全 文 ：HPLC测定红芪药材中红芪多糖的含量
李　冰 1 , 　封士兰 1＊ , 　刘小花1 , 　马　丹 1 , 　李晓东 1 , 　胡芳弟 1 , 　张怡沛 2
(1.兰州大学药学院 ,甘肃 兰州 730000;2.山东中医药大学 ,山东 济南 250014)
收稿日期:2007-06-12
基金项目:兰州大学医学科研基金资助 ,项目编号 LZUYX200614。
作者简介:李　冰(1981～ ),女 ,硕士生 ,从事中草药制剂化学成分分析。
＊通讯作者:封士兰 ,女 ,教授 ,硕士生导师 ,电话:0931-8915683, 13993162172, E-mail:fslzyxy@public, lz.gs.cn。
关键词:红芪;多糖;含量测定;HPLC
摘要:目的:建立红芪药材中红芪多糖的含量测定方法。方法:用 HPLC法 、蒸发光散射检测器测定红芪多糖的含量。结
果:红芪多糖Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ组成均为鼠李糖 、阿拉伯糖 、木糖 、葡萄糖 、半乳糖 , 多糖的平均含量分别为 25.34%、24.23%、
15.08%、17.24%。结论:用 HPLC法可以测定红芪药材中红芪多糖的含量。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)05-0716-03
DeterminationofpolysaccaridecontentinRadixHedysaribyHPLC
LIBing1 , 　FENGShi-lan1 , 　LIUXiao-hua1 , 　MADan1 , 　LIXiao-dong1 , 　HUFang-di1 , 　ZHANGYi-pei2
(1.LanzhouUniversity, Lanzhou730000 , China;2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine, Jinan250014 , Shandong, China)
KEYWORDS:RadixHedysari;polysaccaride;assay;HPLC
ABSTRACT:AIM:ToestablishamethodfordetermingpolysaccaridecontentofRadixHedysari(HedysarumPo-
lybotrysHand-Mazz).METHODS:TodeterminecontentofRadixHedysaripolysaccaridebyHPLCandELSD.
RESULTS:ThecomposesofRadixHedysaripolysaccarideⅠ 、Ⅱ 、Ⅲ、Ⅳ arealRhamnose、Arabinose、Xylose、
Glucose、Galactose, theaveragecontentofpolysaccharidesis25.34%、24.23%、15.08%、17.24%.CONCLU-
SION:ThecontentsofRadixHedysaripolysaccarideinRadixHedysaricanbedeterminedbyHPLC.
　　红芪为豆科植物多序岩黄芪(Hedysarumpoly-
botrysHand-Mazz)的干燥根 [ 1] ,与黄芪同科异属 ,临
床常与黄芪通用 。自 1985年版 《中国药典 》开始 ,
将红芪单列为一种中药 。红芪为甘肃省地道药材 ,
分布于我省宕昌 、通渭 、漳县 、岷县 、武都 、渭源等地 ,
具有补气固表 、利尿排毒 、排脓 、敛疮生肌补气等作
用 [ 1] ,可治疗慢性肾炎蛋白尿 、糖尿病 [ 1]等。
多糖的含量测定常用的方法是苯酚 -硫酸比色
法 [ 2] 、硫酸-蒽酮比色法 [ 3]等 ,这些方法稳定性和选
择性都较差 ,且对仪器的灵敏度和操作者的实验技
能要求较高 ,因此影响实验结果的准确性 。目前未
见文献报道用 HPLC法测定红芪多糖的含量 ,本文
用 GC法测得红芪药材中红芪多糖的组成为鼠李
糖 、阿拉伯糖 、木糖 、葡萄糖 、半乳糖 ,用 HPLC法 、
ELSD检测器测定了红芪药材中红芪多糖的含量 ,
结果重现性好 ,稳定 ,分析速度快 ,此方法的建立为
红芪多糖的进一步研究奠定了基础。
1　仪器与试剂
