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瘤果黑种草子提取物对慢性阻塞性肺病大鼠模型肺部炎症的影响



全 文 :种模型可作为研究抑郁症的主要模型[11]。该模型对抗抑郁
药有较高的选择性和特异性,药理作用时程与临床相吻合,
动物的行为表现颇似抑郁症病人的某些特征,用于抑郁症
和抗抑郁药的研究是比较理想的模型[2]。百事乐高、中剂
量组均具有明显的增加模型小鼠自主活动数、缩短模型小
鼠悬尾不动时间及游泳不动时间的作用,说明百事乐胶囊
具有一定的抗抑郁活性。两种模型的结果均提示百事乐胶
囊有良好的改善抑郁症症状的效果。
中医认为“郁症未有不伤肝者”,因此抑郁症的治疗多
用疏肝健脾方法[12]。方中姜黄味苦、辛,性温;归脾、肝
经;功能破血行气。主血瘀气滞诸证,主要成分姜黄素具
有抗抑郁作用,其作用发挥与单胺神经系统有关。贯叶连
翘味苦、涩,性平;归肝经;具有清心明目、调经活血、
止血生肌、解毒消炎的功效。现代药理研究表明:贯叶连
翘具有抗抑郁、抗病毒、抗菌、镇痛等作用;人参甘微苦、
温;归肺、脾心、肾经;功能大补元气,固脱生津,安神,
用为佐使,佐君药之升,而防诸药之耗伤气津。方中各药
调和药性,通过多种有效成分的合理、有机的组合,多途
径地作用于机体,促使其最大限度的发挥抗抑郁功效。
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瘤果黑种草子提取物对慢性阻塞性肺病大鼠模型肺部炎症的影响
耿东升, 李学强, 陈雪莲, 陈 明
(新疆军区联勤部药品仪器检验所,新疆 乌鲁木齐 830063)
收稿日期:2013-06-17
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30960512)
作者简介:耿东升 (1959—) ,男,硕士,主任药师,硕士生导师,研究方向:中药与抗炎免疫药理。Tel: (0991)4975278,E-mail:
dongsheng811@ sina. com
摘要:目的 观察瘤果黑种草子提取物 (油脂、非油脂)对大鼠慢性阻塞性肺病模型肺部炎症的影响。方法 采用
气管内滴入脂多糖 (LPS)后雾化吸入木瓜蛋白酶建立慢性阻塞性肺病大鼠模型,28 d后分别灌胃给药治疗,正常组
和模型组给予生理盐水,每天给药 1 次,连续给药 20 d。观察各组大鼠的一般状况,HE染色观察肺组织的病理形态
学改变,取支气管肺泡灌洗液 (BALF)进行炎性细胞分类,酶联免疫法测定肺泡灌洗液上清液中的 IL-8、TNF-α 和
NF-κB的水平。结果 瘤果黑种草子油脂、非油脂均可改善模型大鼠的一般状况,对其肺组织的病理变化有不同程度
的减轻;肺泡灌洗液中的巨噬细胞、中性粒细胞所占比例明显下降 (P < 0. 01 或 P < 0. 05) ,IL-8、TNF-α和 NF-κB的
水平均降低 (P < 0. 01 或 P < 0. 05)。结论 瘤果黑种草子提取物 (油脂、非油脂)有一定的抗慢性阻塞性肺病大鼠
模型肺部炎症作用,其机制可能与减弱炎性细胞对 LPS的反应,抑制炎症因子的合成和释放有关。
关键词:瘤果黑种草子;油脂;非油脂;慢性阻塞性肺病;大鼠模型;抗炎
中图分类号:R285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)08-1758-04
doi:10. 3969 / j. issn. 1001-1528. 2014. 08. 046
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慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary dis-
ease,COPD)是以气流受限为主要特征,与肺部的异常炎
症反应有关[1]。目前认为气道慢性炎症反应是造成慢性阻
塞性肺病的主要原因,炎症细胞的趋化、激活及炎症因子
的释放是慢性阻塞性肺病气道慢性炎症的中心环节[2]。本
实验将采用脂多糖加雾化吸入木瓜蛋白酶建立慢性阻塞性
肺病大鼠模型探讨瘤果黑种草子提取物 (油脂、非油脂)
对该疾病肺部炎症的影响,并初步研究其抗炎作用机制。
1 材料
1. 1 药物与试剂 瘤果黑种草子购自新疆和田墨玉县,经
新疆中药民族药研究所研究员李晓瑾鉴定为 Nigella Glandu-
lifera Freyn的种子,批号 2011308;称取干燥已粉碎黑种草
子置于超临界 CO2 萃取釜中,经预实验确定萃取条件 (萃
取温度 40 ℃,萃取压力 29 MPa,解析压力 I 12 MPa,温度
