全 文 ：　葛枣猕猴桃总酚含量与 PPO活性研究
秦小波1 , 2
(1.四川省自然资源科学研究院 , 四川 成都 610015;2.四川省生物资源保护与可持续利用实验室 , 四川 成都 610015)
摘　要:采用葛枣猕猴桃嫩枝和叶柄为供试材料 , 分析总酚含量和多酚氧化酶 (PPO)活性及其变化规律。研究结果显示 , 葛枣猕猴桃
PPO活性的最适 pH 值为 7.0;最佳底物为邻苯二酚 , 且浓度为 0.18mol·L-1;最佳温度为 25℃。葛枣猕猴桃 PPO活性在花果期明显高于
花前期 , 葛枣猕猴桃总酚含量在每年的 4月 、 5月 、 9月 3个时段最低。
关键词:葛枣猕猴桃;多酚氧化酶活性;总酚含量
　　中图分类号:TS2 文献标识码:A
　　猕猴桃 (Actinidia)是重要的经济植物 , 中国是其起源和
分布中心 , 种质资源极为丰富[ 1] 。同时 , 猕猴桃也是 20 世纪
野生果树人工驯化栽培最有成就的 4大果种之一[ 2] 。由于其风
味独特 , 各种营养丰富 , 维生素 C含量高 , 经济 、 营养价值高
和医疗效果显著而倍受关注。猕猴桃作为中华的一种传统植
物 , 其全株均可入药 , 中医认为其果能调理中气 、 通淋 、 解热
除烦 、 生津润燥 , 味酸 、 甘 、 性寒 , 在治疗食欲不振 、 消化不
良 、 呕吐 、 烧烫伤上均有疗效 , 其根能活血消肿 、 祛风利 、 湿
清热解毒 , 味苦 、 涩 , 性寒 , 在治疗风湿性关节炎 、 水肿 、 跌
打损伤 、 痢疾等疗效不错[ 3] 。葛枣猕猴桃 (A.polygama)是猕
猴桃中很有特色的一种小果型猕猴桃 , 具有很好的开发价值。
分布于海拔 1 000～ 2 800m 的范围 , 落叶木质藤本果树。二年
生枝深褐色 , 光滑无毛 , 细硬 , 皮孔密 、 小 , 圆形 , 灰白色。
髓实心 , 白色。一年生枝细 , 硬 , 褐色 , 光滑无毛 , 皮孔较
密 , 圆形 , 呈白色。节间长 2.4 ～ 4.6cm。叶薄纸质 , 近圆形 ,
长约7.1～ 10.7cm , 宽 4.6 ～ 8.9cm , 基部平截 、 对称 , 先端渐
尖 , 尾尖短 , 叶面绿色 , 无毛 , 主 、 侧脉不明显 , 无毛 , 叶缘
锯齿小 , 刺状 , 浅红色 , 叶背绿色无毛。叶柄长 2.5 ～ 3.3cm ,
呈绿色。果实近长扁椭圆形 , 单果重约 9g , 果皮绿色 , 被白
粉 , 光滑无毛 , 果顶钝尖圆 , 具喙 , 较长 , 果肉黄色 , 多汁 ,
果熟期在当地 9月中下旬至 10 月初。
葛枣猕猴桃是研究猕猴桃属系统遗传发育必不可少的一种
珍贵材料。该种群分布范围相对较窄 , 且现存的野生植株数量
不多 , 野生资源在野外很难发现 , 偶尔能发现几株或十数株。
因此 , 葛枣猕猴桃需要着重加强保护。而进行人工无性繁殖是
扩大其种群数量 、 加强保护的唯一途径。其中 , 总酚含量及多
酚氧化酶 (PPO)活性等指标与植物生长时期密切相关[ 4 ,5] ,
也是无性繁殖材料中影响成活的关键。通过葛枣猕猴桃总酚含
量和多酚氧化酶活性及其变化规律的研究 , 可以更有效率地指
导无性繁殖的取材 , 提高繁殖成活率 , 扩大种群数量 , 保护该
种群。
1　材料与方法
1.1　材料
取葛枣猕猴桃叶柄和嫩枝条作为实验供试材料 , 测定正常
葛枣猕猴桃植株在一年内各月的总酚含量与多酚氧化酶活性动
态变化情况。
1.2　葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性测定
1.2.1　酶液制备
取葛枣猕猴桃嫩茎段总质量剪碎 2.0g , 加入少许石英砂以
及 PVP粉 0.02g , 再吸取 10mL磷酸缓冲液 (0.1mol·L-1pH7.0)
加入并置于冰浴中混匀 , 然后以10 000rpm 离心 20分钟。取上
层上清液转入到标准容积为 25mL容量瓶 , 下层的沉淀再以磷
酸缓冲液 5mL重新提取 1 次 , 最后将沉淀中提取的上清液也并
