全 文 ：　第 24 卷第 4 期
2005年 7月 　 　 　　　　 　
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Journal of Food Science and Biotechnology
　 　 　　　　Vo l. 24　No . 4
Jul. 　2005
　文章编号:1673-1689(2005)04-0026-05
　　收稿日期:2005-01-21;　修回日期:2005-03-18.
　　基金项目:教育部高等学校科技创新工程重大项目(130105)资助课题.
作者简介:陈向东(1969-), 女 ,江苏靖江人 , 副教授 ,微生物与生化药学博士研究生;*通讯作者.
灰树花多酚的提取和活性研究
陈向东 , 　刘晓雯 , 　吴梧桐*
(中国药科大学 生命科学与技术学院 ,江苏 南京 210009)
摘　要:从灰树花菌丝体中提取多酚类物质 ,并研究其性质和活性.采用弱极性的大孔吸附树脂从
灰树花菌丝体粗提物中吸附多酚类物质 ,吸附量大 ,解吸容易 ,获得褐色粉末状产物 ,应用红外 、紫
外扫描和鉴别试验证明其主要为多酚类物质 ,用 F-D法以间苯三酚为标准测得酚类物质质量分数
为 9. 3%.平板系列稀释法测定体外抗菌活性 ,灰树花多酚对金黄色葡萄球菌等具一定的抑制作
用. 红细胞氧化溶血和 MDA 试验测定其抗氧化活性 ,实验显示:对于红细胞的自氧化和H 2O 2所致
的氧化均具有一定的抑制活性 ,可显著抑制小鼠肝匀浆自发生成 MDA. 碘呈色法和 DNS 比色法
试验结果显示灰树花多酚可抑制α-淀粉酶活性 ,减少酶对淀粉的水解. 树脂法适合从灰树花菌丝
体中提取多酚类物质 ,灰树花多酚具有抗氧化 、抗菌及抑制α-淀粉酶等活性.
关键词:灰树花菌丝体;多酚;大孔树脂;活性
中图分类号:S 567. 3 文献标识码:A
Extraction and Activities of Polyphenol from Gri f ola f rondosa Mycelium
CHEN Xiang-dong , 　LIU Xiao-wen , 　WU Wu-tong*
(The School of Life Science and Technolog y , China Pha rmaceutical Unive rsity , Nanjing 210009 , China)
Abstract:GF polypheno l w as ext racted from Gri f ola f rondosa mycelium and i ts pharmacological
functions w ere determined in this paper. Brow n powder w as ext racted using low-polar
macropo rous adsorption resin and i ts main ingredient w as identified as po lypheno l , by ult ravio le t ,
IR spect romete r and phenol identify test. GF polyphenol show ed inhibito ry activities to bacteria
such as S . aureus in vit ro using plates serial dilution me thod. Hemolysis of red blood cell
ox idation and lipid pe ro cidat ion o f mice liver homogenate methods w ere used to de termine its
antioxidation activities. GF po lypheno l inhibited oxidation of red blood cell and MDA production
of mice liver homogenate. GF polyphenol reduced hydro lysis o f starch by alpha amylase using I2
and DNS method. It i s suitable to use resin to ex tract GF polyphenol. GF polypheno l show ed
antioxidation , antibacte ria and alpha-amy lase inhibi tion activi ties.
Key words:Gri f ola f rondosa mycelium ;polypheno l;resin;act ivities
　　灰树花是一种药 、食兼用的珍稀真菌 ,具有广
泛的药理活性[ 1] ,如抗肿瘤[ 2] , 抗糖尿病[ 3] , 抗氧
化[ 4] ,以及抗辐射[ 5] ,调节免疫功能[ 6] 及抗菌[ 7] 等.
灰树花发酵菌丝体粗提物呈黄褐色 ,含有大量有色
物质 ,作者应用大孔树脂从灰树花菌丝体粗提物中
提取分离有色部分 ,经鉴别为多酚类物质 ,并对活
性进行了初步研究.
1　材料与方法
1. 1　实验材料
灰树花菌丝体粗提物 ,山东京博生物科技公司
提供;大孔树脂:天津南开大学化工厂产品;α-淀粉
酶:50 u /mg , 中国医药集团上海化学试剂公司产
品;MDA 试剂盒 ,南京建成生物工程公司产品;其
余试剂均为国产分析纯.
金黄色葡萄球菌 、大肠杆菌等临床分离株:中
国药科大学微生物学教研室保存.
