全 文 ：低分子量灰树花多糖的分离 、纯化和抗肿瘤活性
陈向东 ,刘晓雯 ,吴梧桐＊
中国药科大学生命科学与技术学院 ,江苏 南京 210009
【摘　要】　目的:从灰树花菌丝体中分离纯化低分子量多糖并进行结构鉴定和抗肿瘤活性检测。方法:采
用大孔吸附树脂和离子交换纤维素进行分离 , Sephadex G200 柱层析纯化 ,HPGFC 测定分子量 , 紫外光谱 、红外光
谱 、薄层色谱和高效液相色谱和气相色谱等进行纯度和结构鉴定。 用荷瘤小鼠检测抗肿瘤活性。结果:得到
大 、小两种多糖组分 , 其中低分子量多糖为白色粉末状 ,分子量约为 2600 , 单糖组成为 D-葡萄糖 , 含α-1 , 3 ,α-1 ,
6 ,α-1 , 4-糖苷键 ,对 S180 肉瘤 、EAC腹水瘤 、Heps实体瘤都有明显抑制作用。结论:分离得到一种灰树花菌丝体
多糖 ,为低分子量的α-葡聚糖 , 初步药效试验表明其具有抗肿瘤作用。
【关键词】　灰树花菌丝体;多糖;分离纯化;理化性质;分子量;抗肿瘤
【中图分类号】　TQ464.1　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　1672-3651(2006)01-0077-04
【收稿日期】　2005-01-08
【基金项目】　教育部高等学校科技创新工程重大项目(No.
130105)资助课题
【＊通讯作者】　吴梧桐:教授 ,博导 , Tel:025-83320372。
　　灰树花(Grifola frondosa)是一种药 、食兼用的
珍稀食用菌 ,具有广泛的药理活性 ,如抗肿瘤[ 1] 、
抗糖尿病[ 2] 、抗氧化[ 3] 、以及抗辐射[ 4] 、调节免
疫功能[ 5] ,抗菌[ 6]等 ,灰树花多糖是其中最重要的
一类活性成分[ 7] 。本文从黄褐色的灰树花菌丝体
粗提物中分离纯化得到一种无色的低分子量多
糖 ,并对其理化性质及抗肿瘤活性进行了初步研
究。
1　仪器与材料
1.1　试　剂
灰树花菌丝体粗提物 ,由山东京博生物科技
公司提供;Diaion HP20大孔树脂 ,三菱公司出品;
Sephadex G-200 ,DEAE 纤维素 , Sigma 出品;单糖标
准品 ,Sigma出品;天地欣(香菇多糖注射液),南京
振中生物工程有限公司;其余试剂均为国产分析
纯。
1.2　仪　器
BS-100A自动部分收集器;HP-6890气相色谱
仪;UV-9100紫外可见分光光度计;Shimadzu FTIR-
8400S红外光谱仪;Perkin-Elmer Lambda-2 紫外可
见分光光度计;Waters600高效液相色谱仪 ,配 2410
示差折光检测器和M32工作站 。
1.3　实验动物
ICR小鼠 ,18 ～ 22 g ,雌雄兼用 ,中国药科大学
实验动物中心提供 。
2　方法与结果
2.1　灰树花多糖的分离
2.1.1　大孔树脂分离　称取一定量灰树花菌丝体
粗提物 ,加10倍水室温搅拌下浸提 2次 ,离心取上
清。上清液上 HP20大孔吸附树脂柱 ,以水洗脱 ,
洗脱液浓缩 ,加 5倍量 95%乙醇 ,离心 ,沉淀用无
水乙醇及丙酮洗涤 ,减压干燥得浅黄色多糖 。
2.1.2　离子交换纤维素分离　上述多糖溶于水 ,
用离子交换纤维素柱层析 ,水洗脱 ,洗脱液浓缩 、
醇沉 、洗涤 、干燥得无色多糖 。硫酸-苯酚法测定糖
含量为 80%,收率为菌丝体粗提物的 3%～ 4%。
2.1.3　Sephadex G-200 柱层析分离　多糖水溶液
用Sephadex G-200柱层析(1 cm×70 cm),水洗脱 ,
3.5 mL/管分部收集 ,硫酸-苯酚法检测糖含量 ,收
集合并主多糖峰 ,浓缩 、醇沉 、洗涤 、干燥 ,得纯化
多糖 。无色多糖水溶液经 Sephadex G-200柱层析 ,
从洗脱曲线(图 1)可见两个对称峰 ,第一个多糖峰
峰形较矮 ,出现在外水体积 ,说明其分子量可能大
于 20 万;第二个多糖峰峰形较高 ,与第一峰完全
分开 ,出峰时间在分子量一万的标准葡聚糖之后 ,
说明分子量小于一万。收集合并第二峰得到纯化
中国天然药物　2006年 1月　第 4卷　第 1期 Chin J Nat Med　Jan.2006　Vol.4　No.1　77　
的低分子量多糖GFP2。纯化灰树花多糖GFP2为
白色粉末 ,易溶于水 ,不溶于高浓度的乙醇 、丙酮
等有机溶剂中;与苯酚硫酸显色后 ,特征吸收峰在
484 nm 。碘试剂反应不显蓝色 ,说明该多糖不是