入容量瓶中 , 并定容容量瓶备用。
1.2.2　酶活力计算与酶活性测定
酶活力是以每克新鲜样品 、 每分钟的光密度即相应的光吸
收值的每增加0.01 为 1个酶活性单位 U。从瓶中制备的酶液中
取 0.2mL加入试管中 , 再加入 0.1mol·L-1pH7.0 磷酸缓冲液
3mL并缓慢摇匀 , 置于恒温水浴锅中 , 25℃水浴 10min。然后
加入 0.5mL邻苯二酚 (0.1mol·L-1), 立即通过分光光度计测
定 470nm 波长下的 OD 值 , 并用磷酸缓冲液 (0.1mol·L-1 ,
pH7.0)作为空白对照 , 记录读数 , 30秒/共记录 5次。酶活力
计算公式为:U=ΔOD/0.01×t×W 其中 , W 为供试样品的鲜
重。
1.2.3　筛选最适测定条件
1.2.3.1　葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与 pH 值
分别设置缓冲液的不同 pH 值 5.0 , 6.0 , 7.0 , 8.0 , 并用
于提取葛枣猕猴桃多酚氧化酶 , 并利用邻苯二酚 (0.1mol·
L-1)测定其活性。酶活力作为纵坐标 , 提取缓冲液的 pH 值
作为横坐标 , 观察并确定其最适 pH 值 , 利用测定值形成酶活
力与 pH 曲线。
1.2.3.2　不同底物及浓度对的影响
根据生物酶活性测定体系 , 通过实验设计并配制浓度梯度
为 0.02mol·L-1 , 0.06mol·L-1 , 0.12mol·L-1 , 0.18mol· L-1 ,
0.20mol·L-1 , 0.24mol·L-1的邻苯二酚溶液以及阿魏酸溶液 、
肉桂酸溶液 , 测定葛枣猕猴桃多酚氧化酶在不同浓度及底物下
的活性情况 , 观察并发现其最佳底物与浓度。
1.2.3.3　葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与不同温度的变化关系
将葛枣猕猴桃多酚氧化酶 (PPO)置于不同温度梯度的酶
活反应体系 15℃、 25℃、 35℃、 45℃、 55℃、 65℃、 75℃, 保
葛枣猕猴桃总酚含量与 PPO 活性研究　秦小波
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持恒温环境 , 反应 10min。然后测定 PPO 在不同温度体系中其
活性的具体情况 , 观察并筛选出 PPO相对的最适反应温度。
1.3　葛枣猕猴桃总酚含量测定
1.3.1　Folin酚试剂配制
取一个磨口回流装置且容积为 1 000mL , 加入钼酸钠
12.5g , 钨酸钠 50g , 蒸馏水 350mL , 37%的浓盐酸 50mL , 85%
的浓磷酸 25mL, 充分溶解并在混匀器上完全混匀 , 然后回流
10h。再加入 87.3g Li2SO4·H2O (水合硫酸锂), 25mL蒸馏水 , 2
滴溴水。取下磨口回流装置的瓶盖 , 15min 持续沸腾 , 完全挥
发加入的溴水 , 达到此目的为止 , 再静置冷却并得到呈现黄色
的溶液。进行稀释该溶液至 500mL并过滤 , 备一个保存用棕色
试剂瓶将滤液移于其中保存。使用溶液时 , 以酚酞作指示剂 ,
先用标准NaOH 溶液滴定 , 观察溶液颜色变化 , 发现颜色由红
过度到紫红 , 接着转变为紫灰 , 再突然很快换成墨绿时为终
点 , 然后约加入 1 倍体积的水进行稀释 , 即可作为应用液使
用。
1.3.2　标准曲线的制作
取100mL70%的丙酮 , 用分析天平称取 20mg , 溶于其中。
邻苯二酚对照品溶液的制备 , 在配制的 0.2mol·L-1的邻苯二酚
溶液中移取 2mL , 并加入蒸馏水稀释至 4mL即可。分别移取
0.05mL、 0.10mL、 0.15mL、 0.20mL、 0.25mL、 0.30mL、 0.35mL
的邻苯二酚对照品溶液于准备好的 7根带刻度的试管中 , 并用
70%的丙酮补足至 1mL;另外空白对照直接将 1mL的 70%的丙
