全 文 ：大青叶抑制巨细胞病毒致细胞病变的药效实验初探
刘海智 , 陈素华 , 王昕荣 , 乔福元 , 凌霞珍
(华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科 , 湖北武汉　430030)
摘　要:目的　观察大青叶体外抗豚鼠巨细胞病毒的活性。方法　采用细胞病变法和 MTT法 , 在豚鼠胚肺细胞培养上
测定大青叶抗豚鼠巨细胞病毒的药效指标 , 同时观察大青叶对豚鼠巨细胞病毒的抑制作用。 结果　大青叶的最大无毒浓度
(TD0)为 3g· mL-3 , 最小有效浓度 (MTC)为 3g· mL-4 , 治疗指数 (TI)为 10, 体外对豚鼠巨细胞病毒的抑制率为
96.28%。结论　大青叶在体外具有良好的抗豚鼠巨细胞病毒的活性。
关键词:大青叶;抗病毒;体外;豚鼠巨细胞病毒
中图分类号:R373.4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1006-9534 (2006)01-0058-03
Anexperimentalstudyofdrugeffectaboutfoliumstatidisinhibitingcelllesioninducedguineapigcytomegalovirus.LIU
Hai-zhi, CHENSu-hua, WANGXin-rong, etal. (DepartmentofObstetricsandGynecology, TongjiHospitalTongjiMedical
Colege, HuazhongScienceandTechnologyUniversity, Wuhan, Hubei, 430030, China)
Abstract:Objective:ToevaluatetheantiviralactivityofFoliumStatidisagainstguineapigcytomegalovirs(GPCMV)infection
invitro.Methods:ByusingthecytopathiceffectinhibitionmethodandMTTmethod, suchefectivenessindicesofFoliumStatidisa-
gainstGPCMVastheminimaltherapeuticconcentration(MTC), thetherapeuticindex(TI)andGPCMVinhibitionratewerecalcu-
lated.TheinhibitoryactivityofFoliumStatidisagainstGPCMVwasobservedontheguineapigembryocel.Results:Themaximal
tolerancedosage(TD0)ofFoliumStatidiswas3g· mL-3 , MTCwas3g· mL-4 , TIwas10, andtheGPCMVinhibitionratewas
99.63%.ThecytopathicefectwassignificantlyinhibitedbyFoliumStatidisadministered.Conclusion:FoliumStatidishassignifi-
cantantiviralefectonGPCMVinfectionconsecutivelyinvitro.
Keywords:FoliumStatidis;Antiviralactivity;Invitro;Guineapigcytomegalovirus
　　大青叶(FoliumStatidis)系十字花科植物菘蓝的枝和叶 ,
文献报道 [ 1-5] ,大青叶具有抗病毒 、抗炎和免疫增强作用 , 对
流行性感冒 、流行性乙型脑炎 、流行性腮腺炎 、扁平疣 、病毒
性心肌炎 、病毒性肝炎等病毒感染引起的疾病疗效显著 , 但
用于抗巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)感染的治疗尚未
见报道。 本实验首次在豚鼠胚肺细胞(guineapigcmbryo
cel, OPEC)培养上对大青叶抑制豚鼠巨细胞病毒(guieapig
cytomegalovirus, GPCMV)致细胞病变作用进行初步约效实验
观察 , 报道如下。
资料与方法
1.病毒和细胞　GPCMV标准株 22122和 GPEC均购自
美国典型培养物保藏中心
(ATCC)。GPEC常规培养传代:GPCMV经 GPEC活化
增殖达 75%时 , 收获病毒作为毒种 , 并滴定半数组织细胞感
染量 , (tissuecultureinfectiousdose, TCID50)。以上均在华中
科技大学同济医学院附属同济医院实验中心细胞培养室进
行。
2.培养液及试剂　①生长液为 DMEM, 内含 10%新生
小牛血清 、青霉素 100U· mL-1 、链霉素 100μg· mL-1 , 使用
5.6%碳酸氢钠调整 pH值为 7.2 ～ 7.4。维持液含 2%新生
小牛血清以外 , 余同细胞生长液 , pH值为 7.4。消化液为 0.
25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA(乙二胺四乙酸二钠)等体积
混合。 ②MTT溶液的配制:MTT粉末 250mg,放入小烧杯 ,
基金资助:国家自然科学基金资助项目(基金编号:39970769)
加入 0.01mol· L-1的 PBS(pH=7.4)50ml, 使终浓度为 5mg
· mL-1 , 在磁力搅拌机上搅拌 30min, 用 0.22μm的微孔滤器
除菌 , 分装 , 4℃避光保存备用 ,两周内有效 , 临用前稀释至 0.