直链淀粉 。
Fig 1　Sephadex G-200 elution curves
2.2　多糖的纯度鉴定和含量测定
2.2.1　紫外光谱　GFP2多糖配制成 1 mg·mL-1
溶液 ,400 ～ 200 nm 进行紫外扫描 ,在 280 nm、260
nm附近无明显特征吸收峰 ,说明不含蛋白质 、核
酸组分 ,也不含酚类成分 。
2.2.2　HPLC 　GFP2 多糖溶于水 , 进行 HPLC 层
析 ,柱为Shodex KS-804 ,0.1 mol·L-1NaNO3洗脱 ,示
差检测器检测。HPLC图谱为单一对称峰 ,峰面积
比为 97.18%,表明该多糖为均一组分 。
2.2.3　含量测定　GFP2多糖以硫酸-苯酚法[ 8]测
定糖含量为98.4%。
2.3　多糖的结构测定
2.3.1　单糖组成分析[ 8]
2.3.1.1　薄层色谱　GFP2多糖5 mg 以2 mol·L-1
三氟乙酸封管水解 3 h ,减压抽干三氟乙酸 ,得水
解物 ,溶于水进行硅胶薄层色谱分析 ,展开系统为
乙酸乙酯-醋酸-甲醇-水(12∶3∶3∶2),苯胺-邻苯
二甲酸显色。薄层色谱结果仅显示一个斑点 , R f
值与D-葡萄糖相同 ,说明由葡萄糖构成 。
2.3.1.2　气相色谱　多糖水解物制成糖醇乙酸酯
衍生物 ,进行气相色谱分析 ,色谱柱为 HP-5%苯甲
基硅烷毛细管柱(30 m ×0.5 mm ×0.25 μm),N2流
速为恒流模式 1.3 mL·min-1 , 程序升温:150 ～
190 ℃, 1 ℃·min-1;190 ～ 230 ℃, 10 ℃·min-1;检
测器为 FID。GC分析也只有葡萄糖一个峰 ,与薄
层色谱结果一致。表明灰树花多糖 GFP2为葡聚
糖。
2.3.2　糖苷键构型分析
2.3.2.1　多糖的红外光谱　GFP2 多糖 2 mg 与
KBr压片 ,于4 000 ～ 400 cm-1进行红外扫描 ,结果
显示多糖的特征吸收峰 ,3 396 cm-1的宽峰是 O-H
伸缩振动 , 2 932 cm-1 的峰是 C-H 伸缩振动 ,
1 630 ～ 1 660 cm-1的吸收峰说明是糖的水化物 ,
1 400 ～ 1 200 cm-1不太尖的吸收峰是 C-H 变角振
动 ,1 200 ～ 1 000 cm-1间比较大的 4个峰是 C-O 伸
缩振动 ,且说明其糖环构型为吡喃型(呋喃型糖环
在此区间上只有两个强吸收峰), 926 cm-1的吸收
峰是 D 型吡喃葡萄糖的非对称环伸缩振动的特征
吸收峰 ,而 846 cm-1的吸收峰表明糖苷键可能为α
型(β型糖苷键的吸收峰在890 cm-1左右处)[ 8] ,说
明灰树花多糖 GFP2可能为α-葡聚糖 。
2.3.2.2　13C-NMR光谱分析　取 GFP2多糖 30 mg
溶于 0.5 mL D2O中 ,测定13CNMR光谱 ,C1的 2个
强吸收峰分别为 102.507和 100.347 ,都处在δ103
以下 ,这说明GFP2的糖苷键类型主要是α型(α型
C1信号在 δ103 以下 , β 型 C1 信号在 δ103 以
上)[ 8] 。
2.3.3　单糖连接方式分析
2.3.3.1　高碘酸氧化　取 GFP2 多糖 20 mg , 加
0.015 mol·L-1高碘酸钠溶液 25 mL , 4 ℃暗处进行
氧化反应 ,用分光光度计在223 nm处测定光密度 ,
至光密度不再下降即反应完全 ,加乙二醇终止反
应还原剩余的高碘酸 ,用 0.01 mol·L-1 NaOH 溶液
滴定甲酸释放量 。GFP2多糖平均每摩尔糖基消
耗高碘酸 0.820 mol ,生成甲酸 0.162 mol ,推测含 1
※3和 1※6糖苷键 ,也可能含有 1※2或 1※4 糖
苷键[ 8] 。
2.3.3.2　Smith降解　高碘酸氧化反应液经完全
酸水解 、NaBH4还原 、乙酰化后 ,进行 GC分析 。发
现产物有甘油 、葡萄糖和赤藓醇 ,说明含有 1※3 ,1
※6和 1※4糖苷键[ 8] 。
2.3.4　多糖分子量测定
采用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)。色谱柱
为Ultrahydrogel Linear(300 mm ×7.8 mm),流动相
为0.1 mol·L-1硝酸钠 ,流速 0.9 mL·min-1 ,柱温
45 ℃。样品溶解于流动相中 ,用微孔过滤膜过滤
后进样。分子量校正曲线所用标准品为 Dextran
