全 文 ：　第 21 卷第 3 期
2002年 5月 　 　 　　　　 　
无 锡 轻 工 大 学 学 报
Journal of Wuxi University of Light Industry
　 　 　　　　Vol.21　No.3
May.　2002
　文章编号:1009-038X(2002)03-0244-05
　　收稿日期:2001-11-05;　修订日期:2001-12-29.
作者简介:陈石良(1969-), 男 ,湖南邵阳人 , 工学博士 ,上海中企东方资产管理有限公司高级研究员.
灰树花胞外多糖的性质与结构
陈石良1 , 　马青2 , 　谷文英1 , 　陶文沂1
(1.江南大学 食品学院 ,江苏 无锡 214036;2.杭州娃哈哈集团有限公司科研中心 ,浙江 杭州
310020)
摘　要:对发酵法生产的灰树花胞外多糖 GLP-A-2的理化特性与结构进行了初步研究.经凝胶柱
层析和 HPLC 检测纯度 ,证明水溶性多糖 GLP-A-2为单一均匀组分 ,不含蛋白质和核酸 ,比旋光度
[α] 12D =+177.50°(H2O ,0.1),HPLC法测得平均相对分子质量为 6.2×104.GC 、IR和13C-NMR分
析表明 ,GLP-A-2是一类 β-葡聚糖 ,分子的主链以 β-(1※3)-糖苷键连接 ,并含有 β-(1※6)、α-(1※
2)、α-(1※3)及 β-(1※2)糖苷键相连的侧链.GLP-A-2可与刚果红结合 ,形成的络合物在 0 ～ 0.4
mol/L 的 NaOH 溶液中 ,表现出最大吸收波长(λmax)的特征变化 ,同时在 CD谱中出现明显的有序
结构信息.这提示 GLP-A-2在溶液中存在三股螺旋构象 ,维持其有序构象的力可能以氢键力为主.
关键词:灰树花;胞外多糖;结构分析
中图分类号:Q 538 文献标识码:A
The Character and Structure of Extracellular Polysaccharide
from Grifola frondosa
CHEN Shi-liang1 , 　MA Qing2 , 　GU Wen-ying1 , 　TAO Wen-yi1
(1.School of Food Science and Technology , Southern Yang tze University , Wux i 214036 , China;2.Research &Devel-
opment Centre , Hangzhou Wahaha Group Co.LTD , Hangzhou 310020 , China)
Abstract:The physical and chemical characteristics of G LP-A-2 isolated from fermentation broth of
Gri fola frondosa were primarily determined.The w ater-soluble polysaccharide GLP-A-2 was proved
to be a homogeneous component by using the techniques of Sephadex G-200 colum chromatography
and HPLC.It had a optical rotat ion [α] D= +177.50°(H2O ,0.1).The average molecular weight of
G LP-A-2 w as 6.2×104 determined by HPLC.The st ructure of GLP-A-2 w as determined by GC , IR
and 13C-NMR.The results showed that GLP-A-2 w as β-D-g lucan , which possessed a β-(1※3)link-
aged backbone and sidechains involving β-(1※6), β(1※2),α-(1※2), α(1※3)-glycosidic bonds.
G LP-A-2 could form a complex with Congo red and exhibited the specific change in the abso rption
maximum of the Congo Red-glucan complex.On the other hand , CD spect ra analy sis showed that
G LP-A-2 had an ordered molecular structure.All these indicated that G LP-A-2 probably took a triple
helical confo rmation in w ater and its hydrogen bond force w as probably a main fo rce supporting that
conformation.
Key words:Gri fola frondosa;ex t racelllular polysaccharides;st ructure analysis
　　多糖的生物活性直接依赖于糖链的结构与构
象 ,揭示多糖结构与功能的关系是目前真菌多糖的
研究热点.虽然有关灰树花多糖结构的分析已有不
少报道[ 1 ,2] ,但大多数是以来自子实体的多糖为研
究对象 , 而对发酵产物中的多糖结构研究还较
少[ 3] .GLP-A-2是作者从灰树花 GfUV04菌株发酵
液中分离纯化出来的一种主要多糖组分 , 经动物实
验证实 ,该组分具有显著的抗肿瘤和增强机体免疫
功能的作用[ 4] .
1　材料与方法
1.1　材料
GLP-A-2按文献[ 4]介绍的方法制备.
