全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Biotechnology　2003 ,10(5):312 ～ 316
灰树花胞外多糖的分离纯化及其性质研究
史宝军 ,张家骊 ,杨平平 ,聂小华 ,陶文沂
(江南大学生物工程学院生物制药研究室 , 江苏无锡 214036)
摘　要　灰树花发酵液浓缩 , 醇析后得多糖粗品。经 H2O2脱色 , Sevag 法脱蛋白 ,透析 , DEAE Sepharose Fast
Flow 柱层析纯化 , 得到灰树花胞外纯多糖 GLP。HPLC 检测为单一均多糖 ,其平均分子质量为 83 000。完全酸水
解后经纸层析 ,气相色谱分析 , GLP 只含有葡萄糖。经红外光谱 , 刚果红实验 , 高碘酸氧化 , Smith 降解分析 , 初步
推测其结构是具有(1※6)和(1※3)β 型葡聚糖。
关键词　灰树花;胞外多糖;分离纯化;性质
中图分类号:Q539 文献标识码:A 文章编号:1005-8915(2003)05-0312-05
　　灰树花(Grifola frondosa)隶属担子菌亚门 ,多
孔菌科 ,是一种营养丰富 ,生物活性物质含量高的
珍贵蕈菌 。灰树花多糖具有明显的抗肿瘤 , 抗
HIV ,改善免疫系统功能 ,调节血糖 、血脂及胆固醇
水平 ,降血压等作用[ 1 ～ 4] 。灰树花多糖是所有真菌
生物活性物质中抗肿瘤活性最强的[ 5] 。本研究对
灰树花发酵液中的多糖进行分离纯化 ,得到一种纯
多糖 ,报道了其理化性质和组成结构。
1　材　料
1.1　材料
1.1.1　菌株 　GF9801由江南大学生物工程学院
生物制药研究室提供 。
1.1.2　灰树花深层发酵　按照文献[ 6] 介绍的方
法制备灰树花菌丝体 。
1.2　试剂与仪器
DEAE Sepharose F.F.,Dextran T500 ,T110 ,T70 ,
T40 ,T20 ,T10均为 Pharmacia产品 ,其余试剂均为国
产分析纯;U-3000紫外可见扫描仪 ,日立公司产
品;752紫外可见分光光度计 ,上海精密科学仪器
有限公司;美国 Necolit5D×B傅立叶变换红外光谱
仪。
2　方　法
2.1　多糖的分离和纯化
发酵液离心后 ,上清浓缩 , 95%乙醇 4℃沉淀
过夜 ,沉淀经无水乙醇 ,丙酮 ,乙醚依次洗涤 ,真空
干燥。取适量干粉加入 100 ml蒸馏水 ,加热搅拌
使其溶解 ,抽滤 ,去杂质 , 95%乙醇重新沉淀多糖 ,
共重复 3次(得到多糖粗品)。将粗品制成 1%水
溶液 ,搅拌下滴加 0.5倍量的无水乙醇 ,4℃过夜 ,
弃沉淀 ,上清继续滴加 1.2倍量的无水乙醇 ,4℃过
夜 ,离心 ,洗涤 ,真空干燥 。干粉溶于适量水中 ,经
10%H2O2脱色(46℃),Sevag 法除蛋白后 ,流水透
析2 d ,蒸馏水透析 1 d(中间换水 4次), 12 000 r
min离心后 ,上清经 DEAE Sepharose Fast Flow 柱层
析(2.6 cm×13 cm),蒸馏水洗脱 ,苯酚-硫酸法隔
管检测多糖 ,合并水洗多糖单一峰组分 ,浓缩后加
入 3倍体积的无水乙醇沉淀多糖 ,即得到灰树花胞
外多糖(GLP).
