全 文 ：生物物理学报 第 n 卷 第 2 期
A C T A B IO P E压S IC A S P q C A V d .1 1
1望巧年 6 月
卜沁.2 J U几 1望)5
高粱根质膜 K 十 通道蛋白的溶解及重组 *
装真明 焦新之 汤章城 *
( 中国科学院上海植物生理研究所 上海 2仪” 32)
摘 要
用水两相法纯化的高粱根质膜嵌入平面脂双层膜 , 可以 测得离子通道电流 。 记录了典型 的单
离子通道 。 T ir to n X 一 10 使质膜蛋白溶解 , 除去不溶物后 , 加入 A m be ilr et X A D 一 2使膜蛋 白重组
为蛋白脂质体 。 将蛋白脂质体嵌入脂双层 , 测定 了脂双层上 K + 通道电流逐渐出现的过程 , 该典
型的通道电流记录的通道电导为 n ZP S 。 通过改变前后槽 K O 浓度 , 刚定蛋白脂质体嵌入脂双层
后的稳态电流一电压关系 , 近似计算稳态逆转 电位 , 由 G H K 等式得 K + 和 O 一 的 选择通透比
几 : oP 为 .8 6, 主要是通透 K 十 。
关键词 : 质膜 K 十 通道 重组 平 面脂双层
离子通道是一些跨越细胞膜的蛋 白 , 存在于各种膜系统的膜中 , 当通道开放时使离子沿
着其电化学梯度下降的方向跨膜流动 , 速率在 10 6一 10 , 个离子 / s , 这一流动 的离子产生可以
测量的电流 。 离子通道涉及植物生理的以下一些过程 : 矿物营养 、 细胞分室 、 动作 电位的产
生及复极化 、 细胞信号传递以及体积 、 膨压 、 渗透等的调节 l[] 。 因此只有 了解离子通道的生
物物理特性及在细胞内的调控才能深人了解这些生理过程 。
已经将植物细胞的液泡膜 、 线粒体膜 、 叶绿体外膜 、 类囊体膜等嵌人平面脂双层 lz3[ 。 但
是纯化质膜蛋白很困难 4[] , 尤其是纯化一些功能蛋 白 , 并有效地检测其活力的方法是很重要
的 。 K + 通道在植物质膜上普遍存在且和许多生理过程有关 l[] 。 本文试 图将纯化的高梁根质
蛋白溶解 , 然后除去大部分膜脂后重组 , 测定重组质膜嵌人脂双层后的 K + 通道 , 探讨分离
纯化质膜 K + 通道蛋白的可行途径 。 为进一步深人植物质膜 K + 通道及其功能的研究提供基
础 。
1 材料与方法
L l 材料及根质膜的提取和纯化
高粱 (S 。 gr h unL v ul g a er p e IS .) 晋杂 四号种子经 1% 新洁尔消毒 s n五n
, 冲洗后 25 “ C 浸
种 1h2 r , 选饱满种子播于金属网上 。 发芽后用 H oa gh dn 营养液于人工气候室 (温度 25 “ C,
相对湿度 70 % , 光强 360 户m o l m 一七一 ’ , 1h5 光照 /d) 培养 。 幼苗生长七天 , 取根为实验材料 。
提取和纯化参照 as n d iel us 和 M o能方法 阎 。
L Z A T P 酶测定
参照 O h n is h i 等 【句方法测定 A T P 酶活力 。 纯度检测主要是通过测定在不 同抑制剂存在时
. 国家自然科学基金重点资助项 目。 * * 联系人 。
第 2期 高梁根质膜 K 十 通道蛋白的溶解及重组
的 T AP 酶活力门 。 叠氮钠抑制线粒体 T P A酶活力; 钥酸盐抑制酸性磷酸酶 活力; 硝 酸盐抑
制液泡膜 T P A酶活力; 钒酸盐抑制质膜 T P A酶活力; 质膜 AT P 酶活力受 K 十 激 活 [J 8。 除了
不加 K + (一K + )的测定外 , 其它情况均加 K + 。 抑制剂浓度见表 1。
蛋 白测定参照 B a dl fo dr 法网 。
1 3 质膜蛋白的溶解和重组
1
.
3
.