1.2　试剂
Dex tran 标准品和 Sephadex G-20 为 Pharmacia
公司产品 ,D-葡萄糖 、D-甘露糖 、D-半乳糖 、D-木糖 、
D-鼠李糖和 D-阿拉伯糖均为 Sigma公司产品 ,其余
均为国产分析纯试剂.
1.3　仪器
红外光谱仪:IR-440 ,日本 Shimadzu 仪器公司
生产;核磁共振仪:AX300 ,瑞士 BRUKER仪器公
司生产;气相色谱仪:GC-14A ,日本岛津公司生产.
高压液相色谱仪:Waters公司生产 ,配置有 2140 示
差折光检测器 、510泵和 740数据处理机;J-500C 圆
二色谱仪 、WZZ-2A 自动旋光仪:上海物理光学仪器
厂生产.
1.4　方法
1.4.1　高压液相色谱1 将糖样配成 20 mg/mL 的
溶液进样.采用 Ultrahydrogel linear(7.8 mm×300
mm)色谱柱 , 双柱串联 , 氢火焰离子化检测器
(FID).流动相为 0.1 mol/L NaNO3 溶液 ,体积流量
为 0.9 mL/min ,柱温 45 ℃,进样量 20 μL ,记录样
品色谱曲线.
1.4.2　相对分子质量测定　按 HPLC 测定纯度时
的相同条件 ,将相对分子质量分别为 4 100 ,71 400 ,
110 000 , 200 000 , 580 000 的标准 Dextran 相继进
样 ,记录各自的保留时间 RT , 以 RT 为横坐标 ,
lg M为纵坐标 ,绘制标准曲线.待测样品按上述条
件进样 ,求得 RT ,查标准曲线 ,得到多糖相对分子
质量.
1.4.3　红外光谱分析1 取多糖 10 mg 与 KBr 压
片 ,用 IR-440扫描.
1.4.4　紫外光谱分析1 将多糖配成质量浓度为0.1
g/dL 的溶液 ,采用 UV-300扫描.
1.4.5　核磁共振分析(13C-NMR)1 20 mg 多糖样
品溶于 0.5 mL D2O 中 , 300 MHz 的 NMR 仪在
313 K下连续 4 h 测定 ,参考标准为 DSS.
1.4.6　气相色谱分析1 参照文献[ 5]所述方法制备
糖乙酰化衍生物 ,然后直接进行气相色谱分析.采
用弹性石英毛细管柱 ,内径 0.32 mm ,长 30 m ,担体
为Chromosorb WAW DMCS(80 ～ 100 目),固定液
为 3%OV-1701 ,载气 N2 ,体积流量 1.5 mL/min ,氢
火焰检测器(FID),气化室温度 260 ℃,检测温度
250 ℃, 程序升温:180 ℃(3 min)※240 ℃(30
min).根据标准单糖与样品的保留时间的比较 ,确
定组成单糖的种类 ,并根据各峰面积计算出摩尔
比.
1.4.7　圆二色谱测定1 将样品配成 2.0%的多糖
溶液 ,以 J-500C 圆二色谱仪在室温条件下进行测
定 ,波长范围为 190 ～ 350 nm.
1.4.8　刚果红实验1 按文献[ 8]所述方法 ,以 UV-
754分光光度计在 0 ～ 0.4 mol/L NaOH 溶液条件
下测 λmax的变化 ,以 Dextran T-41以及纯刚果红溶
液为参比 ,手控波长扫描.
1.4.9　比旋光度测定1 将样品配成一定浓度的溶
液 ,WZZ-2A 自动旋光仪以室温条件下测定比旋光
度.
2　结果与分析
2.1　纯度鉴定
2.1.1　凝胶柱层析　洗脱液经苯酚-硫酸法测多糖
分布 ,以管号对光密度作图 ,为单一对称洗脱峰(见
图 1).
图 1　GLP-A-2 的 Sephadex G-200 柱层析
Fig.1　Chromatogram of GLP-A-2 on Sephadex G-200
Colum
2.1.2　高压液相色谱　多糖经高压液相色谱测定
呈单一对称吸收峰(见图 2).