1. 2　灰树花多酚的提取分离
1. 2. 1　热水提取 　灰树花菌丝体粗提物粉末 , 10
倍质量的热水浸提 ,离心取上清即水提液.
1. 2. 2　树脂的预处理　新树脂以体积分数为 95%
的乙醇及稀酸 、稀碱等处理 ,水洗至中性 ,离子交换
树脂转为 Cl型备用.
1. 2. 3　静态吸附与洗脱实验　量取一定体积已处
理的树脂 ,精确加入适当稀释的水提液 , 25 ℃摇床
震荡 24 h后 ,滤出液体 ,树脂再加入一定体积的体
积分数为 95%乙醇 ,于 25℃震荡解吸.分别测定树
脂吸附前后和乙醇解吸后的水提液 280 nm 的吸收
值 ,按下式计算吸附率 Q 及解吸率 R . Q =(A0 -
AS) /A0 ×100%, R =A j /A0 ×100%. 其中 , A0为吸
附前初始吸收值 , AS 为吸附后吸收值 , A j 为解吸后
吸收值.
1. 2. 4　吸附动力学实验　根据树脂的静态吸附量
对时间作出吸附动力学曲线 ,分析树脂的吸附特性
及吸附速率.
1. 2. 5　灰树花多酚的分离　乙醇解吸液旋转蒸发
浓缩至干 ,加水溶解 ,用乙酸乙酯萃取 ,萃取液旋转
蒸发挥去乙酸乙酯 ,得到固体提取物 ,作为理化性
质和活性研究的样品.回收乙醇和乙酸乙酯.
1. 3　灰树花多酚的理化性质测定
1. 3. 1　紫外扫描　样品 0. 2 mg /mL 水溶液在 200
～ 400 nm 进行紫外扫描.
1. 3. 2　红外扫描 　样品 2 mg 以溴化钾压片 , 于
4000 ～ 400 cm-1进行扫描.
1. 3. 3　鉴别试验　样品分别用茚三酮 、三氯化铁 、
溴水 、明胶和香草醛-盐酸等试剂进行鉴别反应.
1. 4　酚类定量测定
将间苯三酚配成标准溶液(125 μg /mL).取 0.
00 、0. 05 、0. 15 、0. 25 、0. 35 、0. 45 mL 置于 15 mL 试
管中 ,加水稀释至 7 mL , 混合均匀 ,加入 0. 5 mL
Fo lin-Denis试剂摇匀 , 3 min 后加入 2 mL 饱和碳
酸钠溶液定容至 10 mL , 混合充分. 测定波长
680 nm处的吸光值. 灰树花样品的测定操作同标准
曲线[ 8] .
1. 5　体外抗菌活性试验
1. 5. 1　平板打孔法　将培养好的试验菌用无菌水
稀释至所需浓度 ,加入恒温于 55 ℃左右的灭菌培
养基 ,制成含菌平板. 打孔 ,注入不同浓度的灰树花
样品溶液 ,37 ℃培养 24 h.
1. 5. 2　平板倍比稀释法　吸取适量不同浓度的灰
树花样品溶液置无菌平皿中 ,加入恒温于 55 ℃左
右的灭菌培养基 ,混合铺平板. 将培养好的试验菌
适当稀释 ,用多点接种仪接至各平板 , 37 ℃培养 24
h观察记录 MIC值[ 9] .
1. 6　抗氧化活性试验
1. 6. 1　对红细胞自氧化溶血的影响　红细胞取自
小鼠眼眶静脉丛 ,用生理盐水洗 3次 ,然后配成 1%
红细胞悬液.取红细胞悬液 1 mL ,加入含不同质量
浓度样品的生理盐水溶液 20 μL (终质量浓度分别
为 0. 075 ,0. 15 , 0. 30 , 0. 60 mg /mL),以不加药组为
对照组 ,加入生理盐水 20 μL.以维生素 C 为阳性对
照 ,终质量浓度为 0. 1 mg /mL. 37 ℃温育 24 h 后 ,
2500 r /min离心 10 min , 540 nm 处测定吸光度. 以
对照组为 100%溶血 ,计算溶血度.
1. 6. 2　对 H 2O2所致红细胞氧化溶血的影响　取
上述红细胞悬液 1 mL ,加入不同质量浓度样品 (终
质量浓度分别为 0. 075 ,0. 15 , 0. 30 , 0. 60 mg /mL)
及 H 2O 2(体积分数为 1%). 以维生素 C 为阳性对
照 ,终质量浓度为 0. 1 mg /mL. 37 ℃温育 1 h 后 ,
2500 r /min离心 10 min , 415 nm 处测定吸光度. 以
H 2O 2 +红细胞为对照组 ,同时设正常红细胞组.
