全 文 ：HPLC-ELSD法测定细风轮菜中醉鱼草苷Ⅳ的含量
陈月圆　李典鹏　卢凤来　刘金磊　文永新
基金项目:广西植物研究所科研基金项目 (NO.桂植业 09009)。
作者简介:陈月圆 , 助理研究员 , 硕士 , 主要从事天然产物化学与药理活性研究。
通讯作者:文永新 , 研究员 , 从事天然产物化学与药理活性研究。
收稿日期:2011-02-28
(广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 , 桂林　541006)
摘　要:采用ZORBAX SB-C 18 柱 (4.6 mm ×150 mm , 5.0μm);柱温 30 ℃;流动相:乙腈-
水 (梯度洗脱:0※30 min:10%～ 50%乙腈);流速 1.0 mL/min;Alhech 2000 ES ELSD检测器;漂
移管温度 110 ℃;气体为空气;流速 3.0 L/min;进样量 5.0μL。建立高效液相色谱-蒸发光散射检
测 (HPLC-ELSD)法测定细风轮菜中醉鱼草苷Ⅳ的含量。结果醉鱼草苷Ⅳ在 5.18 ～ 15.54 μg 的范围
内线性关系良好 (r 为 0.9997);平均回收率 (n=5)为 101.3%(RSD=0.59%)。本法简便 、 准确 、
重复性好 , 可作为细风轮菜中醉鱼草苷Ⅳ含量检测的方法。
关键词:细风轮菜　醉鱼草苷Ⅳ　高效液相色谱-蒸发光散射检测法
　　细风轮菜 [ Clinopodium gracile (Benth.)Mat-
sum.] 为唇形科风轮菜属植物 , 分布于广西 、 福建 、
广东 、 贵州 、 四川等省区 , 具有清热解毒 、 活血功
效 , 用于白喉 , 咽喉肿痛 , 肠炎 , 痢疾 , 乳腺炎 ,
雷公藤中毒 , 外用治过敏性皮炎等[ 1] 。据报道 , 仅
有学者对细风轮菜的醇提物和细风轮菜种子进行过
部分化学成分的研究[ 2～ 3] ;笔者对细风轮菜的挥发
性化学成分进行了 GC-MS分析[ 4] ;同时也对该植物
的水提物进行了系统化学成分研究 , 从中分离得到
一个单体为醉鱼草苷Ⅳ (Buddlejasaponin Ⅳ), 其为
一个 Δ11-13 , 28-环氧-齐墩果烯型三萜皂苷 。醉鱼草
苷Ⅳ是 1991年日本专家从日本醉鱼草植物中首次分
离得到的 , 该单体在该植物中的含量为 0.03%[ 5] 。
众所周知 , 具有 13 , 28-环氧-齐墩果烯型结构三萜
皂苷活性较强 ,资料表明 ,具有同样的 13 , 28-环氧-
齐墩果烯型结构的柴胡皂苷 a , d 具有显著的抗炎作
用和降低血清胆固醇和甘油三酯作用[ 6] , 也有研究
报道柴胡皂苷 a 有抑制肿瘤细胞增殖的活性[ 7] 。同
样笔者从细风轮菜中分离得到的单体醉鱼草苷Ⅳ与
柴胡皂苷 a具有类似的皂苷元结构 , 且比柴胡皂苷 a
多了一个糖 , 有资料表明研究皂苷糖链结构与生物
活性有密切关系 , 因此预测其可能也有较好的类似
活性 , 通过查阅国内外文献仅有韩国学者从国外特
有植物 (Pleurospermum cam tschaticum)中分离得
到醉鱼草苷Ⅳ, 同时研究了其在抑制 NO 、 PGE 2和
TNF-α因子方面具有显著抗炎效果 , 同时也发现其
在醋酸扭体 、 热板致痛有明显镇痛作用[ 8] 。此外 ,
该团队也采用 Poloxamer-407 、 Triton WR-1339 、 高
胆固醇饮食等作为诱导剂 , 醉鱼草苷Ⅳ具有显著的
抑制高胆固醇血症和高脂血症 , 其效果与普罗布考
相当[ 9] 。笔者发现了该单体醉鱼草苷Ⅳ在肝纤维化
方面具有很好的预防和治疗作用 , 已申请了发明专