5mg· mL-1。
3.药物　①实验药物:大青叶由华中科技大学同济医
学院附属同济医院中药厂提供并制备成流浸膏。制备方法:
大青叶生药研磨成粉末状 , 用 70%乙醇加热回流提取三次 ,
提取液减压回收溶剂至无醇味 , 并浓缩成流浸膏 ,浓度为 3g
· mL-1 , 用 0.22μm的微孔滤器过滤除菌 ,置 4℃保存 , 临用
前用维持液稀释至所需浓度。 ②对照药物:更昔洛韦(ganci-
clovir, GCV)粉针剂(商品名:丽科伟), 规格:50mg/支 ,批号:
020304, 由湖北科益药业股份有限公司生产。 用细胞维持液
配成 10mg· ml-1的母液 , 置 4℃保存 , 临用前用维持液稀释
至所需浓度。
4.病毒毒力测定　将生长良好的 GPEL, 经 0.25%胰酶
消化后 , 用 DMEM细胞培养液调细胞数为 2 ×105 /ml, 加至
96孔细胞培养板 , 100μl/孔 ,置 37℃、5%CO2培养箱培养 24
～ 48h,待细胞长成单层片状后 , 吸弃各孔生长液 , 加入维持
液 200μl, GPCMV用维持液按 10倍梯度稀释成 10-1、 10-2 、
10-3 、10-4 、10 -5 、10 -6 、10 -7共 7个浓度。每个稀释度病毒接
种 4孔 , 每孔 100μl, 同时设 4孔正常细胞对照 , 置 37℃、5%
CO培养箱培养 7d, 逐日观察记录细胞病变情况 , 用 Reed-
Muench法 [ 6]滴定 TCID50。 细胞病变(CPE)程度判定标准:
(-)示细胞无病变 , (+)示 25%的细胞出现病变 , (++)示
26% ～ 50%的细胞出现病变 , (+++)示 51% ～ 75%细胞
出现病变 , (++++)示 76% ～ 100%细胞出现病变。
·58· 中国优生与遗传杂志 2006年第 14卷第 1期DOI :10.13404/j.cnki.cjbhh.2006.01.032
5.药物细胞毒性测定　①细胞病变法　将 GPEC接种
96孔板 , 待细胞生长呈单层片状后 , 倾去生长液 ,用维持液按
10倍梯度稀释大青叶至 3g· mL-1、3g· mL-2、3g· mL-3、3g
· mL-4 、3g· mL-5 、3g· mL-6 、3g· mL-7共 7个浓度及 GCV
至 1000μg· mL-1、100μg· mL-1、 10μg· mL-1 、1μg· mL-1 、
0.1μg· mL-1 、0.01μg· mL-1共 6个浓度 , 每个稀释度设 4
孔作为实验孔 , 同时设 4孔正常细胞对照。置 37℃、5%CO2
培养箱培养 7d。逐日观察记录细胞生长情况及形态变化 ,确
定大青叶及 GVC对 GPEC最大无毒浓度 TD0(即与正常细胞
对照比较 , 能够对半数以上实验孔细胞无毒性的最大药物浓
度)。判定标准:加药后出现细胞皱缩 、细胞间隙变大 、胞质
粗糙 、不透明 、部分细胞脱落 、细胞内有较多颗粒等形态改变
记录为(+), 示细胞出现药物毒性反应;(-)示细胞形态正
常 , 无药物毒性反应 , 未出现细胞形态改变的最大的药物浓
度即 TD
0
。 ②MTT法:培养 72h后 , 每孔加入 MTT溶液(0.
