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反相高效液相色谱法制备广金钱草黄酮对照品
王国光 , 　卢兖伟 , 　赵素容 , 　吴祖泽
(军事医学科学院放射医学研究所 ,北京 100850)
收稿日期:2005-04-12
作者简介:王国光(1969～ ),男 ,博士 ,江苏连云港人 ,研究方向:天然药物分离提纯。电话:010-66931425。
关键词:广金钱草;对照品;6-C-葡萄糖-8-C-木糖洋芹素
摘要:目的:建立广金钱草黄酮对照品 6-C-葡萄糖-8-C木糖洋芹素(vicenin-2)的反相高效液相色谱制备方法。方法:结
合萃取 、大孔树脂柱层析 、重结晶等方法 ,用反相高效液相色谱法对广金钱草的乙醇提取物进行分离纯化 , 以 HPLC对分
离产物进行纯度和含量测定。结果:从广金钱草中分离纯化出黄酮对照品 v icenin-2纯度可以达到 98. 5 以上。 结论:
该方法简单 、准确 、重现性好 , 产品纯度高 , 可作为中药药效物质基础研究中的对照品。
中图分类号:R284. 1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2006)10-1491-02
Prepartion of reference substance of flavono id in Desmod ium styrac ifolium by
RP-HPLC
WANG G uo-guang, 　LU Yan-wei, 　ZHAO Su-rong, 　WU Chu-tse
(Institute of Rad ia tionM ed icin e, Acad em y ofM i li tary M ed ica l Sciences, Beijing 100850 , Ch ina)
KEYWORDS:Desmod ium sty racifo lium;re ference substance;vicenin-2
ABSTRACT:AIM:To develop an RP-HPLC method fo r preparing the re ference substanc of v icenin-2 in Desmo-
dium styracifolium. METHODS:E thano l-extrac t o f desmod ium sty racifo lium w as isola ted and purified by RP-
HPLC combining so lven t ex traction w ith co lumn chromatog raphy and recrystalliztion. The purity and content of v ice-
nin-2 w ere identified by HPLC. RESULTS:The f lvono ids we re comp lete ly separated unde r this chrom atog raphic
condition. The purity o f the reference substancew as 99. 0 o r above. CONCLUSION:The method is simple, ac-
curate, be tter on repeatability, and effective to yie ld high-pu rity p roduc.t It can be used as re ference substance for
the research of he rbalmedicine.
　　随着中药研究和药效物质基础研究的不断深
入 ,对中药对照品的需求也日益增加 。因此 ,高纯度
的对照品的制备尤为重要 。
广金钱草为常用中药 ,具有清热除湿 、利尿通淋
之功效 [ 1] ,其有效部位黄酮类特质是天然植物中广
泛存在的一大类化合物[ 2-4] ,其中的黄酮品 vicenin-2
成分含量高 、稳定性好 ,可为广金钱草原药材的质量
提供依据 。目前 ,黄酮类化合物主要是从天然植物
广金钱草中分离提取。这类生物活性物质的分离纯
化 ,用柱层析分离过程复杂 ,耗时多 ,结果也不稳定 ,
且分离纯化的产物多为混合物 ,不宜用作总黄酮定
量分析的标准品。高效液相色谱法 (HPLC)是分离
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纯化较高纯度生物活性成分的理想方法。本文以广
金钱草 (Desmodium sty racifo lium)为材料 ,用反相高
效液相色谱法(HPLC)分离纯化广钱草中含量较高
的黄酮 ,并用高效液相色谱法鉴定该黄酮的纯度。
1　仪器与试剂
W ate rs液相色谱仪 (在线脱气 ), PREP-ODS
(250 mm ×20 mm , 10 μm)制备柱 (大连依利特公
司 );Ag ilent 1100 LC液相色谱仪(在线脱气 、自动进
样 、柱温箱 、UV检测器 ), K romasilC18(250mm ×4. 6
mm , 5μm)色谱柱 (迪马公司 ), XZ-7旋转蒸发器
(中科院生物物理所科龙仪器厂 )。
三氟乙酸 (色谱纯 ,美国 S igma公司 ),乙腈 ,甲
醇 (色谱纯 ,北京化学试剂公司 ),水为超纯水 ,大孔
树脂 (AB - 8, 南开大学 )广金钱草 (Desmod ium
styracifolium(O sbeck)Merr. )为豆科山蚂蝗属植物的
地上部分 ,由广州市药材公司提供。
2　方法与结果
2. 1　生药的提取与分离　取烘干至恒重的广金钱
草 500 g,将其粉碎 ,用 60 的乙醇溶液浸泡 ,使乙
醇溶液的液面高出金钱草 ,超声提取 ,分离提取液 ,
旋转蒸发器减压浓缩;广金钱草用同体积 80 的乙
醇溶液再超声重复提取两次 ,合并两次提取液 ,并浓
缩提取液。将浓缩液合并 。
2. 2　化合物的分离　将浓缩的粗品提取液上大孔
树脂柱进行柱层析 ,以 20 乙醇 、40 乙醇 、60 乙
醇 、80 乙醇 、90 乙醇进行梯度洗脱 ,分别收集洗
脱液 ,合并含黄酮化合物组分 。洗脱剂的更换根据
洗脱剂的黄酮含量 ,当含量较低时更换洗脱剂 ,洗脱
液以聚酰胺薄层层析法鉴别 ,氨水显色。将含有所
要黄酮的洗脱液合并 、浓缩 。
2. 3　RP-HPLC分离纯化黄酮对照品
图 1为大孔树脂柱分离液在分析柱的分离情
况 ,从图中可以看出经大孔树脂柱纯化 ,仍含有多个
峰 ,说明初次分离所得的成分不纯 ,需进一步纯化;
该方案分离度高 ,峰形比较好 ,黄酮标准品和其他成
分可以分开 。
　　色谱条件流动相:乙腈-甲醇-水 (0. 05 的三氟