1. 6. 3　对小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响　迅速取
小鼠肝置于 4 ℃生理盐水中 ,洗去表面残血 ,制成
5%的肝匀浆. 取肝匀浆 0. 5 mL ,加入灰树花多酚
0. 5 mL(终质量浓度分别为 0. 25 , 0. 5 , 1. 0 mg /
mL),以不加药组作为对照管 ,加入生理盐水 0. 5
mL.每管加入 50 μL 体积分数 3%H 2O 2 ,混匀 , 37
℃温育 2. 5 h. 按试剂盒说明书操作 , 721 型分光光
度计 532 nm 处比色测定.蒸馏水调零 ,以四乙氧基
丙烷为标准 ,计算每毫升溶液中丙二醛(MDA)的生
成量.
1. 7　对α-淀粉酶的抑制试验　
α-淀粉酶用磷酸缓冲液配制成 1 mg /mL 溶液 ,
取 0. 25 mL 分别加入 100 、200 μg 灰树花多酚样
27　第 4期 陈向东等:灰树花多酚的提取和活性研究
品 ,37 ℃结合 10 min ,加入 1 mL 1%可溶性淀粉溶
液. 37 ℃恒温反应 5 min. 碘呈色法:反应液加碘显
色 ,测定 660 nm 处的吸收值. 3 , 5-二硝基水杨酸
(DNS)比色法:反应液加入 1 mL DNS 试剂 ,在沸
水浴上加热 10 min ,冷却后稀释至适当的倍数 ,在
520 nm测定吸收值.
2　实验结果
2. 1　树脂的吸附和解吸
稀释的水提液初始 A280为 0. 570 ,树脂吸附 24
h后测定吸附率 ,7 种树脂的静态吸附动力学曲线
见图 1. 解吸率为乙醇解吸 2 h后测定 ,吸附量及解
吸率结果见表 1.吸附 30 min后 ,除 D201外的其余
6种树脂吸附量均达平衡吸附量的 90%以上. AB-8
和 D3520用乙醇解吸 2 h 后解吸率可达 38. 1%和
49. 6%,5种离子交换型树脂虽然吸附量大 ,但用乙
醇解吸困难 ,后换用 1 mo l /L 的 N aOH 继续解吸仍
难解吸下来.而 AB-8及 D3520对多酚吸附量大 ,解
吸容易 ,所以选用效果最好的 AB-8进行多酚的提
取分离.
图 1　静态吸附动力学曲线
Fig. 1　The kinetics curves of static adsorption
表 1　灰树花多酚的吸附率和解吸率
Tab. 1　The adsorption and desorption of GF polyphenol
树脂 AS 吸附率 /% A j 解吸率 /%
D3520 0. 216 62 0. 217 38. 1
AB-8 0. 194 66 0. 283 49. 6
D392 0. 051 91 0. 05 8. 8
D380 0. 062 89 0. 028 4. 9
D296 0. 082 86 0. 024 4. 2
RD290 0. 066 88 0. 027 4. 7
D201 0. 146 74 0. 027 4. 7
2. 2　理化性质和含量测定
2. 2. 1　光谱分析 　灰树花提取物为褐色粉末 ,易
溶于水和乙醇 ,紫外扫描图谱(图 2)显示在 273 nm
处有最大吸收峰 ,在 200 nm 处有强吸收. 红外扫描
图谱(图 3)3 400 cm-1左右强宽峰为羟基的伸缩振
动吸收 , 3 000 cm-1左右为苯环的不饱和C —H 键的
伸缩振动 ,1 600 ～ 1 400 cm-1具有苯环的特征吸收.
紫外和红外光谱均显示有羟基和苯环的特征吸收.
初步判断为酚类物质. 紫外区仅出现一个单峰 ,与
黄烷醇类多酚如儿茶素等紫外吸收图极为相似 ,说
明灰树花多酚主要成分可能为黄烷醇类多酚.
图 2　灰树花多酚的紫外吸收图谱
Fig. 2　The Ultra-violet spectrum of GF polyphenol
图 3　灰树花多酚的红外图谱
Fig. 3　The IR spectrum of GF polyphenol
2. 2. 2　鉴别试验　样品与茚三酮不显色 ,说明不
是蛋白质或氨基酸;与三氯化铁显灰绿色 ,与溴水
生成白色沉淀 ,是酚类物质的特征反应 , 说明可能
主要为酚类物质 ,与光谱分析结果吻合. 样品与明
胶试液不生成沉淀 ,说明为小分子酚类物质. 样品
加入香草醛-盐酸试液后由原来的黄褐色变为红褐
色 ,而黄烷醇的香草醛-盐酸试液反应为红色 ,推测
样品可能含黄烷醇类物质 ,也与紫外扫描图的推论
一致.
