全 文 ：一种灰树花菌丝体多糖 GF4F1的结构
特征及其抗肿瘤活性
于广利 , 李春林 , 赵　峡 , 杨晓华 , 宋乐天 , 高昊东
(中国海洋大学海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003)
摘　要:　以灰树花发酵菌丝体为原料 , 经过提取分离纯化得到 1 种水溶性多糖 GF4F1 , 经高碘酸氧化 、Smith 降解 、甲基化 、
红外光谱(IR)以及核磁共振波谱(NMR)等分析表明 , 该多糖是 1 种 β-1 , 3/ 1 , 6-葡聚糖 , 且小鼠体内实验结果表明其具有良
好的抗肿瘤活性。在 1 mg/ kg时 , 对小鼠抑制率为 67.3%。
关键词:　灰树花菌丝体;β-1 , 3/1 , 6-葡聚糖;结构;抗肿瘤活性
中图法分类号:　R282.71　　　　　文献标识码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2006)06-915-05
　　灰树花(Gri fola frondosa)为药食两用真菌 ,其子
实体和发酵菌丝体多糖具有多种生理活性 , 如抗肿
瘤[ 1] ,增强免疫[ 2-4] ,降血糖[ 5] 等功能。由于灰树花栽
培工艺 、发酵工艺以及提取工艺不同 ,得到的灰树花多
糖的结构 、分子量大小以及分支度等均不尽不同 ,其抗
肿瘤以及免疫增强等活性也存在较大差别 。大量文献
表明 ,具有 β-1 ,6分支 β-1 ,3-葡聚糖及具有 β-1 , 3分支
的 β-1 ,6-葡聚糖抗肿瘤活性较好 , 如 2005年 5月 ,美
国FDA批准灰树花多糖 D-Fraction已经应用于临床试
验研究 , 其活性组分为 β-1 , 3 分支的 β-1 , 6-葡聚糖。
本文以灰树花发酵菌丝体为原料 ,经分离纯化获得了 1
种水溶性 β-葡聚糖(GF4F1),并采用气相色谱(GC)、高
效凝胶渗透色谱(HPGPC)、红外光谱(IR)和核磁共振
波谱(NMR)等方法对其糖链结构进行了表征 ,同时对
其抗肿瘤活性进行了初步评价 。
1　材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料　　灰树花菌丝体 (山东济南澳利生物工
程公司 ,批号 20030915);葡萄糖 、甘露糖 、半乳糖 ,岩藻
糖 ,鼠李糖 ,阿拉伯糖 ,木糖 ,葡萄糖醛酸 ,赤藓糖醇 ,碘
甲烷均为 Sigma公司产品;不同分子量葡聚糖标准品
(P-82),购于日本 Shodex 公司;环磷酰胺(上海华联制
药有限公司);香菇多糖(南京振中生物工程有限公
司);昆明种小鼠(18 ～ 20克 ,山东大学实验动物中心);
S180瘤株(中国医学科学院药物研究所)。
1.1.2 仪器　　高效液相色谱仪(Agilent 1100 ,Agilent
公司 );快速蛋白纯化系统( KTA-FPLC , Pharmacia
公司);色谱柱(Aminex HPX-87H , 7.8 mm×300 mm ,
BioRad公司;Shodex SB804 HQ , 7.6 mm×300 mm ,
SHODEX公司);紫外可见分光光度计(T U1810 ,北京
谱析通用仪器公司);填料及玻璃层析柱(Sepharose
CL6B , XK26/95cm;Q Sepharose FF , XK5/12 cm;
Amersham Biosciences 公司);红外光谱仪(Nicolet
Nexus 470 型;Thermo Elect ron 公司);冷冻干燥仪
(EZ550Q , FTS 公司);超导核磁共振波谱仪 (Jeol
JNM-ECP 600M , 日本电 子);气质 联用仪 (GC ,
HP5890Ⅱ;MSD , 5971A , Agilent 公司)。
1.2 方法
1.2.1 灰树花多糖的制备[ 6] 　　将灰树花菌丝粉用乙
醇脱脂 ,热水回流提取后 ,残渣用稀碱于 4 ℃提取 ,上
清液经醋酸中和 、离心和超滤浓缩脱盐后冷冻干燥 ,得
到水溶性粗多糖 。粗多糖采用离子交换色谱(IEC)纯
化 , 即在快速蛋白纯化系统上用 Q Sepharose FF 柱分
离纯化 ,用 0～ 1.2 mol/L NaCl梯度洗脱 ,流速8 mL/min ,
部分收集器收集各组分 ,用 280 nm 和 490 nm 分别测
定蛋白和多糖含量 ,收集合并含糖组分 。
1.2.2 高效凝胶渗透色谱　　采用 Shodex SB804柱 ,