美国 Waters2695高效液相色谱仪系列:在线脱
气机 ,四元泵 , Milennum32工作站 , 2771自动进样
器 ,柱温箱 , ShodexsugarSP0810柱(日本昭和), Al-
tech蒸发光散射检测器(ELSD2000,美国),离心机
(飞鸽牌), KQ3200DB超声波清洗器 (昆山市超声
仪器有限公司), BUCHIR-200旋转蒸发仪(瑞士),
葡萄糖对照品(购自中国药品生物制品检定所),水
为超纯水 ,其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1　多糖的制备
取红芪干燥根 ,加 95%乙醇 ,加热回流 2 h。药
渣干燥后加水煎煮 3次 ,合并煎煮液并浓缩 ,将浓缩
液分为两份:一份加入乙醇使乙醇浓度为 30%,静
置 4h后离心 ,取沉淀冷冻干燥得多糖 Ⅰ;上清液再
加乙醇使乙醇浓度为 50%,静置离心 ,取沉淀冷冻
干燥得多糖 Ⅱ;上清液再加乙醇使乙醇浓度为
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70%,静置离心 ,取沉淀冷冻干燥得多糖Ⅲ 。另一份
加入乙醇使乙醇浓度为 70%,静置 4h后离心 ,取沉
淀冷冻干燥得多糖Ⅳ,四种多糖样品分别溶于蒸馏
水中 ,各加入胃蛋白酶 , 37 ℃酶解 ,离心 ,弃去沉淀 ,
上清液除蛋白 ,除色素得各四种纯化红芪多糖 。
2.2　色谱条件
ShodexsugarSP0810柱 (300 mm×8 mm, 5
μm);流动相:纯水;柱温:90℃,流速 0.85mL/min,
载气流速 3.2 L/min,漂移管温度 115 ℃。
2.3　对照品溶液的制备
精密称取葡萄糖对照品 15.4 mg,加水溶解定
容至 10mL,作为对照品溶液。
2.4　供试品溶液的制备
分别精密称取红芪多糖 Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ 0.2 g,分
别加入 2 mol/LH2SO4 80mL,水浴 100℃水解 8 h,
水解液用 NaOH调 pH值至中性 ,加乙醇使乙醇浓
度为 80%,离心 ,取上清液 ,减压回收乙醇并浓缩至
干 ,残渣加水溶解定容至 10 mL,作为供试品溶液。
分别取对照品溶液 、供试品溶液各 30 μL用 2.2项
色谱条件测定 ,色谱图见图 1。
A B
C D E
图 1　HPLC图谱
A葡萄糖对照品色谱图 B～ E分别为红芪多糖Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ色谱图
2.5　线性关系的考察
取葡萄糖对照品溶液 30、40、60、70、80 μL分别
进样 ,按 “2.2项色谱条件 ”测定峰面积 ,以峰面积为
纵坐标 ,葡萄糖对照品进样量为横坐标(mL),进行
线性 回 归 , 回 归 方 程 为:y= -5 089 610 +
242 538.2xr=0.999(n=5), 线性范围为 46.2 ～
123.2 μg。
2.6　精密度试验
2.6.1　日内精密度　取对照品溶液 40 μL进样 ,重
复进样 5次 ,葡萄糖峰面积 RSD为 1.34%。
2.6.2　日间精密度　取对照品溶液 40 μL进样 ,每
天进样两针 , 实验 3 d。葡萄糖峰面积 RSD为
1.00%。
2.7　重复性试验
取红芪多糖 Ⅱ样品 6份 ,同 “2.4项供试品溶液
的制备 ”处理样品 ,作为供试品溶液 。各进样 30
μL,计算含量 。多糖平均含量为 24.23%, RSD为
1.43%。
2.8　回收率试验
采用加样回收法 ,分别精密称取红芪多糖 IV,
按下表量分别加入葡萄糖对照品 ,同 “2.4项供试品
溶液的制备 ”方法处理样品 ,作为加样样品溶液。
各进样 50 μL, 记录色谱图 , 计算回收率 , 结果见
表 1。
2.9　样品含量测定
2.9.1　样品组成的测定　用水煎煮红芪药材 、过
滤 、浓缩 、醇沉得到红芪粗多糖 ,再除蛋白 、除色素得
到纯化多糖 ,然后将纯化多糖水解制成糖腈乙酸酯
衍生物 ,用 GC法测得红芪药材中红芪多糖的组成
为鼠李糖 、阿拉伯糖 、木糖 、葡萄糖 、半乳糖 ,各单糖
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的百分比见表 2。