酮加入额外的 1 根试管中。此时 , 加上对照 , 共有 8 根试管。
分别加入 5mLFolin 试剂于这 8 根试管中 , 缓慢混匀并静置
3min , 然后再加入 2mL 20%的 Na2CO3 溶液 , 缓慢混匀并静置
1h , 最后用蒸馏水定容至 25mL, 利用分光光度计在 760nm 波
长处测量吸光值。以光吸收值为纵坐标 , 邻苯二酚含量为横坐
标 , 绘制标准的曲线。以邻苯二酚的含量表示样品中总酚物质
的含量 , 线性回归方程为:Y=0.0816X+0.0094 , R2=0.9994 ,
邻苯二酚浓度在 0.600 ～ 4.500μg·mL-1范围内与吸光值有良好
的线性关系。
1.3.3　葛枣猕猴桃样液的准备
取葛枣猕猴桃茎段的嫩枝 , 自然晾干并用粉碎机粉碎 , 用
2mm 的筛子过滤。然后称取 5g 粉末作为样品 , 移入带塞的锥
形瓶中 , 并加入 70%的丙酮 100mL, 置于水浴锅中恒温水浴
80℃加热 3h , 冷却后再过滤 , 收集滤液并定容至 100mL。
1.3.4　葛枣猕猴桃样液的测定
准备一容积为 25mL的容量瓶 , 取上一步中制备好的样液
1mL移入其中 , 并用70%的丙酮定容。再向备用的带刻度的试
管中加入 1mL吸取于容量瓶中的样液 , 接着加入 5mL Folin 试
剂 , 缓慢混匀并静置 3min。然后加入 5mL的 10%的 Na2CO3 溶
液 , 混匀 , 避光静置 1h , 在加入蒸馏水定容至 25mL;空白对
照将1mL70%的丙酮加入另 1根备用试管中即可 , 用分光光度
计测定 760nm 波长下光吸光值的情况。
1.3.5　结果与计算
1g 样品中总酚含量(%)=(a×v1×v3)/(v2×w)×10-6×
100 ,式中:v1为样品粉末定容后的容积 (mL), v3 为将 v2 滤液
定容后的容积 (mL), v2为测定时量取的滤液容积 (mL), a为
样液中总酚的含量 (μg·mL-1), w 为称样质量 (g)。
2　结果与分析
2.1　多酚氧化酶活性与 pH值之间的变化关系
不同的 pH 值下 , 葛枣猕猴桃多酚氧化酶的活性也不同
(图 1)。当 pH 值为 7.0 时 , 酶活力单位最大;当 pH 值为 5.0
时 , 多酚氧化酶活性最小 , 随着 pH 值的增大 , 活性也增加;
但当 pH 值为 8.0 时 , 酶活力又降低。在设计的 pH 值梯度中 ,
实验结果表明 , 当磷酸缓冲液 pH 值为 7.0 时葛枣猕猴桃的多
酚氧化酶活性最大。因此 , 可将 pH 值 7.0 作为葛枣猕猴桃多
酚氧化酶活性的最适 pH 值。
图 1　pH 值对葛枣猕猴桃 PPO活性的影响
2.2　葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与不同底物及浓度的关系
筛选实验设计的阿魏酸 、 邻苯二酚和肉桂酸作底物比较实
验显示 , 以邻苯二酚作为底物 , 葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性最
高。然后以邻苯二酚作实验最适底物 , 并设计邻苯二酚浓度梯
度进行进一步实验分析。 结果显示 , 实验中筛选得到的
0.18mol·L-1的邻苯二酚为最佳底物。 而整个结果分析表明 ,
首先随着邻苯二酚浓度升高 , 葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性也增
加 , 但当浓度超过 0.18mol·L-1时 , 多酚氧化酶活性又开始降
低 (图 2)。
图 2　不同底物及浓度对葛枣猕猴桃 PPO活性的影响
2.3　葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性与反应体系温度的关系
依据酶活性反应温度范围 , 设置了15 ～ 75℃温度区间的反
应体系温度实验测试。实验表明 , 温度在 25℃时葛枣猕猴桃
多酚氧化酶活性最大 , 温度超过 25℃时多酚氧化酶活性开始