用 0.02%NaN3 水溶液洗脱 , 柱温 35 ℃, 流速 0.5
mL/min ,进样量 20 μL , RI 在线检测 ,用 Agilent 1100
GPC 软件分析包进行数据采集和分析。
1.2.3气相色谱分析(GC)　　将多糖样品全水解 ,经
衍生为糖腈乙酸酯 ,以肌醇六乙酸酯为内标进行 GC
分析 ,采用石英毛细管柱 AC225(0.25 mm×30 m);进
样口温度 270 ℃;柱温 215 ℃;氢火焰离子化检测器
(FID);检测器温度 270 ℃;载气为 N2 。根据出峰时间
基金项目:国家自然科学基金项目(30370345);青岛市科技局项目(05-2-NS-27)资助
收稿日期:2006-09-18;修订日期:2006-10-12
作者简介:于广利(1964-),男 ,教授 ,博导。 E-mail:glyu@ouc.edu.cn
　 第 36卷　第 6期 　
2006年 11月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
36(6):915～ 918
Nov., 2006
和峰面积比确定单糖组成并计算其摩尔比。
1.2.4 高碘酸氧化 、Smith 降解产物分析[ 7-9] 　　降解
产物用Aminex HPX-87H 柱分析 ,流动相为 5 mmol/L
H2SO4水溶液 ,流速 0.6 mL/min ,柱温 65 ℃,示差检
测器检测 。
1.2.5 红外光谱分析(IR)　　取 2 mg 样品溴化钾压
片分析。
1.2.6核磁共振波谱分析(NMR)　　将 35 mg 样品用
1 mL D2O 溶解 , 冻干交换 2 次 , 经 0.5mL D2O
(99.96%)溶解后加入核磁管 ,用 JNM-ECP600 核磁共
振波谱仪测定。
1.2.7 甲基化分析　　甲基化糖醇乙酸酯采用 GCMS
分析 ,色谱柱为 AC225 ,采用程序升温(100 ～ 250 ℃,
2 ℃/min), 进样口温度 250 ℃, EI 70ev , 真空度 80
mtorr ,扫描范围 60-650 au ,进样 1 μL。
1.2.8抗肿瘤活性 　　抽取腹腔接种 S180 瘤细胞小
鼠腹水 ,用无菌生理盐水稀释成 106 个/mL 浓度的瘤
细胞悬浮液 ,每只小白鼠接种 0.2 mL 悬浮液 ,雌雄兼
用 ,接种后随机分组 ,每组 10只。次日给药 ,样品组为
GF4F1 ,设高 、中 、低 3个剂量组(10 , 4 , 1 mg/kg),每次
腹腔注射 0.4 mL ,隔日 1次;以环磷酰胺 40 mg/kg 和
香菇多糖 5 mg/kg 为阳性对照 ,腹腔注射给药 ,隔日 1
次 ,每次 0.4 mL。空白对照组为 0.9%氯化钠 ,腹腔注
射给药 ,剂量为每次 0.4 mL ,隔日 1次 。实验 2周后 ,
颈椎脱臼处死小鼠 ,剥取瘤块称重 ,按下式计算肿瘤生
长抑制率:肿瘤抑制率(%)=(c-t)/c×100%,其中 c
为空白对照组平均瘤重(g), T 为实验组以及阳性组平
均瘤重(g)。
2　结果与讨论
2.1 灰树花多糖GF4F1的制备
灰树花发酵菌丝粉经 80%乙醇回流提取 3次 , 离
心(4 500 r/min , 30 min)除去脂质以及小分子成分 ,残
渣然后用沸水回流提取 3次去除水溶性成分 ,残渣用 2
mol/L NaOH水溶液(1∶30 ,W/V)于 4 ℃搅拌提取 3
次;提取液合并后经中和 、离心得到上清液 ,该上清液
经超滤浓缩(Millipore , Proflux M 12 , 10 kD)脱盐后 ,
冷冻干燥 ,得到淡黄色疏松粉末状粗多糖 GF4(得率
1.2%)。将GF4溶于水(50 mg/mL),过0.45μm滤膜
后 ,先用 Sepharose CL6B柱纯化 ,得到 1个宽分布含糖
组分 ,该组分进一步用 Q Sepharose FF 阴离子交换柱
分离纯化 ,结果见图 1。从图 1可以看出 , GF4含有 4
个组分 ,其中组分 1(GF4F1)和组分 2(GF4F2)为含糖
组分 ,GF4F1 含量较高 ,组分 3 和组分 4 主要为杂蛋
白。采用苯酚-硫酸法以葡萄糖计测得 GF4F1 和
GF4F2总糖含量分别为 99.3%和 50.1%;采用 Folin-
酚法[ 10]测定其粗蛋白含量分别为 0.91%和 43.4%。
将含糖量较高的GF4F1合并收集 ,超滤(Millipore Lab-
scale , TFF sy stem , Biomax 8 kD)浓缩 、脱盐 ,冷冻干燥
