全 文 ：广枣总黄酮对小鼠胸腺细胞凋亡及
腺苷脱氨酶 ( ADA)活性的影响
李嫔　田国才　林娜　及金宝　崔淑兰
【摘要 】　目的　研究蒙药广枣总黄酮 ( TFC)对地塞米松 ( DEX )诱导的小鼠胸腺细胞凋亡及胸腺
细胞内腺苷脱氨酶 ( ADA )活性降低的免疫调节作用。方法　 将小鼠分为 DEX组、 TFC组、 TFC+ DEX
组和正常对照组 ,采用光镜 (计凋亡率 ,数据经方差分析 )、电镜 (形态学观察 )。 DN A琼脂糖凝胶电泳及
紫外分光光度比色法 (吸光度值经 t检验处理 )在培养 3, 6, 9, 12, 24小时动态观察下 ,研究 TFC对胸腺
细胞凋亡及 ADA活性的影响。结果　在不同的培养时间均看到 TFC抑制 DEX诱导的胸腺细胞凋亡
(P < 0. 01)及 T FC的促胸腺细胞分裂、增殖现象 ,但 TFC对细胞培养产生的自发凋亡似无抑制作用 ( P
> 0. 05); TFC可促进胸腺萎缩小鼠的胸腺细胞内 ADA活性恢复 (P < 0. 01)。结论　 TFC有提高机体
免疫功能作用 ,这对临床上应用糖皮质激素导致的免疫缺陷、重症感染及肿瘤等的治疗提供了实验依
据。
【主题词 】　广枣黄酮　　胸腺　　细胞凋亡　　腺苷脱氨酶
Ef fects of total flavones of choerospondias axillaris ( TFC) on thymocyte apoptosis and ADA act ivat ion
of mice　L i Bin, Tian Guocai ,L in Na, et al. Department of Pediatrics, First Af filiated Hospital ,Mon -
golian Medical College , Huhehot 010059
【Abstract】　Objective　 Dexame tha son is a common immunosuppressant. It can induce immunod-
eficinency in the pa tients w ho take it fo r a long time, th e causes of which have been proved due to mainly
thymus a trophy , o rigina lly thymocy te apopto sis as w ell a s ADA activity low ered. TFC is a Mongolian
tr aditiona l drug that can promo te the cell-media ted and humo ra l immune responses. In o rder to study the
effect of T FC on dexamethason induced thymocyte apopto sis in mice and the influence o f TFC on ADA
activity in the thymocytes. Methods　 The thymocy tes w ere incubated respec tiv ely fo r 3, 6, 9, 12 and 24
hour s w ith dexamethason, T FC, dexamethason+ TFC. The cells of apoptosis w ere observ ed with aptica l
the mic roscope fo r counting the propor tion of apopto sis and th e da ta tr ea ted with analy sis o f v ariance,
and the electronic micr oscopy for mo rpholog y , DNA agar ose gel elec tropho resis and ADA activ ity was
detected with spectr ophotometer (A value tr ea ted with t-test) . Results　 The results showed that T FC
could inhibit dexamethason-induced thymocy te apoptosis (P < 0. 01) and promo te prolife ration differen-
tia tion o f th e thymocy tes in differ ent periods. But TFC could no t inhibit natura l apoptosis of the incuba t-
ed cells(P> 0. 05) . In addition, TFC also could facili ta te the resto ra tion of ADA activ ation o f the thymo-
cytes in the thymus astrophy mice. Conclusion　 It can be seen that T FC can promo te th e immune re-
sponses o f th e body, w hich prov ides a pow erful evidence for the tr ea tment o f immunodefiency , se rious
infections and tumor s induced by the application of g luco-co r ticoid ho rmone in th e clinic.