2.2　纯度鉴定及分子质量测定
2.2.1　紫外光谱分析　多糖浓度 0.5 mg ml ,扫描
波长 190 ～ 300 nm 。
2.2.2　高压液相色谱　将多糖配制成 20 mg ml的
溶液进样。采用 Ultrahydrogel liner(7.8 mm ×300
mm)色谱柱 ,双柱串联 ,示差折光检测器 ,流动相为
0.1mol L NaNO3溶液 ,体积流量为 0.9ml min ,柱温
45℃,进样量 20μl ,记录样品色谱曲线。
2.2.3　相对分子质量测定　完全按 HPLC测定纯
度时的相同条件 , 将相对分子质量分别为 T500
312
收稿日期:2002-11-11　修回日期:2003-03-06
作者简介:史宝军 , 1973年生 ,男,博士研究生 ,主要从事生物研究。
　 通讯联系人:E-mail:sbjss 2000@sina.com , Tel:0510-5862938
(482000),T110(110000),T70(70000), T40(40000),
T20(21600),T10(10000)的标准 Dextran 相继进样 ,
记录各自的保留时间 RT。待测样品相同条件进
样 ,得到多糖相对分子质量。
2.3　红外光谱分析
红外光谱为溴化钾压片 ,测定范围为 4 000 ～
400 cm
-1 。
2.4　单糖组成分析
2.4.1　纸层析 　取 20 mg 样品加 1 mol L 硫酸 3
ml ,封管 ,100℃水解 6 h ,水解液用碳酸钡中和 ,过
滤 ,浓缩点样 ,新华滤纸 1号 ,溶剂系统为正丁醇-
乙酸-水(4:1:5),苯胺-邻苯二甲酸溶液显色 ,葡
萄糖 ,半乳糖 ,甘露糖 ,木糖为标准作对照。
2.4.2　气相色谱分析　参照文献[ 7]所述方法制
备糖乙酰化衍生物 ,然后直接进行气相色谱分析 。
采用弹性石英毛细管柱 ,内径 0.32 mm ,长 30m ,担
体为 Chromosorb WAW DMCS(80 ～ 100目),固定液
为3%OV-1701 ,载气 N2 ,体积流量 1.5 ml min ,氢
火焰检测器(FID),气化室温度 260℃,检测温度
250℃,程序升温:180℃(3 min)※240℃(30 min)。
根据标准单糖与样品的保留时间的比较 ,确定组成
单糖的种类 ,并根据各峰面积计算出mol比 。
2.5　构象分析-刚果红实验[ 8]
不同浓度(0-0.5 mol L)NaOH 溶液中加入刚
果红 ,使其浓度为 50μmol L 作为对照组 。对照组
中加入 GLP ,使样品终浓度为 1mg ml作为样品组 。
分别在 400 ～ 600 nm波长范围内扫描 ,观察GLP和
刚果红的复合物最大吸收波长 。
2.6　结构分析
2.6.1　α-淀粉酶作用　将GLP 与α-淀粉酶溶液混
合 ,37℃保温培养 4 d ,3 ,5-二硝基水杨酸法(DNS)
及纸层析检测还原糖 。
2.6.2　高碘酸氧化[ 9] 称取 40 mg 多糖 ,加入 50 ml
0.015mol L 高碘酸钠 ,避光置于室温暗处反应 ,测
定223 nm不同时间间隔(2 h ,6 h , 12 h , 24 h ,48 h ,
72 h , ……)反应液的吸光度 ,直至达一稳定值 ,计
算高碘酸的消耗量 。另取 10 ml反应液 ,加入乙二
醇并搅拌 30 min以还原剩余的高碘酸 , 0.01 mol L
NaOH滴定甲酸的释放量。
2.6.3　Smith 法降解[ 9] 　取经高碘酸氧化完全的
多糖溶液 20ml ,加入乙二醇反应 30min ,对蒸馏水
透析 48 h , 用 NaBH4于室温暗处还原 12 h , 再用