得到白色粉末(得率 0.24%)。
图 1　GF4F1 在 Q-Sepharose FF 柱的分离纯化
Fig.1　Separation and purification of GF4F1
on Q Sepharode FF column
2.2 相对分子质量分析
由于 GF4F1为水溶性多糖 ,其分子量选用 SB804
柱进行分析 ,将系列葡聚糖标准品(5.9;11.8;22.8;
47.3;112;404 kD)和样品用 0.02%NaN3 水溶液配成
2 mg/mL ,采用自动进样器进样 ,经分析得方程为 Y =
6.506-0.960 x -0.101X 2(r 2 =0.999 5 , n =5;X ,
min;Y ,LogM r)。GF4F1 在 HPGPC 柱上显示为单一
峰(图略),分布宽度 1.96 ,经过计算 ,其峰位分子量为
190 kD。
2.3 单糖组成分析
GF4F1全水解后 ,经 HPTLC及 GC分析(图略)表
明 ,该多糖只由葡萄糖组成。
2.4 糖残基之间连接方式
GF4F1经高碘酸氧化达到平衡后 ,经滴定分析表
明 ,产物中有大量甲酸产生 ,且消耗高碘酸的摩尔数高
于生成甲酸的摩尔数 ,表明该多糖分子中存在 1※6连
接 ,无 1※2 和 1 ※4 连接方式;Smith 降解产物经
HPLC 分析表明 ,降解产物中含有甘油和葡萄糖 , 但不
含赤藓糖醇 ,进一步说明 GF4F1中不含 1※4连接 ,分
子中除了存在 1※6连接外 ,还存在 1※3 连接;此外 ,
该多糖很容易被乙酰解 ,并形成大量寡糖 ,推断主链主
要为 1※6连接 。
本文采用改良的Hakomori法进行甲基化分析 ,甲基
化程度用 IR检测(3 500 cm-1无吸收峰),完全甲基化产
物用90%甲酸水解 ,经还原得到甲基化糖醇 ,再经乙酰
化 ,得到部分甲基化糖醇乙酸酯 ,并进行甲基化分析 ,根
据出峰时间进行谱库检索确定离子碎片 ,根据峰面积计
算各碎片摩尔数和比例 ,其质谱数据如表 1所示 。
916 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 6 年
表 1　GF4F1 甲基化糖醇乙酸酯的气质联用分析
Table 1　GCMS analy sis of alditol acetates of GF4F1 methylation
时间
T ime/min
糖醇乙酸酯
Alditol acetates
离子碎片
Ion fragments
连接方式
Mode of linkage
摩尔比
Molar ratio
21.33 2 , 3 , 4 , 6-Me4-1 , 5-Ac2-Glc 43 , 87 , 101 , 117 , 129 , 145 , 161 , 205 G lc(1※ 1.00
23.93 2 , 4 , 6-Me3-1 , 3 , 5-Ac3-Glc 43 , 87 , 101 , 117 , 129 , 161 , 203 , 233 , 277 ※3)Glc(1※ 1.17
24.79 2 , 3 , 4-Me3-1 , 5 , 6-Ac3-Glc 43 , 74 , 87 , 101 , 117 , 129 , 173 , 189 , 233 ※6)Glc(1※ 1.62
27.40 2 , 4-Me2-1 , 3 , 5 , 6-Ac4-Glc 43 , 87 , 117 , 129 , 161 , 189 , 233 , 305 ※3 , 6)Glc(1※ 0.95
　　由上述甲基化结果可知 ,在 GF4F1中 1※6 连接
所占比例最多 ,该结果与乙酰解得到大量寡糖片断的
结果相吻合 ,表明主链主要是 1※6连接 ,1※3连接的
比例次于 1※6 连接 ,与端基和分枝点 Glc 的比例相
近 ,表明支链为 1※3连接 。
2.5 IR与 NMR结构表征
IR分析显示 ,GF4F1在 2 922 cm-1和 1 375 cm-1
处有 2组特征吸收峰 ,分别代表了糖类化合物 C-H 伸
缩振动和变角振动 , 3 383 cm-1处有强吸收 ,为糖类化
合物多羟基中 O-H 伸缩振动;1 160 cm-1和 1 075
cm
-1处的强吸收为糖环内醚 C-O-C 中的 C-O 伸缩振
动和糖环 C-OH 的 O-H 变角振动;898 cm-1为 β-D-Glc
端基 C-H 变角振动特征吸收 , 1 375 cm-1也为 β-葡聚