56 ℃,解析压力 II 6 MPa,温度 50 ℃,萃取时间 2 h,)至
萃取物不再增加为止,收集超临界萃取物即为黑种草子中
的油脂类,油脂类加入 2%吐温 - 80,配成相应给药质量
浓度溶液;萃取釜中的草子即为黑种草子的非油脂类,非
油脂类溶于 0. 5% CMC-Na,配成相应给药质量溶液;戊巴
比妥钠 (25 g /瓶,中国医药集团上海化学试剂公司,批号
F20030816) ;脂 多 糖 (lipopolysaccharides, LPS) (10
mg /支,美国 Sigma公司,批号 L2880) ;木瓜蛋白酶 (5 g /
瓶,美国 Sigma 公司,批号 20120630) ;氨茶碱 (0. 1 g /
片,四川锡成药业有限公司,批号 11070203) ;大鼠 TNF-
α、IL-8、NF-κB 酶联免疫分析试剂盒,购于上海依科赛生
物科技有限公司。
1. 2 动物 SD大鼠,雄性,清洁级,体质量 180 ~ 220 g,
购自于新疆医科大学实验动物中心,生产许可证号为
SCXK (新)2011-0004。
1. 3 仪器 AB104-N 型电子天平 (梅特勒-托利多仪器有
限公司) ;3K30 型低温超速离心机 (美国 Sigma 公司) ;
HV-20 型无油空压机 (济南浩伟实验仪器有限公司) ;
xMark酶标分析仪 (美国 BIO-RAD 公司) ;CX31 光学显微
镜 (日本 OLYMPUS公司)。
2 方法
2. 1 慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立[3-6] 造模组于实验
第 l、15 日,采用 0. 3%戊巴比妥钠溶液 0. 01 mL /g腹腔注
射麻醉大鼠后仰卧位固定于操作台,在无菌条件下切开颈
部正中皮肤,钝性分离各层组织后暴露气管,1 mL注射器
针头刺入大鼠气管软骨环间隙,缓慢注入 1 mg /mL LPS
200 μL于气管内,正常对照组在相同条件下注入等体积生
理盐水,后即刻缝合切口并做消毒处理,注药后将大鼠直
立,左右旋转 3 min,使药液在肺部分布均匀,清醒后常规
饲养 3 d后各组大鼠雾化吸入木瓜蛋白酶 5 g /L,每 5 只大
鼠2 mL,每次 10 min,隔日重复 5 次,造模期 28 d。
2. 2 分组与给药 将 56 只大鼠随机分成 7 组 (每组 8
只) ,分别为正常对照组、模型组、氨茶碱阳性对照组、油
脂低、高剂量组,非油脂低、高剂量组,造模结束后各组
分别灌胃给药 1 次 /d,连续 20 d。正常对照组和模型组灌
胃等体积的生理盐水。
2. 3 一般状况观察 观察各组大鼠在给药 20d 期间体质
量、毛色、活动量、对外界的灵敏度、饮食、饮水、呼吸
状态等状况。
2. 4 标本采集与处理[7-11] 采用 0. 3%戊巴比妥钠溶液腹
腔注射麻醉后,股动脉放血处死动物。沿气管打开胸腔分
离出肺组织,结扎左侧支气管,将 3 mL生理盐水由支气管
注入右肺,用手轻揉捏肺脏约 30 s,随后抽取灌洗液,重
复 2 次,回收约 4 mL。取左肺 10%中性甲醛固定后送病
理。将灌洗液 4 ℃下以 1 500 r /min低温离心 15 min,留取
上清液 - 70 ℃冰冻,备检,余液取细胞沉渣进行炎性细胞
分类。
2. 5 各组大鼠肺泡灌洗液中相关指标检测[10] 各组大鼠
肺泡灌洗液离心后取细胞沉渣进行瑞士-吉姆萨染色涂片,
在光学显微镜下观察 100 ~ 200 个细胞,然后对炎性细胞进
行分类;采用 ELISA法检测各组大鼠肺泡灌洗液上清液中
TNF-α、IL-8 和 NF-κB 的水平,各指标均严格按照试剂盒
说明书操作测定。
2. 6 肺组织病理学观察[12] 取左肺下叶用 10%中性甲醛
固定,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,4 μm 厚度连续切片 2
张,进行 HE染色,作病理切片检查。光学显微镜下观察
大鼠肺组织病理形态学改变并作比较。
2. 7 统计学处理 实验数据所有计量资料采用 (x ± s)表
示,组间差异采用 SPSS 17. 0 统计软件进行单因素方差分
析,方差齐采用 LSD-t 检验,方差不齐采用 Tamhane’s T2
检验,所有统计检验均为双侧概率检验,以 P < 0. 05 (双
尾)为差别有统计学意义。
3 结果
3. 1 大鼠一般状况观察 正常对照组大鼠活泼好动,毛发
光泽,进食、进水正常,呼吸平稳,实验期间体质量稳定
增加;模型组大鼠拱背竖毛疲软,被毛萎黄有脱落,进食
进水量减少,活动性较差,精神萎靡,经常伴有咳嗽及喷
嚏,呼吸急促,体质量增长缓慢。油脂、非油脂各给药组