2. 2. 3　灰树花多酚质量分数测定　多酚定量测定
的标准曲线见图 4.采用 Fo lin-Denis法测定灰树花
提取物中酚类物质质量分数为 9. 3%. 该法测多酚
的质量分数比较快速简便 ,以间苯三酚作为标准
品 ,对于以间苯三酚为结构单元的多酚测定结果较
为准确 ,而对于结构尚不明确的灰树花多酚可能存
在着一定误差.
28 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 24卷　
图 4　多酚定量测定的标准曲线
Fig. 4　The standard curve of phenol determination
2. 3　体外抗菌活性
以平板打孔法初步确定了灰树花多酚抑菌的
浓度范围 ,然后再通过平板倍比稀释法测定结果见
表 2数据.从中可以看出 ,灰树花多酚对表皮葡萄
球菌 、金黄色葡萄球菌 、产气肠杆菌 、嗜麦芽杆菌和
假单胞杆菌都有一定的抑制作用. 但由于本实验的
灰树花多酚是粗提物尚未进一步分离提纯 ,所以抑
菌效率不高.
表 2　灰树花多酚的MIC结果
Tab. 2　The MIC of GF polyphenol
菌株(株数) MIC /(mg /m L)
Pseudomonas aeruginosa A T >5
Escherichia coli AT >5
Pseudomonas aeruginosa (2) >5
Escherichia coli (3) >5
Staphy lococcus epidermid is (2) 1. 25
Staphy lococcus aureus(2) 2. 5
Acinetobacter spp.(2) >5
Enterobacter cloacae (2) 1. 25 ～ 2. 5
Salmonella typhi (2) 1. 25～ 5
K lebsiella pneumoniae (2) >5
Stenotrop homonas maltophilia (2) 1. 25>5
Citrobacter spp. (2) 1. 25～ 5
Pseudomonas spp. (2) 0. 63 ～ 1. 25
2. 4　灰树花多酚的抗氧化活性
灰树花多酚对于红细胞的自氧化和 H2O2所致
的氧化均具有一定的抑制活性. 红细胞经温育 24 h
后 ,可出现明显溶血 ,灰树花多酚各剂量组均可抑
制红细胞的自氧化溶血 ,但均无明显量效关系 ,见
表 3. H 2O 2可以破坏红细胞膜 ,导致血红蛋白逸出.
灰树花多酚各剂量组均可显著抑制 H 2O 2的这种作
用 ,见表 4. 灰树花多酚(1 、0. 5 、0. 25 mg /mL)各剂
量组均可显著抑制小鼠肝匀浆自发生成 MDA;并
随剂量增加而增加 ,具量效关系 ,见表 5. 以上结果
表明 ,灰树花多酚具有抗氧化活性.
表 3　对红细胞自氧化溶血的影响
Tab. 3　The hemolysis results of red blood cell self-oxidation
实验组 质量浓度 /(mg /mL) A415 溶血率 /%
阴性对照* 0. 029 100
维生素 C 0. 1 0. 010 34. 5
0. 6 0. 014 48. 3
灰树花多酚 0. 30 0. 015 51. 7
0. 15 0. 015 51. 7
0. 075 0. 023 79. 3
表 4　对 H2O2所致红细胞氧化溶血的影响
Tab. 4　The hemolysis results of red blood cell oxidation in-
duced by H2O2
实验组 质量浓度 /(mg /mL) A415 溶血率 /%
阴性对照* 0. 139 100
维生素 C 0. 1 0. 043 30. 9
0. 6 0. 037 26. 6
灰树花多酚 0. 30 0. 064 46. 0
0. 15 0. 106 76. 3
0. 075 0. 100 71. 9
表 5　对小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响
Tab. 5　The effect on lipid peroxidation of mice liver homoge-
nate
实验组 质量浓度 /(mg /mL) MDA /(nmo l /mg)
阴性对照 14. 28
灰树花多酚 1. 00 2. 04
0. 50 2. 19
0. 25 3. 79
2. 5　灰树花多酚对α-淀粉酶的抑制作用
表 6显示灰树花多酚抑制α-淀粉酶 ,减少酶对
淀粉的水解 ,使其降解产物还原糖减少. 在碘呈色
法测定时随多酚量的增加蓝色变深 ,而在 DNS 比
色法测定时随多酚量的增加还原糖量减少 ,具有一
定的量效关系.说明灰树花多酚具有α-淀粉酶抑制
活性.