农业与技术　第 32卷　第 9期　2012年 9月
20　 AGRICULTURE AND LTECHNOLOGY
逐渐降低 , 当温度达到 75℃时 , 多酚氧化酶基本丧失活性
(图 3)。因此 , 25℃是葛枣猕猴桃多酚氧化酶在实验中的最适
温度。
图 3　温度对葛枣猕猴桃 PPO 活性的影响
2.4　葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性和总酚含量的动态变化
2.4.1　多酚氧化酶活性月动态变化
取各个月份的葛枣猕猴桃新鲜材料进行多酚氧化酶活性测
定 , 从而分析其活性随时间的变化情况。分析结果显示 , 酶活
性较高的是 9 月 、 8 月 、 7 月和 4 月 , 其中 9 月多酚氧化酶活
性最高;12 月酶活性最低 , 其次为 10 月 、 2 月和 1 月。 6 ～ 9
月 , 2 ～ 4 月酶活性逐渐升高 , 可能原因是植物处于生长季节 ,
体内的多酚氧化酶表现的较为活跃 , 活性显著高于休眠季节;
12 月 、 1 月和 2 月是冬季时节 , 酶活性较低 , 植物生长缓慢 ,
变化不明显。
图 5　葛枣猕猴桃 PPO 活性月动态变化
2.4.2　葛枣猕猴桃总酚含量月动态变化
通过 Folin 酚试剂法 , 取各个月份的葛枣猕猴桃试材进行
总酚含量测定 , 分析其总酚随时间的变化情况。不同月份葛枣
猕猴桃茎段 1g干样品总酚含量的变化曲线是根据标准曲线及
总酚含量计算公式计算形成的 , 见图 5。分析显示 , 总酚含量
最低的是 4 月 , 其次为 3 月和 9 月;含量最高的月份为 6 月 ,
其次为 1月 、 7月 、 8 月和 11 月。 4 月和 9 月分别为春初生长
和秋末减缓的季节 , 而已步入休眠期的 11 月 、 12 月和 1 月及
生长旺盛的 6～ 8月总酚含量较高 , 说明葛枣猕猴桃生长中的
物候期与总酚含量有较为密切的关系。
图 5　葛枣猕猴桃总酚含量月动态变化
3　结论与讨论
磷酸缓冲液 pH 值对葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性具有明显
影响 , 当 pH 值为 7时 , 多酚氧化酶活性最高;而在酸性条件
下 , 随 pH 值升高 , 多酚氧化酶活性显著增强 , 当 pH 值超过 7
为碱性 , 随 pH 值增大 , 多酚氧化酶活性开始下降 , 最后认为
在测定葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性的最适 pH 值为 7.0。其次 ,
邻苯二酚是对葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性最好的反应底物 , 但
其浓度对活性有显著影响 , 其中邻苯二酚浓度在 0.18mol·L-1
时多酚氧化酶活性能得到最佳体现。再次 , 在测试的 15～ 75℃
温度梯度范围内 , 尤其以反应体系温度为 25℃时 , 葛枣猕猴
桃多酚氧化酶活性最高 , 在高于 25℃的温度梯度上 , 其多酚
氧化酶活性逐渐降低 , 当反应体系温度为 75℃时 , 其活性基
本失活;因此 , 在实验范围内 , 葛枣猕猴桃多酚氧化酶的最适
温度是 25℃。最后 , 葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性 , 在生长期
明显高于休眠期。葛枣猕猴桃枝条体内总酚含量在每年的 9
月 、 5 月 、 4 月 3个时段最低 , 为无性繁殖取材最佳时间。
总之 , 葛枣猕猴桃多酚氧化酶活性及性质与其他植物较为
接近 , 属于正常情况 , 但酶活性在时间上变化较为滞后 , 从而
导致葛枣猕猴桃在开花及果实发育与成熟等阶段相对于其他商
品猕猴桃品种较为延后。因此 , 本研究对以后葛枣猕猴桃的研
究及培育有重要的指导意义。
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