245第 3期 陈石良等:灰树花胞外多糖的性质与结构
图 2　GLP-A-2 的高压液相色谱
Fig.2　HPLC of GLP-A-2
　　以上两种纯度检测结果表明 ,多糖 GLP-A-2为
均一组分.
2.2　物理性状
GLP-A-2为白色粉末状 ,易溶于水 ,不溶于乙
醇 、乙醚 、丙酮等有机溶剂.其比旋度为[ α] 15D =+
177.50°(H2O , 0.1).显色反应结果表明:GLP-A-2
与苯酚-硫酸试剂反应呈红色 ,与蒽酮试剂反应呈蓝
绿色 ,与α-萘酚试剂反应呈紫红色 ,与KI-I2 、斐林试
剂均不显色.
2.3　单糖组成
GC分析表明 , GLP-A-2 由葡萄糖组成(见图
3),为均一多糖.
图 3　GLP-A-2 水解物的气相色谱
Fig.3　GC of Hydrolysates of GLP-A-2
2.4　相对分子质量
经HPLC 测得 GLP-A-2的近似相对分子质量
约为 62 000(见图 4).
2.5　光谱分析
紫外吸收光谱(UV):紫外光谱分析表明 ,
GLP-A-2为末端吸收 ,未发现有核酸及蛋白质的吸
收峰(图 5).
　　红外吸收光谱(IR):GLP-A-2 图谱显示(见图
6),在 3 200 ～ 3 600 cm-1出现一种宽峰 ,是 O —H
的伸缩振动 ,表明多糖存在分子内和分子间的氢
键.在 2 800 ～ 3 000 cm-1的吸收峰是 C—H 伸缩振
动 ,这一区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰.1 200
～ 1 400 cm-1所看到的不太尖的吸收峰是 C —H 的
变角振动.1 000 ～ 1 200 cm-1间比较大的吸收峰是
由两种 C —O 伸缩振动所引起的 ,其中一种是属于
C —O —H 的 , 另一种是糖环的 C —O —C.1 630
cm-1处的吸收峰是 —CHO 的 C O 伸缩振动造成
的.890 cm-1处有一吸收峰 ,是吡喃糖 β-型 C —H 变
角振动的特征吸收峰 ,表明有 β-糖苷键[ 5] .
图 4　GLP-A-2 的相对分子质量测定
Fig.4　Determination of GLP-A-2 Molecular Weight by
HPLC
图 5　GLP-A-2 的紫外光谱
Fig.5　UV Spectrum of GLP-A-2
图 6　GLP-A-2 的红外光谱
Fig.6　IR Spectrum of GLP-A-2
2.6　NMR分析
由G LP-A-2的13C-NMR图谱(图 7)可知 ,在异
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头碳 9.8×105 ～ 1.1×10-4共振范围内出现 5个共
振信号 ,可以肯定有 5 个残基(异头碳)组成.
1)98.2×10-5和 78.1×10-5分别是异头碳和
连接碳的化学位移 ,这两处的共振信号说明多糖分
子中存在α-1 , 2-糖苷键 ,由于 O 取代发生在 C2 位
上 ,因而连接碳的共振向低磁场位移(7.0×10-5 ～
7.5×10-5※7.6×10-5 ～ 8.5×10-5),这同时表明
分子中有α-1 ,2-糖苷键连接的侧链[ 5 , 6] ;
2)9.96×10-5和 8.38×10-5两处的共振信号
说明多糖分子中存在 α-1 , 3-糖苷键连接的侧
链[ 5 ,6] ;
3)1.04×10-4和 7.04×10-5两处的共振信号
说明多糖分子中存在 β-1 , 3-糖苷键连接的侧
链[ 5 ,6] ;
4)1.04×10-4和 8.69×10-5两处的共振信号
说明多糖分子中存在 β-(1 , 3)-糖苷键[ 6] ,根据红外
光谱的结果 ,作者认为该键构成了 G LP-A-2 的主
链;
5)1.06×10-4和 8.25×10-5两处的共振信号
显示多糖分子中存在 β-(1 , 2)-糖苷键相连的侧
链[ 5 ,6] ;
6)7.1×10-5 ～ 7.7×10-5区为未取代碳 C2 、
C3 、C4和 C5 的化学位移 ,比较复杂 ,不易解析.
7)6.68×10-5是 C6 共振区[ 5] .