表 6　灰树花多酚对α-淀粉酶的抑制作用
Tab. 6　The inhibition of GF polyphenol to alpha-amylase
α-淀粉酶
体积 /m L
灰树花多酚质量 /μg A660 A520
0 0 14. 69 0. 060
0. 1 0 0. 084 0. 285
0. 1 100 0. 120 0. 240
0. 1 200 0. 288 0. 228
29　第 4期 陈向东等:灰树花多酚的提取和活性研究
3　讨　论
作者首次提取分离了灰树花多酚 ,并对其抗氧
化 、抗菌及α-淀粉酶抑制等活性做了初步研究.
对灰树花中活性物质的研究相对集中在多糖
组分[ 10] ,多酚和其他有色物质常作为杂质而被除
去 ,方法有活性炭吸附 、DEAE-纤维素层析及双氧
水氧化等[ 11] .活性炭吸附量大 ,分离效率高 ,但含酚
型化合物的有色物质多呈负离子 ,较难用活性炭脱
色 ,而且活性炭对多糖也有吸附. 离子交换纤维素
是开放性的长链骨架 ,亲水性强 ,吸附容量大 ,可有
效吸附水溶液中的酸 、碱成分和无机离子 ,留下中
性组分.但灰树花有色物质与离子交换纤维素结合
后洗脱困难 ,其原因可能是层析介质被毒化 ,逆转
困难 ,难以重新获得交换能力[ 12] . 而双氧水氧化耗
时长 ,脱色不完全 ,且其中成分遭到破坏. 本研究首
次应用大孔树脂从发酵来源的灰树花菌丝体中提
取多酚类物质. 根据酚类物质特点 ,先选择了极性 、
弱极性和非极性的 7种树脂进行分离研究[ 13] ,然后
选用 AB-8树脂吸附 、乙醇解吸 ,浓缩解吸液以获得
多酚类物质.极性树脂与多酚形成离子键 ,结合牢
固不易洗脱 ,而非极性树脂对多酚吸附不完全. AB-
8是弱极性吸附型大孔树脂 ,主要依靠范德华力吸
附 ,吸附量大 ,解吸容易 ,操作条件温和 ,无酸 、盐等
无机离子干扰 ,利于对提取物的进一步研究 ,适合
灰树花多酚的提取.同时可得到无色灰树花菌丝体
多糖液 ,利于多糖的分离纯化和活性研究.
灰树花提取物主要为多酚类物质 ,对植物来源
的多酚类物质[ 8] 如茶多酚[ 14] 、褐藻多酚[ 15] 等研究
较多 ,而对真菌来源的多酚类物质研究特别是灰树
花多酚的研究未见报道. 本实验中提取的灰树花多
酚具有抗氧化 、抗菌及 α-淀粉酶抑制等活性 ,与文
献报道的灰树花活性一致[ 1 ～ 7] ,说明多酚类物质也
是其活性的重要组分. 多酚以大量酚羟基作为氢供
体 ,对多种活性氧具有清除作用 ,减少氧自由基产
生的可能性 ,同时多酚对氧化酶的抑制和对金属离
子的络合作用也使其表现抗氧化活性.对α-淀粉酶
的抑制活性可能是非竞争性抑制 ,由于多酚与酶表
面形成多点交联 ,一定程度上改变或抑制了酶的空
间结构 , 使之不能发生催化反应所必须的构象变
化 ,致使酶活性中心的催化能力降低[ 8] . 对于多酚
类物质的抗菌活性 ,通常认为相对分子质量大的多
酚与蛋白质的结合力大 ,因而抑菌活性强. 实验中
提取的多酚不使明胶试液沉淀 ,说明不是鞣质 ,而
是小分子多酚 ,也表现出一定的抑菌活性 ,其机理
可能是对微生物酶的抑制而破坏微生物代谢 ,同时
多酚还可以通过与细胞膜的结合改变微生物的代
谢 ,多酚络合金属离子的特性也可能破坏微生物的
生态系统从而破坏微生物的正常代谢.
灰树花多酚类物质具有抗氧化 、抗菌及α-淀粉
酶抑制等活性. 但目前所得的灰树花多酚是混合
物 ,有待进一步分离提纯.
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(责任编辑:朱 明)
30 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 24卷