1 质膜蛋 白溶解 。 将纯化质膜悬浮于含 2% (w v/ ) T ir t o n X 一 10 归 B )H , s n 刀刀oL l瓜
D T T
,
.0 25 伽 l瓜 蔗糖的蛋 白溶解液上 , 溶解液室温 ( 20 “ )C 下搅拌 h2 后 , 20 ,加 o x g 离心
3 5而 n 除去未被溶解 的质膜 , 上清液含溶解蛋 白1q[ 。
1
.
.3 2 功能性重组参照 o m e llus 方碧 , l] 。 在含有溶解膜蛋白的溶液中加人 A m be id et X A D 一 2
s(
lg r 坦 ) , 比例为 .0 69 湿重树脂阿 溶液 , 放置在 4 O C 冰箱中进行搅拌使其 重组 。 h2 后尼
纶网过滤 除去 A m be lr let x A D 一 2 , 15 0 ,的 Ox g 离心 3伍拍 n , 沉 淀 悬 浮 (5
~
l压 T isr 一M SE
p H .78
,
5
~
l压 D T T , .0 2 5mo l压 蔗糖 ) , 此为重组质膜 。 这种囊泡中嵌合有蛋白 , 也称蛋白
脂质体 ( p or eot il p o s o me )
。
1 .4 质膜嵌入脂双层及电学测 t
采用文献【12 』的方法 。 涂膜液含 25 gnr 大豆卵磷脂 (s l gr an ) , sgrn 胆 固醇 s( lg r 坦 ) /耐 正
一 唆烷 ( 日本进 口分装 ) 。
放大器为 M V C 一 2 细胞电压钳位仪 (中国科学 院上海生理研究所 , 略加改 动 ) 或单电
极电压钳位放大器 C E Z 一 31 0 ( 日本光电株式会社 ) 。 用记录仪 ( C H IN O 日本 ) 记录膜电流
和膜电压 , 同时在放大器数字显示器读膜电位 和膜 电流值 ( C zE 一 31 0 ) 。 前槽 电极 电位为
膜电位 , 后槽电极电位为参考电位 。 质膜 (含 5 一 20 雌 蛋 白 ) 加在后槽 , 搅拌儿分钟后膜电
导下降 , 说明质膜嵌人脂双层 。 停止搅拌后在 电压钳位状态下测量 。 膜电位 由放 弋器直接加
人 (图 l ) 。
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1 5 钾离子和抓离子的选择通透性
为了确定嵌人脂双层是那种类型 (阳离子 或阴离子 ) 的通道 , 改变前后槽 的 K C I浓度
比 , 通过测定稳态逆转电位的方法测定 了钾离子和 氯离子的通 透 比 。 质膜加人前槽 , 后槽
生 物 物 理 学 报 1卯 5年
K Q 浓 度 为 巧
~
l压 , 改 变 前 槽 K Q 浓 度 (巧
~
1瓜 , 5 0n l m 0 1瓜 , 100r 肚nO I压 和
2伽肋rI lo l压), 测定通道的稳态电压 一 电流关系 。 由 工 一 V 关系图近似得逆转膜 电位 (五侧 ) ,
根据 oG ld r 以 n 一 H o d g k in 一 aK tz (G H K )电压等式计算得离子通透率 。
2 结果与讨论
.2 1 质膜的纯化
由表 1知 , 质膜被纯化后钾激活 A l , P 酶的活力从 25 % 增加到 45 % , 钒酸钠抑制的 A T P
酶活力从 41 % 提高到 51 % , 这种酶活力 的变化说明质膜的纯度提高 , 另外三种抑制剂的抑
制百分 比明显下降 , 说明液泡膜 、 线粒体膜和内织 网膜的污染降低 。
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.2 2 纯化质膜微囊嵌入脂双层及其离子通道记录
两电极槽溶液均为 1X() 11m lo l瓜 K C I, 将 5川 (含 5雌 膜蛋 白 ) 纯化质膜加人后槽 , 搅拌
几分钟或更长的时间 , 在一负膜电位 (一般用 一 5伽叭V) 可以检测到膜 电流 的变化 。 图 2 显示
在膜电位 (伽卫V 、 一 30m V 和 一 4伽m V) 时的膜电流特征 , 这时有多个通道存在 , 双箭 头表示
通道的开放状态 (o p en )和关闭 (clo se )电流方向 。 实验中 , 当可以记录到通道完全关闭状态