【Subject words】　 Thymocyte　　 Apopto sis　　 Flavones choero spondias ax illaris　　 Adenosine
deaminase
作者单位: 010059呼和浩特 ,内蒙古医学院一附院儿科
〔李嫔 (硕士研究生 ) ,崔淑兰〕;内蒙古医学院微生物、免疫学
教研室 (田国才 ,林娜 ) ;呼和浩特铁路局生卫处 (及金宝 )
细胞 凋 亡 ( Apoptosis or pro gram cell
death )是多细胞动物发育、成熟、生命过程中所
不可或缺的细胞事件 ,机体组织是通过细胞增
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殖与凋亡的平衡使机体维持正常结构与功能的
生理性死亡过程。同样 ,细胞凋亡参与胸腺细胞
阴性选择 ,免疫耐受和维持正常免疫功能等。广
枣 为漆 树科 植物 Choerospondias axi llaris
( Roxb) Bur tt et Hill的成熟果实 ,蒙医用以主
治心悸不安 ,有行气活血 ,养血安神的作用〔1〕。
近年来 ,本室研究和报道的资料表明 ,广枣总黄
酮 ( TFC)有增强免疫的作用〔 2〕 ,可提高小鼠胸
腺细胞增殖率及增强细胞水解酶和脱氢酶活
力〔 3〕。 但 TFC对胸腺细胞凋亡及对胸腺细胞
ADA活性的影响 ,尚无报道。本研究应用光镜、
电镜形态学检查和 DNA琼脂糖凝胶电泳技术
研究了 T FC对体外培养细胞自发的和 DEX诱
导的小鼠胸腺细胞凋亡以及 DEX致胸腺萎缩
小鼠胸腺细胞内 ADA活性及胸腺重量的影
响 ,为阐明 T FC的免疫调节和临床应用提供理
论和实践依据。
材料与方法
1. 实验动物: 昆明种小鼠 ,雌雄各半 ,体重 ( 16± 2)
g ,由内蒙古大学实验动物中心提供。
2. 主要试剂: 地塞米松磷酸钠 ( DEX ,江苏兴化制
药厂 ) ;蛋白酶 K( Sigma公司 ); RNase A ( SABC) ;λ
DN A /EcoRⅠ + HindⅢ marker s(华美生物工程公司 ) ;
腺苷 ( adenosine, Sigma公司 )。
3. 药物: 广枣总黄酮注射液 ( total flav ones of cho-
ero spondia s injection) ,由内蒙古中蒙医研究所药物室
提供。
4. 小鼠胸腺细胞凋亡检测
( 1)胸腺细胞培养: 将新鲜制备的 107 /ml胸腺细
胞 6ml加入各平皿中 ,分 4组 :正常对照组 ( I) ;地塞米
松组 (Ⅱ ) ,终浓度为 10- 5mo l / L; 10- 5 mol / L DEX+
40μg /ml TFC组 (Ⅲ ); TFC组 (Ⅳ ) ,浓度为 40μg /ml
(以上各有效剂量均为预试所确定 )。 然后置 5% CO2
培养箱中 , 37℃分别于培养后 3, 6, 9, 12, 24小时取出 ,
离心 ,收获细胞备用 (在观察 TFC本身对小鼠新鲜胸
腺细胞无毒害作用后做本试验 )。
( 2)光镜检查:按 Gav rieli〔4〕等方法操作。将胸腺细
胞中加入甲醛 ,室温下固定 10分钟 ,放一滴于 APES
薄片上 ,晾干后 HE染色 ,油镜下计数 500个细胞 ,并
计数其中凋亡的细胞数 ,以计算凋亡率。
( 3)电镜检查: 将收获的胸腺细胞按常规方法制
备 ,超薄切片制作标本 ,电镜观察 (放大 4800倍 )。
( 4) DN A片段提取及电泳测定: 采用 Facchinet ti〔5〕
等方法。 简言之 ,将胸腺细胞加 5倍体积裂解液 , 50℃
水浴 1小时后 ,以酚 ,氯仿 /异戊醇抽提 , DNA溶液中
加氯化镁乙酸钠混合液和无水乙醇 , -20℃过夜。 离心
后向沉淀中加入 70%乙醇 ,洗涤后溶于 TE中 ,再加
RNase A及蛋白酶 K, 50℃ 水浴过夜。 于含溴乙锭的
1. 8%琼脂糖凝胶中电泳 1. 5小时 ,电压 60V ,紫外灯
下观察 DN A梯状带 ( DNA ladder )并照像。
5. 小鼠胸腺细胞 ADA活性及胸腺重量测定
( 1)实验分组及胸腺重量测定: 随机将昆明鼠 (雌
雄各半 ) 240只分 3组 ,每组 80只。Ⅰ 组为正常对照组 ;