系列 ,测定结果 GFP2多糖的分子量为 2600。
2.7　多糖的抗肿瘤活性研究
取小鼠 180只 ,按移植性肿瘤研究法[ 9]接种
S180 、Heps 、EAC实体型 ,接种后 24 h称鼠重 ,并随
机分为 15组 ,空白对照组与天地欣(5 mg·kg-1)组
分别为阴 、阳性对照组 ,GFP2多糖组设高 、中 、低 3
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个剂量组(9 ,3 ,1 mg·kg-1)。接种 24 h后 iv给药 ,
每天一次 ,共给药 8次 ,于停药后第 2天颈椎脱臼
处死荷瘤小鼠 ,称重 ,并分离瘤块 ,称重 ,按下式计
算肿瘤生长抑制率:肿瘤抑制率(%)=[(C-T)/
C] ×100%,其中 C为对照组平均瘤重(g),T 为实
验组平均瘤重(g)。所得数据进行统计学处理(t
检验)。
实验结果见表 1 , 与生理盐水对照组相比 ,
GFP2(9 ,3 mg·kg-1)组 、天地欣组皆有一定的抑制
所选瘤株的肿瘤生长作用(P <0.05),GFP2 组与
天地欣组对小鼠体重增长无明显影响 ,即不抑制
小鼠体重增长 。
Table 1　The antitumor activity of GFP2(n=12)
Tumor st rain Group Dosage(mg·kg-1) Weight before Weight after Weight of tumor Inhibit ion rate to tumor(%)
Heps NS 19.80±1.62 27.10±1.85 1.73±0.32 0.00
Tiantixin 5 19.50±1.27 27.40±1.51 1.12±0.33＊＊ 36.90
GFP2 9 19.50±1.43 27.20±1.99 1.26±0.33＊＊ 25.31
GFP2 3 19.50±1.51 27.60±2.17 1.31±0.30＊＊ 21.10
GFP2 1 19.60±1.26 27.20±1.62 1.41±0.38 17.68
EAC NS 19.80±1.23 27.40±1.43 2.01±0.57 0.00
Tiantixin 5 19.40±1.35 27.10±2.33 1.27±0.54＊＊ 36.90
GFP2 9 19.70±1.49 26.80±2.35 1.50±0.34＊ 25.31
GFP2 3 19.56±1.51 27.44±1.88 1.59±0.59 21.10
GFP2 1 19.67±1.58 27.00±2.12 1.66±0.50 17.68
S180 NS 19.30±1.42 27.40±2.41 1.66±0.44 0.00
Tiantixin 5 19.70±1.42 27.10±2.23 1.07±0.25＊＊ 35.76
GFP2 9 19.90±1.45 27.40±3.20 1.22±0.31＊ 26.56
GFP2 3 19.56±1.13 27.00±2.65 1.27±0.45 23.74
GFP2 1 19.78±1.64 27.00±2.24 1.38±0.41 17.00
＊P<0.05;＊＊P<0.01 vs negat ive control group
3　讨　论
灰树花菌丝体粗提物呈黄褐色 ,要获得纯化
的多糖 ,首先要进行脱色。发酵来源的色素大多
为酚类物质 ,干扰多糖的分离纯化与含量测定 ,常
用脱色方法有:活性炭吸附 、DEAE-纤维素柱层析
及双氧水氧化等 。活性炭吸附量大 、分离效率高 ,
常用于水溶性成分的分离 ,但酚型化合物多呈负
性离子不被活性炭吸附 ,而且活性炭有可能吸附
多糖而损失。双氧水氧化脱色耗时长 ,脱色不完
全 ,有可能影响多糖的生物活性。离子交换纤维
素和离子交换树脂能取得较好的脱色效果 ,但色
素洗脱困难 ,其原因可能是层析介质被毒化 ,逆转
困难 ,难以重新获得交换能力[ 10] 。HP20是苯乙烯
类大孔吸附树脂 ,对灰树花原料中的色素吸附量
大 ,操作条件温和 ,解吸容易 ,树脂用乙醇洗涤即
可再生 ,解吸液浓缩可得到色素固体 ,利于对色素
的进一步研究。HP20 脱色后的多糖液再用离子
交换纤维素脱色 ,减少色素对介质的毒化 ,介质可
再生 。两种介质联用获得无色的灰树花多糖 。
报道具有抗肿瘤作用的葡聚糖如香菇多糖和
裂褶多糖都是 β-葡聚糖[ 11] ,一般是以 β-1 , 3 主链
为结构 ,带有 β-1 , 6 侧链的梳状分子 。一般认为