5mg· mL-1)20μl,继续孵育 4h, 弃上清 ,每孔加入 150μlDM-
SO,振荡 10min, 使结晶充分溶解。 选择 560nm波长 , 用 96
孔酶标测定仪(DG3022型酶联免疫检测仪 , 华尔电子管厂生
产)读取各孔吸光度 A值(OD560), 计算细胞存活率(细胞存
活率% =药物处理组的 OD值 /正常细胞对照组的 OD值 ×
100%),找出药物的 TD0(细胞存活率大于 50%的药物浓
度)。
6.细胞培养药效实验
(1)测定大青叶和 GCV的最小有效浓度(MTC)及治疗
指数(TI):　①细胞病变法　将 GPEC接种 96孔板 , 每孔
100μl,待细胞生长呈单层片状后 , 用 100 TCID50病毒攻击量
100μl/孔接种培养板 , 置 37℃、 5%CO2 培养箱作用 2h, 分别
将大青叶和 GCV用维持液自 TD0 浓度按 10倍梯度稀释 6
个浓度 , 每个稀释度设 4孔作为实验孔 , 同时设正常细胞及
阳性病毒对照各 4孔。每天观察并记录病变出现时间和细
胞病变情况 , 确定大青叶和 GCV的 MTC, (与病毒对照比较 ,
能抑制半数以上实验孔细胞病变的浓度)。并计算 TI(TD0 /
MTC)。 ②MTT法:方法同上 , (细胞存活率%=药物处理组
的 OD值 /病毒对照组的 OD值 ×100%), 找出药物 MTC, 廾
计算 TI。
(2)大青叶和 GCV体外对 GPCMV抑制率测定:将已滴定
滴度的病毒原液分别与 TD0 的大青叶和 GCV等量混合, 置
37℃、5%CO2培养箱作用 2h,将混合液按 10倍梯度稀释 10°、
10-1、10-2 、10-3 、10-4、10-5共 6个浓度 , 每个稀释度接种 4孔
已长成单层 GPEC管作为实验孔 ,每孔 100μl, 同时设阳性病
毒对照和正常细胞对照孔各 4孔 ,置 37℃、5% CO2培养箱培
养。各细胞孔每天更换维持液一次, 并观察记录细胞病变情
况直至第 7d。用 Reed-muench法 [ 4]滴定用药后实验孔病毒
滴度。分别计算大青叶和 GCV体外对 GPCMV的抑制率。计
算公式:抑制率 =(用药物前病毒滴度 -用药后病毒滴度)/
(用药前病毒滴度)×100%。
(3)大青叶和 GCV抑制 GPCMV致细胞病变作用观察:
将 100 TCID50的病毒分别与 TD0的大青叶和 TD0GCV等量
混合 , 置 37℃、5%CO2培养箱作用 2h, 将混合液接种到已长
成单层的 GPEC孔 , 每孔 100μl,各 4孔作为实验组 , 同时设
100TCID50的病毒对照和正常细胞对照组各 2孔。置 37℃、
5%CO2培养箱培养。各细胞孔每天更换维持液一次 , 并观
察记录细胞病变情况 , 直至第 7d。
结　果
1.GPCMV毒力测定　跟踪观察 7d后 ,累积 19孔出现细
胞病变现象(10-1、10-2 、10-3和 10-4浓度各孔均出现细胞病
变 , 10-5浓度有两孔), 表现为 GPEC不同程度变圆、肿胀、核
变大 ,细胞间界限不清 , 多个细胞融合形成巨大细胞 , 培养液
中可见多量脱落细胞:累积 9孔细胞无病变 , 细胞形态呈多角
形或梭形 ,透明 ,细胞间界限清楚 , 细胞生长仍呈良好的细胞
单层。根据 Reed-muench法 [ 6]计算 , GPCMV标准株 22122
的 TCID
50
为 105.23· mL-1(即 1.7×105 /mL)。
2.药物的细胞毒性测定　①细胞病变法:在倒置显微
镜下观察实验组及正常细胞对照组各孔 ,发现大青叶 TD
0
为
3g· mL-3 , GCV的 TD0为 100μg· mL-1 , 当药物大于该 TD0
浓度时 , 细胞出现毒性反应 , 表现为细胞增殖缓慢 , 细胞变
圆 、大小不一 、折光性强 , 胞浆颗粒增多 , 培养液混浊。 ②
MTT法:大青叶在 3g· mL-3及 GCV在 100μg· mL-1以下药
物浓度作用下 ,细胞存活率大于 50%,即大青叶的 TD0为 3g
· mL-3 , GCV的 TD0为 100μg· mL-1。两种方法测得药物
的最大无毒浓度结果一致 ,表明结果可靠。
3.大青叶和 GCV细胞培养药效实验
(1)大青叶和 GCV的 MTC及 TI测定结果:①细胞病变
法:与病毒对照比较 ,大青叶在浓度为 3g· mL-5 、3 g· mL-6
及 3 g· mL-7时细胞病变(++++), 3 g· mL-3及 3 g·
mL-4浓度时细胞病变(-);GCV的浓度分别在为 10μg·
mL-1时 , 4孔实验管中仅 2孔出现细胞病变 , 在 100μg·
mL-1和 10μg· mL-1浓度时细胞病变(-);大青叶和 GCV
的 MTC分别为 3g· mL-4和 10μg· mL-1 , TI均为 10。 ②
MTT法:大青叶在 3 g· mL-3、 3 g· mL-4浓度及 GCV在
100μg· mL-1和 10μg· mL-1浓度时可抑制 50%以上的细胞
病变。大青叶和 GCV的 MTC分别为 3 g· mL-4和 10μg·