Ⅱ组为地塞米松组 ,腹腔注射地塞米松 100μg;Ⅲ组为
DEX+ TFC组 ,腹腔注射 DEX( 100μg ) 1小时后 ,再注
射 TFC( 2500μg) ,连续 10天。 并每日Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ组各杀
8只 ,分别测小鼠重量 ,胸腺重量 ,并制成 107 /m l胸腺
细胞悬液备用。
( 2)胸腺细胞内 ADA活性检测:将胸腺细胞液离
心 ,弃上清 ,沉淀中加双蒸水 ,在超声粉碎机上破坏细
胞 ,离心 ,吸上清液 ,按文献〔 6〕方法 ,在 260nm紫外分
光光度下比色 ,测胸腺细胞内 ADA吸光度 (A )值。
结　　果
1. TFC体外对 DEX致小鼠胸腺细胞凋亡
的影响
( 1)电镜观察: 均为体外培养 6小时电镜
( 4800倍 )所见。 Ⅰ 组细胞形态正常 (图 1A) ;
DEX组 (Ⅱ组 )胸腺细胞变圆 ,体积缩小 ,胞浆
浓缩 ,核染色质浓集于核膜周边 ,形成凋亡小体
和空泡等 ,但细胞膜本身完整呈典型的凋亡的
形态 (图 1B) ;Ⅲ组 ( DEX+ TFC)大部分胸腺细
胞形态正常 ,一部分呈分裂、增殖像 ,少数细胞
呈凋亡的形态 (图 1C) ;Ⅳ组 ( TFC组 )可见到
明显分裂增殖像 (图 1D)。
( 2)细胞凋亡率比较:光镜下 4组体外培养
细胞凋亡率动态观察表明 , DEX诱导的细胞凋
亡在培养 3小时即出现 ,随培养时间延长至 24
小时 4组均出现凋亡。但各组曲线型不一 ,Ⅱ组
呈直线上升 ;Ⅲ组则于 9小时前呈直线升高 ,之
后趋于平稳 ,远低于Ⅱ组 ( P < 0. 01) ,而Ⅰ 、Ⅳ
组细胞凋亡率曲线相近 (图 2)。试验证明 , TFC
有抑制 DEX致胸腺细胞凋亡的作用 ,但对细
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胞培养产生的自发凋亡 ,似无明显抑制作用。
　　图 1　 TFC对小鼠胸腺细胞凋亡作用的形态学特征 (放大 4800倍 )
Fig 1. Morphologic characterization of apoptosis in murine thymocytes( 4800× )
A: Normal cont rol, B: Thym ocytes+ DEX, C: Thymocytes+ DEX+ T FC, D: Thymocytes+ T FC
　　 ( 3) DN A琼脂糖电泳结果: 在培养 6小时
时 ,Ⅱ组 ( DEX) DN A电泳后呈典型的“阶梯状”
( ladder)条带 ,与标准分子量 DNA参照物比
较 , DN A裂解为不连续的 180～ 200bp整数多
倍体的 DNA片段 ,Ⅰ 、Ⅲ 、Ⅳ组均未出现“阶梯
带” (图 3A) ;培养 12小时时 ,Ⅱ组 ( DEX)、Ⅲ组
( DEX+ TFC)均出现“阶梯带” (图 3B) ;培养 24
小时时 , 4组均出现典型“阶梯状条带” ,提示有
自然凋亡发生 (图 3C)。试验证明 , T FC在体外
可早期抑制 DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡 ,而
对细胞自发凋亡无明显影响 ,并且这一所见与
图 2结果一致。
( 4) TFC抑制凋亡的剂量依赖关系: 在
TFC抑制凋亡的试验中 ,我们曾试验过 TFC的
5种剂量 ,即终浓度分别为 8. 3μg /m l ( 50μg /
6ml ) ; 25. 0μg /m l ( 150μg /6ml ) ; 41. 6μg /ml
( 250μg /6m l) ; 83. 3μg /m l( 500μg /6ml) ,最后又
试用 40. 0μg /ml ( 240μg /6ml)。从光镜计凋亡率
及 DNA电泳结果中均显示出 , TFC 8. 3μg /ml
及 25. 0μg /ml不能抑制凋亡 ,而 T FC40μg /ml ,
41. 6μg /m l与 83. 3μg /m l均可抑制凋亡 ;并且
TFC 40μg /m l与 83. 3μg /ml剂量在对凋亡的
