAC3′)、 S90( 5′AGGGC-
CGTCT3′)、 S100( 5′TCTCCCTCAG3′)和 S343( 5′TCTCCGCT TG3′)这 4个随机引物仅在雄性 DNA池、
雌性 DNA池和雌、雄单株 DNA中扩增出特异性谱带。这 4个引物一共产生 5条特异带 ,大小在 300～ 1 300
bp。 由于试验材料是同一品种的罗汉果雌雄株基因组 DNA,它们之间除了性别决定基因所在座位的局部
区域外 ,其余绝大部分顺序都是相同的 ,因此它们之间的多态性低 ,而一旦发现多态性 ,这些多态性的分子
111第 3期　　　　　　　　　　　　　　秦新民等 :罗汉果性别相关的 RAPD标记　　　　　　　　　　　　　　
标记就极可能与性别决定基因紧密连锁。 因此 ,这 4个随机引物所扩增出来的特异带与罗汉果性别相关 ,
可用于罗汉果雌雄株鉴定的分子标记。
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RAPD Markers Linked to Sex in Siraitia grosvenorii ( Swingle) C. Jeffrey
QIN Xin-min
1 , HUANGXi-yang
2 , JIANG Shui-yuan
2
( 1. Co lleg e o f Life Science, Guangxi Normal Univ er sity , Guilin 541004, China; 2. Guangx i Institute o f Bo tany,
Chinese Academy o f Sciences, Guilin 541006, China)
Abstract: The sex-linked molecule ma rkers in Siraitia grosvenorii ( Swingle) C. Jeff rey were studied by
Random Amplified Polymo rphic DN A ( RAPD) analy sis. The resul ts show ed tha t 4 random primers
could ampli fy polymo rphic markers of sex f rom genomic DN A of male and female plants. The primers
S60, S90, S100, and S343, produced 5 male-specific PCR products ranged in size f rom 300 bp to 1 300
bp in RAPD aralysis. These ma rkers could be used to dif ferentiale male and female indiv iduales o f S.
grosvenori i plants.
Key words: Sirait ia grosvenorii ( Swing le) C. Jeff rey; sex; RAPD marker
(责任编辑　马殷华 )
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