0.01mol L冰醋酸调节 pH 5 ,分解过量的 NaBH4 ,对
蒸馏水透析24 h后冷冻干燥 ,进行完全酸水解 ,作
双向纸层析鉴定产物 ,AgNO3-NH4OH显色。
3　结　果
3.1　GLP的理化性质
GLP 醇析物成白色纤维状 ,真空干燥后呈粉末
状 ,冷冻干燥呈海绵状。溶于水 ,易溶于热水 ,水溶
液较粘稠 。不溶于高浓度的乙醇 ,乙醚 ,丙酮 ,乙酸
乙酯等有机溶剂 。茚三酮 , I2-KI 反应均呈阴性 。
苯酚-硫酸法为阳性。
3.2　GLP的纯度鉴定及其相对分子质量的测定
GLP 紫外光谱显示无 280 nm ,260 nm吸收(图
1),说明多糖溶液中没有蛋白质 ,核酸等杂质 ,可见
光 600 nm 处无色素吸收峰 。 　GLP 经高压液相色
谱测定呈单一对称吸收峰(图 2),表明多糖 GLP 是
一纯多糖 。经 HPLC 测得 GLP 的相对分子质量为
83 000(图 3)。
Fig 1　UV spectrum of GLP
Fig 2　HPLC of GLP
313史宝军等:灰树花胞外多糖的分离纯化及其性质研究
Fig 3　Determination of GLP Molecular Weight
3.3　GLP 的红外光谱
GLP 红外图谱显示(图 4),在 3200 ～ 3600 cm-1
出现一种宽峰 ,是O-H的伸缩振动 ,表明多糖存在
分子内和分子间的氢键。在 2800 ～ 3000 cm-1的吸
收峰是糖类 C-H 伸缩振动 ,这一区域的吸收峰是
糖类的特征吸收峰。1200 ～ 1400 cm-1的弱吸收峰
是C-H的变角振动 。1000 ～ 1200 cm-1间比较大的
吸收峰是由两种 C-O 伸缩振动所引起的 ,其中一
种属于C-O-H的 ,另外一种是糖环的 C-O-C 。1630
cm
-1处的吸收峰是--CHO 的 C =O 造成的。890
cm
-1处有一吸收峰 ,是吡喃糖 β-型 C-H 变角振动
的特征吸收峰 ,表明有 β-糖苷键。
Fig 4　IR spectrum of GLP by HPLC
3.4　GLP 单糖组成分析
GLP 经酸水解纸层析 ,只与标准葡萄糖有一致
的斑点。未经水解的样品 ,同样作纸层析没有糖的
移动点 ,也说明样品中无单糖 ,双糖等小分子糖类 。
GLP 的完全酸水解产物NaBH4
还原成糖醇 ,已酰化 ,GC分析 ,结果样品所呈
峰的保留时间与标准葡萄糖一致(表 1),表明 GLP
为单一葡聚糖。
Tab 1　Retention time of gas chromatography of alditol acetate on
hydrolyzed GLP
Standard sugar
Retention time(min)
Standard GLP
Xylose 18.017
Mannose 22.867
Glucose 23.992
Galactose 24.767 24.012
3.5　GLP的构象分析
GLP 能与刚果红形成复合物 ,导致刚果红的最
大吸收波长(λmax)发生改变(图 5)。在 NaOH 浓度
低于 0.16mol L 时 ,复合物λmax较对照有明显升高;
当NaOH 浓度(>0.16 mol L)增至足以破坏维持 3
股螺旋构象的氢键时 , 因 3 股螺旋构象的破坏 ,
GLP 不能与刚果红形成复合物 ,其最大吸收波长将
因复合物的解体而下降 ,并与对照作用的刚果红相
同。GLP 同刚果红在不同浓度 NaOH 溶液中的络
合行为与许多以(1※3)Glc为主链 ,并带有(1※6)
分支的葡聚糖相似[ 10 , 11] .