mL-1。 TI均为 10。细胞病变法和 MTT两种方法测定结果
一致。
(2)大青叶和 GCV体外对 GPCMV抑制率测定结果:大
青叶和 GCV在用药前病毒原液滴度均为 1.7×105TCID50 ,用
药后病毒滴度分别为 6.32×103 TCID50和 3.16×102TCID50 ,
根据公式 , 计算大青叶和 GCV体外对 GPCMV的抑制率分别
为 96.28%和 99.63%。
(3)大青叶和GCV抑制 GPCMV致细胞病变实验观察结果
(见表 1):大青叶和 GCV分别在第 5d及第 6d天始出现(+)～
(++)的细胞病变 ,病毒对照组从第 1d始出现进行性细胞病变
至第 7d细胞全部脱落。表明大青叶和 GCV均能抑制或延缓细
胞病变出现 ,且病变程度明显小于病毒对照组。
讨　论
孕妇 HCMV感染会导致宫内传播 , 引发流产 、早产 、死
胎 、胎儿宫内发育迟缓 、胎儿畸形等不良妊娠结局 [ 7] 。目前 ,
在临床上治疗 HCMV感染主要以更昔洛韦为主。但是 ,由于
·59·中国优生与遗传杂志 2006年第 14卷第 1期
表 1　大青叶和 GCV用药后 1 ～ 7d细胞病变抑制情况
组别 /孔号 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d
　大　　1 - - - - + ++ ++
　青　　2 - - - - - + ++
　叶　　3 - - - - - - +
　组　　4 - - - - - - -
　更　　1 - - - - - + ++
　昔　　2 - - - - - + +
　洛　　3 - - - - - - -
　韦　　4 - - - - - - -
　病毒　1 + + ++ +++ ++++ ++++ 细胞全部脱落
　对照　2 + + + ++ +++ ++++ 细胞全部脱落
　细胞　1 - - - - - - -
　对照　2 - - - - - - -
　　以上实验均重复 3次 ,所得结果相同
孕妇的特殊生理状态 , 更昔洛韦类药物因其具有致畸 、骨髓
抑制等毒副作用而大大限制了在妊娠期及哺乳期的安全应
用。因此 , 寻求安全性高 、疗效好的抗 HCMV药物用于妊娠
期感染妇女 , 是围生期 HCMV感染治疗研究的重点内容。属
于十字花科植物菘蓝的大青叶 , 是常用的清热解毒类中药。
现代临床和实验室均证明大青叶具有抗病毒 、抗炎和免疫增
强作用 [ 1-5] ,长期毒性实验和生殖毒性实验结果均为阴性 ,
表明其安全性良好 [ 8] 。
根据我们以往的动物实验和临床研究显示 [ 9, 10] , 中药金
叶败毒可有效减少 CMV宫内感染的发生及改善子代生长发
育 , 但其具体作用机制不明。大青叶是金叶败毒的重要组方
之一 , 为了探讨药物的有效成分 , 本实验采用体外培养方法 ,
建立 GPCMV感染细胞模型 , 观察大青叶对 GPCMV致细胞
病变作用的抑制效果 , 并与更昔洛韦相对照 , 应用细胞病变
及 MTT两种方法相结合共同评价其抗 GPCMV作用效果。
实验结果显示:GPCMV感染 GPEC后出现典型的细胞病变 ,
加入大青叶后 , 能明显抑制或延缓细胞病变出现 , 且病变程
度明显小于病毒对照组:此结果提示:大青叶在体外可以减
轻或抑制 GPCMV致细胞病变反应 ,对细胞具有保护作用 ,但
该作用略低于 GCV。此外 , 药效学指标测定结果显示:大青
叶的 TDo为 3g· mL-3MTC为 3 g· mL-4 , TI为 10, GCVTDo
为 100μg· mL-1 , MTC为 10μg· mL-1 , TI亦为 10;大青叶和
GCV体外对 GPCMV的抑制率分别达 96.28%和 99.63%;这
些良好的药效学参数均为大青叶抗 CMV感染提供了理论基
础。尽管与 GCV相对照 ,大青叶体外抗 GPCMV的效果要略
低于 GCV,但是 , 大青叶具有孕期用药安全的优势 , 使得大青
叶在围生期抗 CMV感染仍具有重要价值。
但是 , 大青叶属于中药制剂 , 其活性成分及作用靶点众
多 , 抗病毒效应的作用机理复杂 , 而本实验仅仅从体外过程
初步观察该药的抗 GPCMV效应 ,因此 , 为了更全面评价大青
叶抗 CMV作用 , 还需要做更进一步的 、只体的分子作用机制
和整体动物实验研究 , 以此才可以综合评价其抗 CMV的疗
效 , 以期待为围生期 HCMV感染的药物治疗开辟一条新的思
路。
参 考 文 献
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(10):609-611.
收稿日期:2005-09-21
党中央在 “十一五 ”规划 《建议 》中提出:
“积极推行优生优育 ,提高出生人口素质 ”
2005年 10月 11日中共十六届中央委员会第五次全体会议通过 “十一五 ”规划建议 。
《建议》在对卫生工作的要求中提出 “积极推行优生优育 ,提高出生人口素质 ”。这对我们优生优育工作
者是一项重要政策和努力的方向。
(健康报 05-10-19)
·60· 中国优生与遗传杂志 2006年第 14卷第 1期