糖特征吸收峰 , 上述信息表明 ,GF4F1为 β-葡聚糖。
1H-NMR(见图 2a)分析显示 ,各糖残基中 H1信号
分布在(4.20 ～ 4.50)×10-6之间 (HOD , 4.63 ×
10
-6), <5.0×10-6 ,表明该多糖属于 β-构型。(4.48
～ 4.47)×10-6为侧链非还原端 H1β以及分枝点 1 ,3 ,
6-Glc H1β信号峰 ,(4.23 ～ 103×10-6为链 1 , 6-GlcH1β
信号峰;在13C-NMR(图 2b)中 ,103×10-6为 C-1取代
信号峰 , 86×10-6为 C-3取代信号峰 , 61×10-6为游
离C-6信号峰 , 68.6×10-6为主链中C-6取代信号峰 ,
69.2×10-6为分枝点中 C-6取代信号峰 ,表明 GF4F1
属于 β-1 ,3/1 ,6-葡聚糖[ 8-9 ,11] 。
图 2　GF4F1 的核磁共振氢谱(a)和碳谱(b)
Fig.2　The 1H-NM R(a)and 13C-NM R(b)spectra of GF4F1
　　此外 ,本文还对 GF4F2中的糖链结构进行了研
究 ,其 IR , 1H-NMR以及13C-NMR图谱与 GF4F1相似
(图略),仍属于 β-1 ,3/1 , 6-葡聚糖结构 ,但支链的分枝
度低于 GF4F1。经刚果红结合实验表明 , GF4F1 和
GF4F2均能使刚果红的最大吸收波长发生红移 ,其红
移波长为 10 ～ 18 nm ,表明二者在水溶液中均能形成
超螺旋结构 ,这也是 β-1 ,3-葡聚糖类化合物发挥抗肿
瘤活性的关键因素之一[ 12] 。
9176期 于广利 ,等:一种灰树花菌丝体多糖 GF4F1的结构特征及其抗肿瘤活性
本文按照常规抗肿瘤实验规程 , 对不同剂量
GF4F1进行了小鼠体内抗肿瘤活性实验(见表 2)。结
果显示不同剂量 GF4F1 经腹腔注射后均具有良好的
抗 S180 活性 ,且其效果好于香菇多糖 ,表明该类型葡
聚糖具有良好的开发潜力。
表 2　GF4F1 对小鼠体内 S180 抑制作用
Table 2　Effect of GF4F1 on the inhibition of S180 in mice
组别
Group
剂量/mg·kg -1
Dose
小鼠数量
Number of mice
平均瘤重/ g
Average tumor weight
抑制率/ %
Inhibition rate
空白
Control - 10 2.08±0.91
GF4F1 1 10 0.68±0.21＊＊＊ 67.3
GF4F1 4 10 1.24±0.78＊＊ 40.4
GF4F1 10 10 0.95±0.64＊＊ 54.3
香菇多糖① 5 10 1.34±1.05＊＊ 35.6
环磷酰胺② 40 10 0.05±0.02＊＊＊ 97.6
注:t-检验 t-test:＊＊P <0.01;＊＊＊P <0.001 vs 空白组 Cont rol;①Lent inan;②Cyclophosphamide
　　利用发酵工程技术以及现代提取分离技术 ,获得
具有抗肿瘤活性的 β-1 , 3-葡聚糖 ,是近年来真菌多糖
研究和开发的热点。灰树花菌丝体中含有不同结构的
多糖 ,既有细胞外分泌的多糖 ,也有存在于细胞壁的水
溶性 β-1 , 3/1 , 6-葡聚糖和水不溶性α-1 , 3-葡甘聚糖。
本文获得了 1 种 β-1 , 3/1 , 6-葡聚糖 GF4F1 ,并在小鼠
体内显示了较强的抗肿瘤活性 ,为该多糖资源的开发
和糖药物的研究提供了有用信息。
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(下转 974页)
918 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 6 年
An Analysis and Assessment of the Water Environmental Capacity
of Xiao ZhuShan Reservoir of Qingdao
ZHAO Shu-Mei1 , ZHENG Xi-Lai2 , LI Ling-Ling2 , ZHANG Xiao-Hui2
(1.Qingdao Municipal Eng ineering Design and Reasearch Institute , Qingdao 266071 , China;2.Department of Environmental