利[ 10] 。初步研究表明该单体化合物醉鱼草苷Ⅳ确实
具有一定的药用价值活性 , 具有良好的开发前景。
该单体化合物在同属植物的 Clinopodium micran-
thum[ 11]和 Clinopodium chinensis[ 12] (风轮菜)中也
含有 , 但含量较少 , 而笔者通过前期的研究发现该
单体化合物在细风轮菜原植物中 (干品)的含量达
到 0.48%。本研究采用 HPLC-ELSD对细风轮菜中
醉鱼草苷Ⅳ进行了含量测定 , 结果表明 , 该法灵敏
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农 业 研 究 与 应 用
AG RICULTURAL RESEARCH AND APPLICATION
　　　 2011年第 3期(总第 134期)(General S erial No.134)No.3 May 2011
度 、准确性和重复性均能满足要求 , 是一种测定细
风轮菜中醉鱼草苷Ⅳ含量的有效方法。
1　仪器与试药
仪器:Agilent1200 型高效液相色谱仪:包括
VWD检测器 、 四元梯度泵 、 在线真空脱气机 、 标准
自动进样器 (G1329A)、 安捷伦化学工作站 (美国
Agilent公司)。BS110S 赛多利斯电子天平 (北京赛
多利斯天平有限公司);B3500S-MT 超声清洗器 (必
能信超声有限公司)。 R-3000 旋转蒸发仪 (瑞士
Bǜchi公司);2000ES 蒸发光散射检测器 (格雷斯中
国有限公司)。
对照品与试药:醉鱼草苷 Ⅳ对照品 (纯度大于
99.8%)由本课题组分离制备 , 通过波谱方法 (1H
和13C NMR)并与文献[ 5]对比确定其结构为醉鱼草
苷Ⅳ;化学结构如图 1;乙腈为色谱醇 (美国 FISH-
ER公司);超纯水为自制;其他试剂均为分析纯
(西陇化工厂), 样品细风轮菜由广西植物研究所韦
发南教授鉴定。
图 1　醉鱼草苷Ⅳ的化学结构
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱 ZORBAX SB-C 18 柱 (4.6 mm ×150
mm , 5.0 μm);流动相乙腈 , 水洗脱梯度 10∶90 ～
50∶50 , 0 ～ 30 min;流速 1.00 mL/min;ELSD漂移
管温度 110 ℃;气体为空气 , 流速 3.0 L/min;柱温
30 ℃。色谱图见图 2 。
图 2　HPLC-ELSD色谱图及 50%甲醇提取样品 (e)HPLC-UV 色谱图
50%甲醇提取样品 (a)、 纯甲醇提取样品 (b)、 水提取样品 (c)、 对照品 (d)
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2.2　对照品溶液的制备
精密称定醉鱼草苷Ⅳ对照品 51.8 mg 置 50 mL
容量瓶中 , 加入 50%甲醇溶解并定容 , 摇匀 , 配成
浓度为 1.036 mg/mL 的对照品溶液。
2.3　供试品溶液的制备
取细风轮菜粉末 (过 40 目筛)10.0 g 精密称
定 , 加 50%甲醇 200 mL 超声 (500 W , 40 Hz)提
取30 min , 过滤得滤液 。药渣继续用 50%甲醇 200
mL 超声 (500 W , 40 Hz)提取 30 min , 过滤得滤
液 , 药渣用 50%甲醇 50 mL 洗涤 3 次 , 合并滤液与
洗液 , 于 60 ℃减压回收溶剂至近干 , 以 50%甲醇溶
解转移并定容至 50 mL 量瓶中 , 以 0.45 μm 微孔滤
膜滤过即得。
2.4　线性关系考察