时 , 能从电流记录中直接得到膜电流 , 如 伽m v 时通道 电流为 Op A , 一 3伽m V 和 一 4伽m V 时通
道电流分别为 1 . 4 p A 和 7 . 7P A 。
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在大多数情况下 , 质膜嵌人脂双层后只有一个通道开放的例子较少 , 一般有多个离子通
道 同时或交替开放 。 图 3 为多个离子通道同时或交替开放的电流记录 。 每一个通道开放测得
的电流是大体相等的 , 即图中一个 “ 台阶 ” 。 “ O ” 代表开放 , 从图 3 中可以 自到最多 8 个正
在开关的通道的电流 . 少数情况可以记录到单通道 , 图 4 为典型的单通道记录 。
第2 期 高梁根质膜 K十 通道蛋白的溶解及重组
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质膜嵌人脂双层后 , 可测到的单通 道 的 电
导变化较大 , 和 刃ug ha
~
等阎将液泡膜嵌人
脂双层得到 的结果相似 , 在 液泡膜中单通道 电
导在几 p s 到 19 4 p s 之间变化 , 虽然也对这些 变
化的电导进行归类 , 但是人 为性很大 。 本实验
没有得到足 够多的数据用于对单通道 的单位 电
导 统计分析 。 嵌人脂双层后通道 的多样性可 能
由于 : ( l) 质膜上本来通道种类很多 ; (2) 由于
经过质膜的分离纯化 , 通 道 的一些 组份 缺失 ;
此 加】d」n g po et n t词 毗 c ha gD冈 ot n o , 卯,印 , 40 , 20, 0, 一 20 , 一 40, 一 印, 一 so 山记
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co dl 司 s谊间 at n co 出 ly . o , o户泊 , C , c l`理 .
( 3) 嵌人脂双层后改变 了通道蛋 白和其周脂 的关 系等 。
质膜嵌入脂双层时 , 以下几种条件有利于质膜的嵌人 : (l )存在 电极槽 之间的渗透 势
差 , 加人质膜一侧的盐浓度应 比另外一侧高 ; ( 2) 电极槽之间的电位差 , 加人质膜 一侧的电
位高 ; ( 3) 搅拌 , 在加人质膜的电极槽中搅拌 , 一般搅拌较剧烈时嵌人质膜较快 (过分剧烈
的搅拌常使脂双层膜发生破裂 ) , 搅拌停止质膜嵌人脂双层也基本停止 , 所以电测定应在停
止搅拌时进行 , 一方面减少因搅拌引起的测量噪声 , 另一方面避免质膜继续嵌 人脂双层使
系统变得不稳定 ; ( 4) 涂膜液的组份 。
.2 3 质膜通道蛋 白溶解及重组
按方法中所述 , 将质膜蛋白溶解并重组 , 通过测定 A T p 酶活力的恢复证明质膜的功能
恢复 。 表 2 表 明重组的质膜 A J P 酶活力恢复很好 , 95 % 活力恢复 , 钒酸盐的抑制 能力恢复
略差 , 为 86 % , 这种质膜 A T P 酶的专一性抑制剂抑制能力的下降可能是 由于溶解膜蛋白改
变了蛋白和脂的关系 , 也可能失活的 A T P 酶中质膜 A T P 酶 的比例较大 , 钒酸盐抑制 能力的
下降说明质膜的特性可能比纯化膜的特性差 。 在从溶解到重组过程中 A T P ase 总活力 减少了
7 1%
。
.2 4 重组质膜嵌入脂双层离子通道电流逐渐出现过程的记录
后 槽 加 10 im l lO IL/ T irS 一M ES P H 7 . 4 , 5 0I n m 0 1L/ K C I , lmorn
lL/ aC Q
Z , 前 槽 加
1伽nr m o l瓜 T isr 一 M ES p H .7 4 , 15 ~
l压 K Q , 钳位 电压 一 5伽m v 。 将重组质膜 (含 20 咫 蛋
生 物 物 理 学 报 19 5 年
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白 ) 加于前槽 , 搅拌几分钟后 , 有时可能时间较长 , 膜 电流开始增加 (图 S)A 。 图 5 中电