多糖的生物活性很大程度上取决于其分子量大
小 ,通常分子量在 100 ～ 200 kD之间的多糖片段有
较高的生物活性 ,而相同来源的分子量在 5 ～ 10
kD 之间的多糖片段无生物活性[ 11] 。文献报
道[ 1 , 8]的活性灰树花多糖均为 β-葡聚糖 ,分子量
从几万到几百万不等。我们分离得到的灰树花多
糖GFP2为α-葡聚糖 ,分子量仅为 2600 ,但荷瘤小
鼠肿瘤生长抑制实验表明仍具有良好的抗肿瘤活
性 ,如此小分子量同时又具有活性的α型灰树花
多糖尚未见报道。除牛膝多糖(分子量约3 000)等
少数几种外在其他多糖研究中也未见报道过低分
子量的活性多糖。推测 GFP2虽然分子量较低 ,但
可能具备与受体结合所必须的特异性寡糖片段 ,
所以具有抗肿瘤活性。
小分子的灰树花多糖具有很好的水溶性 ,注
射方便 ,不产生局部刺激性 ,具有较好的开发前
景。
中国天然药物　2006年 1月　第 4卷　第 1期 Chin J Nat Med　Jan.2006　Vol.4　No.1　79　
参 考 文 献
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Separation , Purification and Antitumor Activities of Low
Molecular Weight Polysaccharide from Grifola frondosa
CHEN Xiang-Dong , LIU Xiao-Wen , WU Wu-Tong＊
School of Life Science and Technology , China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 , China
【ABSTRACT】　AIM:To separate and purify low molecular weight poly saccharide from Grifola frondosa.METHODS:The polysac-
charide was decolored by macroporous resin and separated by Sephadex G200 , and examined with UV , IR , TLC , HPLC and GC.RE-
SULTS:A colorless polysaccharide(GFP2)was obtained.MW of GFP2 was only 2600.TLC analysis of the acid hydrolyzed product and
GC analysis of the acetylized product showed that the polysaccharide was composed of D-glucose.IR spectrum revealed it containedα-glu-
cosidic bonds.Glucose was linked byα-1 , 3 , α-1 , 6 ,α-1 , 4-glucosidic bonds in GFP2.GFP2 showed some antitumor activity to S180 ,
EAC and HEPS.CONCLUSION:A kind of low MWα-glucan(GFP2)was obtained from Grifola frondosa mycelium and showed antitu-
mor activity.
【KEY WORDS】　Grifola frondosa mycelium , Polysaccharide , Purification , Characterization , Low molecular weight , Antitumor
【Foundation Item】　This project was supported by the Cultivation Fund of the Key Scientific and Technical Innovation Project , Ministry
of Education of China(No.130105).
80　　Chin J Nat Med　Jan.2006　Vol.4　No.1 中国天然药物　2006年 1月　第 4卷　第 1期