对照品溶液采用自动进样器进样 , 进样量分别
为5.0 μl 、 6.0 μl 、 8.0 μl 、 10.0 μl、 12.0 μl 、 15.0
μl , 按照 2.1项下的色谱条件测定 。以对照品进样量
(μg)为横坐标 X , 色谱峰面积值为纵坐标 Y , 绘制
标准曲线 , 数据经回归处理 , 得醉鱼草苷 Ⅳ的回归
方程 Y=3 010 301X+4 000 142 , r=0.9997 , 醉鱼
草苷Ⅳ的线性范围分别为 5.18 ～ 15.54μg 。
2.5　精密度试验
采用自动进样器精密吸取 2.2 对照品溶液 5.0
μl , 连续进样 5 次 , 测得各次峰面积 , 计算 RSD值
为 0.56%。表明精密度良好 , 符合含量测定要求。
2.6　重复性试验
按 2.3方法制备 5份供试品溶液 , 分别进样 5.0
μl , 测定醉鱼草苷 Ⅳ的峰面积 , 计算平均含量为
0.48%, RSD值为 2.3%。表明用此方法测定醉鱼
草苷Ⅳ含量 , 重复性良好 。
2.7　稳定性试验
按2.3方法制备供试品溶液 , 分别在 0 h , 2 h ,
4 h , 8 h , 12 h , 24 h测定 , 每次进样 5.0 μl。测定
醉鱼草苷Ⅳ的峰面积 , 计算 RSD值为 0.62%。表明
供试品溶液中醉鱼草苷Ⅳ在 24 h内基本稳定。
2.8　回收率试验
取细风轮菜样品 5份 , 每份 5.0 g , 精密称定 ,
每组分别精密加入 1.036 mg/mL 醉鱼草苷Ⅳ对照品
溶液 0.5 mL , 按 2.3方法制备成供试液 。分别取上
述溶液 5.0 μl注入高效液相色谱仪 , 计算回收率。
醉鱼草苷Ⅳ的平均回收率 (n=5)为 101.3%, RSD
值分别为 0.59%。
2.9　样品测定
按 2.3 方法制备供试品溶液 5 个 , 每个样品进
样 5.0μl , 测得样品中醉鱼草苷Ⅳ的峰面积 , 依据回
归方程 , 计算得到各样品醉鱼草苷Ⅳ的含量分别为
0.47%、 0.46%、 0.45%、 0.47%和 0.49%。
3　讨论
3.1　提取溶剂及方法的选择
本实验考察了甲醇和 50%甲醇超声提取和水煮
提取各 30 min , 提取 2次 。结果表明 , 50%甲醇提
取效果最好 (见图 2:a)。在相同条件下 , 超声提取
时醉鱼草苷Ⅳ的峰面积较水煮提取时的大 (见图 2:
a和 c), 其可能是由于醉鱼草苷Ⅳ具有对热不稳定的
结构导致;同时由于醉鱼草苷Ⅳ的极性较大 , 采用
50%甲醇作为溶剂比纯甲醇提取效果较好 (见图 2:
a和 b), 所以本研究采用 50%甲醇超声提取。
3.2　有关 ELSD方法
与 UV 相比 , ELSD 是一种通用型检测器 ,
ELSD的检测不依赖于样品的光学性质 , 流动相的选
择不受溶剂紫外吸收性质的限制。2002 年增补版
《中国药典》 中已经收载了 HPLC-ELSD 方法作为
质量控制的方法之一。虽然 ELSD不可能完全替代
UV检测器 , 但是对于一些弱紫外吸收或无紫外吸收
成分的分析 , ELSD的确发挥了重要作用。本文考察
了紫外和蒸发光散射 2种检测方法 (见图 2:e), 结
果表明紫外 (210 nm)检测条件下 , 色谱图基线漂
移 , 干扰皂苷类成分检测 , 同时其醉鱼草苷 Ⅳ在紫
外 (210 nm)处的吸收不强 , 峰面积较小 , 会对该
成分在细风轮菜植物中的含量造成测量误差 。与紫
外检测相比 , 在蒸发光散射检测条件下 , 色谱图基
线平稳 , 灵敏度高 , 峰形更好 (见图 2:e)。
参考文献
[ 1] 福建植物志编委会.福建植物志(四)[ M ] .福
州:福建科学技术出版社 ,1988:587-589.