和氨茶碱组大鼠的生存状况明显好于模型组。
3. 2 对慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞的影响
模型组大鼠肺泡灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞所占比
例显著升高,淋巴细胞比例显著降低,与正常组比较有统
计学意义 (P < 0. 01) ;氨茶碱组、油脂和非油脂低、高剂
量组均可使巨噬细胞、中性粒细胞所占比例明显降低,淋
巴细胞比例明显升高,与模型组比较有统计学意义 (P <
0. 01,P < 0. 05) ,结果见表 1。
3. 3 对慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平的
影响 模型组大鼠肺泡灌洗液上清液中 TNF-α、IL-8 和 NF-
κB的水平显著升高,与正常组比较有统计学意义(P <
0. 01) ;氨茶碱组、油脂和非油脂低、高剂量组均可不同程
度使慢性阻塞性肺病模型大鼠的 TNF-α、IL-8 及 NF-κB 的
水平降低,与模型组比较具有统计学意义 (P < 0. 01,P <
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0. 05) ,结果见表 2。
表 1 对慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中炎性细胞的影
响 (x ± s,n =8)
组别
剂量 /
(mg·kg - 1)
炎性细胞分类
巨噬细胞 中性粒细胞 淋巴细胞
正常 - 0. 18 ± 0. 03 0. 11 ± 0. 01 0. 71 ± 0. 03
模型 - 0. 34 ± 0. 02▲▲ 0. 20 ± 0. 02▲▲ 0. 45 ± 0. 03▲▲
氨茶碱 71. 5 0. 22 ± 0. 02** 0. 15 ± 0. 02** 0. 63 ± 0. 02**
油脂 193 0. 29 ± 0. 04* 0. 19 ± 0. 02 0. 52 ± 0. 05*
772 0. 25 ± 0. 02** 0. 15 ± 0. 03** 0. 60 ± 0. 02**
非油脂 450 0. 24 ± 0. 03** 0. 16 ± 0. 03** 0. 60 ± 0. 04**
1 800 0. 29 ± 0. 03* 0. 17 ± 0. 02* 0. 54 ± 0. 03*
注:与正常对照组比较,▲▲P < 0. 01,▲P < 0. 05;与模型组比
较,**P < 0. 01,*P < 0. 05
3. 4 对慢性阻塞性肺病大鼠肺组织病理形态学的影响 大
体标本肉眼所见:正常对照组大鼠两肺外表光滑柔软,呈
淡粉肉色,肺部体积大小适中,抽吸灌洗液时弹性较好;
模型组大鼠两肺外表粗糙略硬,呈暗红偏紫并有凹凸不平
苍白灶,肺部体积明显增大,弹性较差。给药 20 d 后,油
脂和非油脂各治疗组大鼠双肺外表较光滑、弹性较好、体
积无明显改变,与模型组比较总体改善较明显,但比氨茶
碱组效果差。光镜 HE 染色所见:正常对照组支气管黏膜
上皮细胞排列整齐,支气管黏膜下未见明显炎细胞浸润,
表 2 对慢性阻塞性肺病大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-8
及 NF-κB水平的影响 (x ± s,n =8)
组别
剂量 /
(mg·kg - 1)
TNF-α /
(ng·mL -1)
IL-8 /
(ng·mL -1)
NF-κB /
(ng·mL -1)
对照 - 0. 23 ± 0. 02 0. 49 ± 0. 07 0. 40 ± 0. 03
模型 - 0. 37 ± 0. 05▲▲ 0. 98 ± 0. 05▲▲ 0. 86 ± 0. 24▲▲
氨茶碱 71. 5 0. 27 ± 0. 03** 0. 59 ± 0. 06** 0. 52 ± 0. 13**
油脂 193 0. 31 ± 0. 02 0. 84 ± 0. 15 0. 63 ± 0. 22
772 0. 30 ± 0. 05* 0. 81 ± 0. 14* 0. 58 ± 0. 11*
非油脂 450 0. 30 ± 0. 04** 0. 68 ± 0. 06** 0. 56 ± 0. 17**
1 800 0. 31 ± 0. 05* 0. 80 ± 0. 15* 0. 62 ± 0. 16*
注:与正常对照组比较,▲▲P < 0. 01,▲P < 0. 05;与模型组比较,**P <
0. 01,* P <0. 05
肺泡壁完整,气管纤毛无损伤脱落,肺泡结构连续,肺泡