Engineering , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　The w ater environmental capaci ty is gauged based on the w ater environment goal and the law of
w ater dilution and purification.The pollutants released to a w ater body should conlorm to the requirements of
the w ater environmental capacity , o ther w ise some measures must be taken to protect the water body.In this
paper , based on the w ater environmental capacity model for reservoirs , the water envi ronmental capacity of Xi-
ao ZhuShan reservoir is calculated w ith the BOD and CODM n decay coef ficients determined through experimental
simulation , furthermore their permitted discharge amounts are also calculated。 The results indicate that the
w ater environmental capacities for BOD5 and CODMn of the Xiaozhushan reservoir are 287 kg/d and 347.9 kg/d
respectively , but the allow able w astew ater amounts should be controlled at less than 71.8 kg/d and 86.9 kg/d.
Only then is the w ater of Xiaozhushan reservoir fi t for drinking.
Key words:　Xiao ZhuShan;reservoi r;envi ronmental capacity
责任编辑　庞　
(上接 918页)
Structural Characterization and Antitumor Activity of Polysaccharide
GF4F1 from Grifola frondosa Mycelium
YU Guang-Li , LI Chun-Lin , ZHAO Xia , YANG Xiao-Hua , SONG Le-Tian , GAO Hao-Dong
(Marine Drug and Food Institute , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　A poly saccharide(GF4F1)was ex tracted and purif ied from fermented Grifola f rondosa
mycelium.The structural characterization of GF4F1 w as analyzed by NaIO4 ox idat ion , Smith deg rada-
tion , methylation , IR and NMR techniques.The results showed that GF4F1 w as β-1 ,3/1 , 6-D-Glucan ,
and showed good anti-tumo r act ivity in mice.The inhibi tion rate to S180 in mice w as 67.3%at 1 mg/
kg.
Key words:　Grifola f rondosa mycelium;β-1 ,3/1 ,6-Glucan;structure;anti tumor activity
责任编辑　于　卫
974 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 6 年