流 向上为通道开放 , 电流 向下为通道 关闭 。 从通道 电流开始增加到通道 电流 基本稳定要
1 5n卫 n 左右 。 重组质膜嵌人脂双层后通过 电流是 “ 量子化 ” 或者称 “台 阶式 ” 增加或减小 ,
此时单通道电流为 .5 6P A 。 电流每增加一个 “ 台阶 ” 说明有一个通道嵌人并开放 , 严格地说
可以维持一个单位电导的通道开放 , 因为可能是多个通道交替开放 。 从图 5 中可以看出 , 开
始时开放通道的数量较少 , 开放和关闭交替的频率也较低 , 之后 随着 开放 通道数量的增加 ,
开放和关闭交替的频率也增加 , 说明通道 电流是多个通道的累积作用 , 到平衡态时 ( 图 SA
顶部 ) , 脂双层上的通道在 1一 3 个单通道 电流范围内变化且开放和关闭交替的频率为最大 。
从膜电位 伪mV 到 一 5伪m V 计算 , 单通道 电导为 1 12P S 。
为检验重组质膜活力 , 研究 了经过失活处理的重组质膜是否仍然有这种形成电流梯式增
加的特性 。 将 自重组质膜在沸水浴中 5~ 使蛋 白变性
, 将这种失活质膜加人 电极槽并搅拌
后没有检测到 电流增加 , 即在脂双层上没有通道形成 (图 S)B 。 说明电流的增加是 由活力的
重组质膜 (图 S )A 引起 。
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将质膜蛋 白溶解 、 重组是分离纯化质膜
通道蛋 白的必要步骤 。 将溶解的膜蛋 白嵌人
脂双层时 , 去垢剂容 易使脂双层膜破坏 , 所
以必须除去去垢剂 , 此外 , 重组的膜微囊较
容易嵌人脂双层 。 在动物中已经用这种方法
纯化 了通道蛋 白 。 但是尽管在植物离子通道
研究中已经克隆了 K + 通道基因阅 , 可到 目前
为止没有纯化一种通道蛋白 。 纯化通道蛋白
时 , 首先是通道蛋 白活力的检测 , 这类蛋白
不能催化某一可用化学方法检测的反应 , 它
的典型特征是催化离子过膜 , 因此必须检测
这一过程 。 用同位素离子在重组微囊上作离
子传递实验需要的蛋 白量多 , 而通道蛋白量
很少 ; 同膜片钳方法检测时必须制备直径较大的微囊 , 而且难度大于平面脂双层检测 。 因此
从这方面说 , 平面脂双层加电测量可能是检测通道蛋 白活力的最有效 的方法 。
第 2 期 高梁根质膜 K 十 通道蛋白的溶解 及重组
2 5 重组质膜离子通道的 K, 0 选择通透性
前槽 K C I浓度为 15
om
l瓜 时分别在 一 lX() , 一 5 0 , 0 , 5 0 , 10 0 和 15伽m V 测定膜 电流 。 加
人高浓度的 K Q 使前槽 K C I浓度分别增至 50m m o l瓜 ,
测定以上膜电位时的膜电流 . 图 6是重组质膜离
子通道的 电压 一 电流关系 图 。 图中表 明随着前
槽 K C I 的浓度 的增加 , 膜电流 一 电压关系也 改
l以nI u n o lL/ 和 Zo o n 皿n 0 1L/ , 然后分别
变 , 且前槽浓度越高 , 在 Vm 二伽m V 时电流也越
大 。 前后槽 K C I浓度相等 (巧
~
l向 时 , 逆转
电位蛛二 伽皿 V ; 当前槽 K Q 浓度大 于 15~ l压时 , 随着浓度增加 , 逆转 电位偏向负电位 。 前
槽 K C I浓度 为 20() mm 0 1压 时 , 蛛 = 一 4 2m V 代
人 G K H 等式得 八 :凡二 8 . 6 , 可知这种通 道主 要
是 通 透 K + 。 这 种 K 十 通 道 可 能 类 似 于
G as ma mT 等 在 根 毛 细 胞 质 膜 上 发 现
的K + 通道 [ , 3] 。
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172 生 物 物 理 学 报 1卯5 年
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本文于 1望科年 10 月 14 日收到 .