腔无扩大。慢性阻塞性肺病模型组支气管黏膜上皮变性坏
死脱落,杯状细胞增生,局部有鳞状上皮化生,炎细胞浸
润 (淋巴细胞为主) ,管壁肌层断裂,肺泡腔、支气管腔
有渗出物,肺泡壁肌层断裂、扩张融合,肺组织结构破坏
明显。给药 20 d 后,油脂、非油脂各治疗组大鼠炎性细
胞浸润较少,有部分肺泡扩张融合,有些肺泡腔有部分扩
大,气管内黏膜纤毛细胞数量较多,排列较整齐,肺组织
结构破坏有不同程度的缓解,但比氨茶碱改善效果差,见
图 1。
图 1 光镜下肺组织病理学改变 (HE ×100)
4 讨论
目前,国内外对果黑种草、黑种草的研究已较多,但
对于瘤果黑种草仅限于部分化学及醇提物的体外抗氧化、
黑种草子油抗血栓作用的研究,而该药关于慢性阻塞性肺
病药理作用有效部位的研究,并未见报道。本实验首次对
瘤果黑种草子提取物进行了慢性阻塞性肺病相关作用机制
的研究。
本实验在借鉴国内外建立慢性阻塞性肺病动物模型方
法的基础上加以改进,采用气管内注入 LPS 和雾化吸入木
瓜蛋白酶联合复制慢性阻塞性肺病模型[13-15],病理组织学
观察发现模型大鼠出现慢性支气管炎及肺气肿的特征性改
变:支气管管壁结缔组织增生,平滑肌增厚,支气管纤毛
上皮呈锯齿样增生增厚并有脱落,可见巨噬细胞和淋巴细
胞浸润,肺泡结构紊乱,肺泡间隔破裂,肺泡腔不规则扩
大,部分相互融合成肺大泡等,证实慢性阻塞性肺病大鼠
模型建立成功。经过瘤果黑种草子油脂、非油脂治疗后,
模型大鼠肺组织病理改变程度明显减轻,肺泡巨噬细胞、
中性粒细胞所占炎性细胞比例与模型组相比明显降低,同
时该药物也降低了大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-8 与 NF-κB
的水平,实验结果说明瘤果黑种草子油脂、非油脂有减轻
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慢性阻塞性肺病大鼠模型肺部炎症的作用,其抗炎机制可
能与减弱了肺组织内的巨噬细胞对 LPS 的反应,减少炎症
因子的合成和释放有关。我们将进一步研究和确定瘤果黑
种草子油脂、非油脂发挥炎症作用的具体有效部位。
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抗骨增生片对兔膝骨关节炎软骨组织形态及Ⅱ型胶原、caspase-3表达
的影响
陈守中1, 王志文2, 王国权1, 彭 博1
(1. 唐山职业技术学院,河北 唐山 063000;2. 河北联合大学,河北 唐山 063000)
收稿日期:2013-06-17
作者简介:陈守中 (1969—),男,医学硕士,讲师,研究方向:中西医结合治疗风湿免疫疾病。Tel:13463583908,E-mail:hhhcsz@
163. com
摘要:目的 观察兔膝骨关节炎使用抗骨增生片后软骨组织及其细胞中Ⅱ型胶原、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 3
表达的变化。方法 随机将 30 只兔分为正常组 10 只 (A),另 20 只用来造模。造模组采用膝关节腔内注射 1. 6%木
瓜蛋白酶,造成兔膝骨关节炎模型。造模成功后,再将造模组随机分为模型组 (B)、抗骨增生片组 (C)(B,C,n
= 10) ,C组灌胃 0. 36 g /kg的抗骨增生片,每日 1 次;A、B组同法给予等量生理盐水。30 d后,取出兔膝关节软骨,
HE染色后观察软骨组织的病理形态,软骨组织中Ⅱ型胶原、caspase-3 的表达情况采用免疫组化法检测。结果 抗骨
增生片组软骨组织破坏程度较模型组明显减轻;C组中Ⅱ型胶原比模型组高 (P < 0. 01)、caspase-3 比模型组低 (P <
0. 01)。结论 抗骨增生片能抑制兔骨关节炎软骨病理损害的进展,修复损伤软骨可能与其上调Ⅱ型胶原、下调
caspase-3 的表达,抑制软骨细胞过度凋亡有关。
关键词:抗骨增生片;骨关节炎;软骨组织;Ⅱ型胶原;半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶 3
中图分类号:R285. 5 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)08-1761-03
doi:10. 3969 / j. issn. 1001-1528. 2014. 08. 047
1671
2014 年 8 月
第 36 卷 第 8 期
中 成 药
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August 2014
Vol. 36 No. 8