Fig 5 　Change ofλmax of Congo red-GLP complex in different
concentration of NaOH
3.6　GLP的结构分析
GLP 经α-淀粉酶水解后 , DNS 法测定还原糖 ,
未见有多糖的水解 ,说明GLP 不能被α糖苷键酶水
解 ,表明GLP无α(1※4)糖苷键。
GLP 的高碘酸氧化结果(图 6), 经紫外光谱
(223 nm)检测 , 120 h 后高碘酸消耗量基本达一稳
定值。测得每 mol葡萄糖基消耗高碘酸为 0.74
mol ,甲酸释放量为 0.31 mol ,提示有较多的葡萄糖
残基是以 1※6糖苷键相连或处于分子的末端 ,而
314 药 物 生 物 技 术 第 10 卷第 5期
Fig 6　Periodate oxidation of GLP
其他糖残基则以不消耗高碘酸的 1※3键相连 ,或
以平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸的(1※2)或
(1※4)键相连 。Smith降解结果只检出葡萄糖(棕
黑色),甘油(紫色 ,量少)两个斑点 ,提示 GLP 具有
β(1※3)和 β(1※6)连接的糖苷键。
4　讨　论
已发现的灰树花多糖多种多样 ,多数为葡聚
糖 ,既有 β 型也有α型 ,其主链有 β(1※3),β(1※
4),β(1※6)-葡聚糖 ,α(1※4),α(1※6)-葡聚糖;
侧链有 β(1※6),β(1※3)[ 12] 。例如 ,以灰树花子实
体为原料 ,经热水浸提得到的多糖主要含 β -葡聚
糖 ,具有明显的抗肿瘤活性 ,而发酵菌丝体经热水
提取的多糖含有大量α-葡聚糖 ,无抗肿瘤活性 。
另外 ,不同的提取方法 ,如用热水 、冷碱液 、热碱液
分别提取 ,得到 3种子实体多糖 ,其分子质量分别
为500 000 ,12 000 ,75 000 ,若将热碱液改为氯化锌
液提取 ,则得到多糖分子质量为 14 000 ,等等 。由
于无论灰树花子实体还是其发酵菌丝体均含有多
种不同类型的多糖 ,因此用一种溶剂 ,一种方法很
难将不同类型的多糖完全分离 ,而这些胞内多糖 ,
胞外多糖 ,储存多糖或胞壁多糖 ,其共同特点是不
均一性 ,如分子质量不均一性 ,组成极性末端结构
的不均一性等等 。因此不同的原料 ,不同的提取分
离方法 ,会得到分子质量 ,结构性质 ,生物活性等特
征差异程度不等的多糖。文章从 Smith 法降解 ,高
碘酸氧化结果只能初步推测纯多糖含1※3和 1※6
糖苷键 ,进一步的确切化学结构还需要通过 NMR ,
甲基化分析等方法来确定。但是通过纸层析 ,气相
色谱分析知道 GLP 为葡聚糖 ,红外光谱和酶解实
验 ,可以看出 GLP 是 β -吡喃糖苷键;此外 , Congo
Red实验符合于绝大多数具有 β(1※6)分支的 β(1
※3)葡聚糖 ,而主链为 β(1※3)葡聚糖在多糖抗肿
瘤等生物活性中最重要 ,该多糖的药理实验正在进
行中 。
参考文献
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315史宝军等:灰树花胞外多糖的分离纯化及其性质研究
Studies on the Isolation , Purification and Characterization of an Extra-
cellular Polysaccharide from Grifola frondosa
SHI Bao-jun , ZHANG Jia-li ,YANG Ping-ping ,NIE Xiao-hua , TAO Wen-yi
(School of Biotechnology , Southern Yangtze University , Wuxi 214036 , China)
Abstract　An extracellular polysaccharide GLP was isolated from the culture filtrate of Grifola frondosa.The crude
preparation was obtained by alcohol precipitation and purified by ethanol grade fractionation and DEAESepharose Fast
Flow ion exchange chromatography.GLP was homogenous , as determined by HPLC and its average molecular weight
was 83000.By PC andGC analyses , it only contains glucose.IR , Cong Red reaction , periodate oxidation and Smith
degredation showed that GLP was β–glucan with (1※3)and(1※6)bonds.
Key words　Grifola frondosa , Extracellular polysaccharide , Isolation and purification , Characterization
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316 药 物 生 物 技 术 第 10 卷第 5期