乙酸)(1∶2∶7),脱气方法:超声脱气 20 m in,然后
以 50 mL /m in氦气在线脱气;检测波长:272 nm;柱
温:25℃;流速:6 mL /m in,进样量为 1. 5 mL。
从分离图中可以看出该方案分离度高 ,峰形比
较好 ,黄酮标准品和其他成分可以分开。收集黄酮
对照品 vicenin-2峰。
图 1　分离液 HPLC图谱
2. 4　结构确定
对照品 vicenin-2为黄色晶体 ,聚酰胺薄层层
析 ,氨熏后为黄色 ,三氯化铝喷雾显亮黄色 。 ESI-
MS(m /z)、1HNMR和 13CNMR数据与文献 [ 2]报道一
致。结构见图 2。
图 2　vicen in-2结构式
2. 5　对照品的纯度检测
薄层色谱初步鉴别 vicenin-2的纯度 ,经展开剂
展开 ,晾干 ,显色 ,结果表明供试品为一个斑点 ,供试
品纯度较高。
高效液相色谱法纯度检查 , K rom asil C18色谱柱
(250 mm ×4. 6mm , 5 μm);甲醇和 0. 5 磷酸溶液
(63. 5∶36. 5)为流动相;流速 1. 0 mL /m in;检测波
长 272 nm;柱温 25℃。在该色谱条件下 ,对照品 v i-
cenin-2的 HPLC见图 3,用高效液相色谱面积归一
化法计算对照品 v icen in-2的纯度为 98. 7 。流动
相中加入磷酸 ,可抑制黄酮的电离 ,改善分离效果 ,
防止拖尾 ,使峰形尖锐 、对称 。
改变流动相的组成 ,甲醇和 0. 5 磷酸溶液 (60
∶40;50∶50)分别检测 ,结果对照品为一个主峰 ,
改变流动相分析未出现异常峰。
图 3　v icen in-2的 HPLC图谱
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2. 6　对照品回收率　粗提液中对照品的浓度为
2183μg /g(干重)。分离纯化后获得的对照品浓度
为 2091μg /g(干重)。回收率为 95. 8 。一次进样
可获得 105μg对照品。
3　讨论
用上述制备方法对黄酮对照品 vicenin-2进行
提取 、分离 、纯化 ,产品纯度和含量均符合新药审批
办法规定对照品的要求。该制备方法操作简便 ,所
得产品纯度高 ,具有较高的使用价值 。
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RP-HPLC测定紫锥菊提取物中 2种咖啡酸衍生物的含量
徐　度 , 　唐宇伟 , 　朱　伟
(上海市中药研究所 ,上海 200127)
收稿日期:2006-07-23
作者简介:徐　度(1947～ ),男 ,工程师 ,研究方向:中药分析与新药开发 ,电话:021-58810853。
关键词:紫锥菊;HPLC;单咖啡酰酒石酸;菊苣酸
摘要:目的:建立 RP-HPLC测定紫锥菊提取物中 2种咖啡酸衍生物含量的方法 , 同时测定 5种样品。方法:采用 RP-
HPLC同时测定紫锥菊提取物中 2种主要咖啡酸衍生物:单咖啡酰酒石酸 、菊苣酸的含量。 色谱条件为 Ag ilen t ZORBAX
S tableBond C18柱(5 μm , 4. 6 mm ×250 mm);流动相:A(乙腈)— B(0. 1 磷酸溶液)梯度洗脱 , 流速:1. 2 mL /m in;检测波
长:330 nm。结果:2种主要咖啡酸衍生物在色谱条件下有良好的分离度 , 浓度与峰面积之间线性关系良好 , 线性范围:
单咖啡酰酒石酸在 0. 064 ～ 0. 416 μg,菊苣酸 0. 1 ～ 0. 7 μg。平均回收率:单咖啡酰酒石酸为 99. 37 , RSD 为 1. 50 ;菊
苣酸为 100. 44 , RSD为 1. 71 。结论:方法简便 、精确 、专属性强 ,可作为提取物和研发新药的质量控制。
中图分类号:R284. 1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2006)10-1493-04
Determ ination of 2 caffeic acid derivatives in Ech inacea extracts by RP-HPLC
XU Du, 　TANG Yu-wei, 　ZHUW ei
(Shangha i Institute of Ch in eseMa teria Medica, Shanghai200127 , Ch ina)
KEYWORDS:Echinacea purpurea root;HPLC;caftaric acid;ch icoric acid
ABSTRACT:AIM:To estah lish a RP-HPLC me thod of de term ining tw o caffeic ac id de rivatives in E chinacea ex-
tract and to de term ine 5 E chinacea purpurea roo t extrac ts. METHODS:RP-HPLC was applied to de term ine 2 caf-
feic acid de rivatives in E. purpurea ex tract:caftaric acid and chicoric acid. HPLC cond itions w ere as fo llow s:Ag i-
lent ZORBAX S tableBond C18 co lumn (5 μm , 4. 6 mm ×250 mm)was used , w ith A(ace tonitrile) —B(0. 1
H3 PO4) gradient elution as a mobile phase. The flow rate w as 1. 2 mL /m in. The detection w ave lenth w as set a t
330 nm. RESULTS:2 caffe ic acid de rivativesw ere separated w e l.l The linea r range fo r ca ftaric acid and ch ico ric
acid w ere 0. 064-0. 416 μg and 0. 1-0. 7 μg, respectively. Its ave rage recoveries we re 99. 37 w ith RSD o f
1. 50 and 100. 44 w ith RSD o f 1. 71 , respective ly. CONCLUSION:The me thod is simp le, accurate,
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