表 1　 回收率试验
样品量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
x
/%
RSD
/%
5.89
4.42 9.92 91.09
5.04 9.01 89.93
6.12
5.53 11.11 90.21 91.62 2.16
5.36 10.54 93.81
5.72
6.64 11.99 94.43
5.47 11.46 90.26
表 2　 红芪多糖中 5种单糖组成
单糖 鼠李糖/%
阿拉伯糖
/%
木糖
/%
葡萄糖
/%
半乳糖
/%
保留时间 /min 2.940 3.732 4.218 7.819 8.482
红芪多糖Ⅰ 0.41 5.92 1.97 85.94 5.75
组成比 红芪多糖Ⅱ 8.59 22.86 7.53 58.92 2.09
/% 红芪多糖Ⅲ 1.31 26.49 17.51 43.69 11.01
红芪多糖Ⅳ 1.36 11.75 1.12 73.86 11.91
2.9.2　样品含量测定　分别取红芪多糖Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、
Ⅳ样品各 2份 ,同 “2.4项供试品溶液的制备 ”处理
样品 ,作为供试品溶液。用 0.45 μm微孔滤膜过
滤 ,分别取续滤液 30 μL,注入高效液相色谱仪 ,按
上述色谱条件测定 ,计算样品中红芪多糖的含量 ,结
果见表 3。
3　讨论
3.1　由于实验所用的 shodex柱要求流动相为纯
水 、乙醇(<20%)、乙腈(<20%),也可以用盐。本
实验选用了不同的流动相 ,结果纯水做流动相时峰
形最好 ,柱压稳定 ,因此选用纯水为流动相。
3.2　在整个实验过程中 ,多糖的水解是很关键的一
步 , H2SO4的浓度不能过高 ,否则会引起糖的炭化 ,
也会使色谱图中出现较多的杂峰 ,但 H2SO4的浓度
太低 ,则多糖水解不完全 ,使分析结果偏低 ,因此选
用 2 mol/L的 H2SO4溶液水解 8h。
3.3　在选定的水解条件下水解得到的葡萄糖最多。
而其余几种糖可能水解不完全 ,由于在组成中比例
不大 、部分又不是以单糖形式存在 ,所以在我们的实
验中无法检测到 ,只能检测到葡萄糖。由于 GC法
的样品前处理较复杂 ,操作过程中误差较大 ,只能作
为其相对含量 ,而本 HPLC法前处理简单 ,回收率较
好 ,因此我们结合了 GC和 HPLC两种方法 ,以葡萄
糖为对照 ,得到了样品多糖的绝对含量 。
3.4　我们用苯酚 -硫酸法测定了 4种红芪多糖的含
量 ,与 HPLC法比较结果发现苯酚 -硫酸法测定结果
均偏高 2倍左右 ,此法选择性不高 ,测定结果中可能
包括与苯酚-硫酸反应并在 490nm有吸收的某些杂
质的量 ,而 HPLC法测得的只是单糖的含量 , 因此
HPLC法测得的结果比较准确。
表 3　 红芪药材中红芪多糖的含量(n=6)
样品 取样量/g
HPLC测定的葡
萄糖含量 /%
葡萄糖在多糖
中的百分比 /%
计算得红芪
多糖的含量 /%
苯酚-硫酸法测定的
红芪多糖含量 /%
红芪多糖Ⅰ 1# 0.201 8 24.85
85.94 28.92 55.36
2# 0.201 1 24.88 28.95 52.21
红芪多糖Ⅱ 1# 0.211 3 13.89
58.92 23.57 56.45
2# 0.206 1 13.00 22.06 58.27
红芪多糖Ⅲ 1# 0.199 6 8.48
43.69 19.41 33.34
2# 0.201 3 8.44 19.32 37.26
红芪多糖Ⅳ 1# 0.206 2 11.06
73.86 14.97 35.28
2# 0.203 5 16.74 22.66 39.14
参考文献:
[ 1] 　中国药典 2005年版一部 [ S].2005:104.
[ 2] 　刘金荣 ,赵文彬 ,江发寿 ,等.不同生长期栽培甘草中多糖的含
量测定 [ J] .中成药, 2005, 27(6):708-710.
[ 3] 　白云娥 ,王　毅 ,刘许媛 ,等.冬虫夏草 、亚香棒虫草中多糖的
含量测定 [ J] .中国医院药学杂志 , 2001, 21(1):19-20.
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