图 7　GLP-A-2 的13C-NMR
Fig.7　13C-NMR of GLP-A-2
2.7　多糖的构象分析
2.7.1 1 多糖 GLP-A-2可与刚果红形成稳定的络合
物　如图 8所示 , GLP-A-2 与刚果红结合 ,形成的
络合物在 0 ～ 0.4 mol/L 的 NaOH 溶液范围内 ,表
现为最大吸收波长(λmax)的特征变化.当 NaOH 溶
液浓度在 0.05 ～ 0.18 mol/L 范围内时 , λmax有一稳
定区 ,当 NaOH 浓度大于 0.25 mol/L 后 , λmax急骤
下降到与 Dex tran T-41 及单纯刚果红相同.由于
Dex tran为 1※6主干 ,分子整体不具刚性 ,不能形
成螺旋 ,更不能形成多股螺旋[ 7] ,因而不能出现刚
果红实验中的 λmax相对稳定区域.以上结果初步表
明 ,GMP-A-2在中性至弱碱性范围内是一有序的多
股螺旋 , 在中等碱性条件下(0.18 ～ 0.22 mol/L
NaOH 溶液)发生构象转变 ,在强碱性条件下则解体
为单股无规线团 ,不能与刚果红形成络合物.这种
特征变化与Hara C等人对 β-(1※3)葡聚糖构象的
研究结果相同[ 8 , 9] .
图 8 　不同 NaOH 浓度下 GLP-A-2—刚果红络合物
λmax的变化
Fig.8　Changes in the absorption maximum(λmax)of the
Congo Red -GLP-A-2 complex , at various con-
centrations of sodium hydroxide
2.7.2　圆二色谱分析(CD)1 用圆二色谱作 GLP-
A-2与脲试剂作用前后的分析 , 结果见图 9.可看
出 ,不加变性剂脲的样品溶液 ,除在 195 nm 处形成
极强的正科顿效应 , [θ]为+43.5°,尚在 211 nm 处
出现较强的负科顿效应 , [θ]为-11.4°,这显示存在
有序螺旋构象[ 10] .加变性剂脲作用后 ,CD谱发生了
明显的改变 ,即在所用仪器测定的范围内没有明显
的吸收峰 ,暗示分子的构象发生了相应的变化 ,无
明显的有序结构信息[ 11] .
图 9　GLP-A-2 的圆二色谱
Fig.9　CD Spectrum of GLP-A-2
247第 3期 陈石良等:灰树花胞外多糖的性质与结构
　　因多糖的 CD分析资料较少 ,对脲引起的 CD
变化与构象关系尚不能确切解析.但据作者推测 ,
可能是脲破坏了氢键 ,糖链的有序构象转变为无规
线团构象 ,因而使分子不富有圆二色谱结构信息.
因此 ,结合前面的刚果红实验结果 ,推知 GLP-A-2
在水溶液中为多股螺旋.
3　结　论
1)灰树花胞外多糖 GLP-A-2为白色粉末状均
一组分 ,不含蛋白质与核酸 , 易溶于水 , 比旋光度
[α] 12D =+177.5°(H2O , 0.1),其平均相对分子质量
为 6.2×104.
2)结构分析表明 GLP-A-2是一种由葡萄糖组
成的吡喃葡聚糖 ,分子主链是 β-(1※3)连接的葡萄
糖 ,支链为 β-(1※6)、α-(1※2)、α-(1※3)及 β-(1※
2)葡萄糖 ,分别连接在主链的 O-2 、O-3和 O-6上.
从近年来的一些文献报道看 ,凡具有抗肿瘤活性的
真菌多糖如小核菌多糖[ 12] 、多孔菌多糖[ 12] 、裂褶菌
多糖[ 13]和香菇多糖[ 14]均为有分支的 β-(1※3)葡聚
糖 ,而α-(1※3)葡聚糖没有抑瘤活性[ 12] .由此推断 ,
在多糖主链上占优势的 β-(1※3)键是 G LP-A-2 活
性的结构前提[ 12 ,15] .
3)刚果红实验和圆二色谱分析结果初步证明
GLP-A-2在溶液中存在螺旋构象 ,维持其有序构象
的力可能以氢键力为主.GLP-A-2分子的 β-螺旋构
象对于抗肿瘤活性起重要作用[ 15] .
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(责任编辑:杨 萌 ,朱 明)
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