[ 2] KuoY H , Lee S H M , Lai J S H.Chemical study
of C.gracile [ J] .Chin Pharm J(TaiPei), 2000 ,
52(1):27-34.
[ 3] 林文群 ,陈金玲 ,吴惠平 ,等.细风轮菜种子化学
成分研究[ J] .亚热带植物科学 , 2002 ,31(2):18-
20.
[ 4] 陈月圆 ,黄永林 ,文永新 ,等.细风轮菜挥发油成
24 农 业 研 究 与 应 用　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
分的 GC-MS分析[ J] .精细化工 ,2009(8):770-
772.
[ 5] Astushi Yamamaoto , Toshio Miyase , Akira Ueno ,
et al.Buddlejasaponin Ⅰ-Ⅳ , four new oleanane-
triterpene saponins f rom the aerial parts of buddleja
japonica hemsl [ J] .Chem.Pharm.Bull., 1991 ,
39(10):2764-2766.
[ 6] 吴立军.天然药物化学(第 4版)[ M ] .北京:人
民卫生出版社 , 2005:284.
[ 7] Wen-Sheng Wu , et al.Involvement of p-15 and p-
16 Gene Expression in Saikosaponin A and TPA-
induced Grow th INHIBITION OF HepG2 CELLS
[ J] .Biochemical and Biophydical Research Com-
munications ,2001 , 28(5):182-187.
[ 8] Jong-Heon Won , Ho-Taek Im , Yang-Hee Kim , et
al.Anti-inf lammatory effect of buddlejasaponin IV
through the inhibi tion of iNOS and COX-2 expres-
sion in RAW 264.7 macrophages via the NF-κB in-
activ ation[ J] .Bri J Pharm , 2006 148(2):216-
225.
[ 9] Hyun-Ju Jung , Jung-Hwan Nam , Hee-Juhn Park ,
et al. The MeOH ex tract of Pleurospermum
kamtschaticum and its active component buddlejas-
aponin(IV)inhibi ts int rinsic and ex trinsic hyper-
lipidemia and hype rcholesterolemia in the rat [ J].
J Ethno ,2007 , 112(2):255-261.
[ 10] 陈月圆 ,李典鹏 ,文永新 ,等.醉鱼草苷Ⅳ的制备
方法 及 其 产 品 和 应 用 [ P ] .申 请 号:
201010258534.6 ,2010.8.
[ 11] Astushi Yamamao to , Hiroko Suzuki , Toshio
Miyase , et al.Clinoposaponins Ⅵ and Ⅷ , two
oleanane-triterpene saponins f rom Clinopodium
micranthum [ J].Phy tochemist ry , 1993 ,34(2):
485-488.
[ 12] Zimni Liu , Zhongjian Jia , Rex G.Cates , et al.
Triterpenoid saponins from Clinopodium chinen-
sis[ J] .J nat pro ,1995 ,58(2):184-188.
Determination of Buddlejasaponin Ⅳ
in Clinopodium graci le by HPLC-ELSD
Chen Yue-yuan , Li Dian-peng , Lu Feng-lai , Liu Jin-lei , Wen Yong-xin
(Guangxi Institute of Botany , Guangxi Zhuang Autonomous Region
and the Chinese Academy of Sciences , Guilin 541006 , China)
Abstract:ZORBAX SB-C18 column (4.6mm×150mm , 5.0 μm)was used as column;column
temperature w as at 30 ℃;acetonit rile-water w as used as the mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/
min , and eluted in gradient mode(0-30 min , 10%A ～ 50%A);Alhech 2000 ES ELSD was used as
the detector;temperature of the drif t tube was at 110 ℃;and air as carrier gas;f low rate w as 3.0
L/min.The results showed that buddlejasaponin Ⅳ had a good linearity (r =0.9997) in 5.18 ～
15.54μg;and the average recovery (n=5)was 101.3%(RSD=0.59%).The method is simple
and accurate w ith a good reproducibity , and can be used for the content determination of Buddlejas-
aponin Ⅳ in clinopodium gracile.
Key w ords:Clinopodium graci le;buddlejasaponin Ⅳ;HPLC-ELSD
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