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抑制程度上无显著差异 (P> 0. 05) ,所以本试验
选定的 TFC剂量为 40μg /ml。
图 2　胸腺细胞凋亡率曲线
Fig 2. The curve of apoptosis
Th e th ymocytes w ere incubated wi th DEX ( 10- 5mol /L)
( Ⅱ ) ; DEX ( 10- 5 mol /L )+ T FC ( 40μg /ml ) (Ⅲ ) ; or T FC
( 40μg /ml ) (Ⅳ ) as cont rol(Ⅰ )
　　 2. TFC体内对免疫缺陷鼠胸腺细胞内
ADA活性及胸腺重量的影响:我们在给小鼠腹
腔注射 1～ 3天内 ,可见到 DEX (Ⅱ组 )及 DEX
+ TFC(Ⅲ组 )小鼠胸腺细胞内 ADA活性明显
下降 ,达最低值。 Ⅲ组 ADA活性于第 4天开始
升高 ,以后呈锯齿形上升 ,于第 10天时 , ADA
活性仍未达正常水平。 而Ⅱ 组从第 5天开始
ADA活性逐渐恢复 ,也呈锯齿形上升 ,但第 3～
10天间 ,Ⅲ组小鼠胸腺细胞内 ADA活性显著
高于Ⅱ组 ( P < 0. 01) (图 4) ,说明 TFC对 DEX
所致免疫缺陷鼠胸腺细胞内 ADA活性的恢复
有明显促进作用。 但胸腺重量在给药后Ⅱ组及
Ⅲ组均同时降低 ,从第 6～ 9天Ⅱ、Ⅲ两组胸腺
重量均开始逐渐恢复 ,两曲线平行上升 ( P> 0.
05) ,第 10天时 ,Ⅲ组小鼠胸腺重量明显增加 ,
并接近正常 ,在此剂量范围内未见 T FC有抗
DEX造成的胸腺萎缩作用 (图 5)。
图 3　 TFC对体外培养不同时间的小鼠胸腺细胞凋亡的 DNA琼脂糖凝胶电泳分析
Fig 3. Ef fect of TFC on apoptosis in murine thymocytes at dif ferent times by DNA agarose gel elect rophoresis
Th e th ymocytes were incubated for 6 h ours ( A) ; 12 h ours ( B) and 24 hours ( C)
Lan e 1: Cul tu red th ymocytes (Ⅰ ) ; Lane 2: DEX( 10- 5mol /L) (Ⅱ ) ; Lane 3: TFC( 40μg /ml) (Ⅳ ) ; Lane 4: DEX(10- 5m ol /L+
TFC( 40μg /ml) (Ⅲ ) ; Lan e 5: Markers
讨　　论
细胞凋亡是细胞在基因控制和一定的生理
或病理条件下遵循自身规律 ,有程序地自己结
束其生命的死亡。本文从光镜、电镜下呈现出典
型的形态学和 DNA片段的生化特征说明 ,在体
外用地塞米松诱导了胸腺细胞的凋亡 ,同时证
实了 T FC对小鼠胸腺细胞有明显促增殖作用。
此外 ,在 TFC与 DEX共同加入胸腺细胞培养
时 ,首次发现 , T FC有明显抑制 DEX诱导胸腺
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图 4　 TFC对小鼠胸腺细胞 ADA活性作用
Fig 4. Ef fect of TFC on ADA act ivation in murine
thymocytes
Ⅰ : Normal cont rol; Ⅱ : DEX( 100μg ) ; Ⅲ : DEX( 100μg)+
TFC( 2500μg )
图 5　 TFC对小鼠胸腺重量影响
Fig 5. Ef fect of TFC on weight of murine thymus
Ⅰ : Normal cont rol; Ⅱ : DEX( 100μg ) ; Ⅲ : DEX( 100μg)+
TFC( 2500μg )
细胞凋亡的作用 ,从而表明 TFC有调变细胞免
疫缺陷的功能。根据 Grassilli等〔7〕报道 ,在 APO
与细胞增殖间存在着深奥的关系。 已知锌之阻
断 DEX诱导的胸腺 DNA断裂是通过它促进
RNA、 DNA合成导致 T、 B淋巴细胞分裂增殖
所致〔8〕。本研究证实了 T FC在体外促进小鼠胸
腺细胞增殖 ,同时也具有抑制 DEX诱导小鼠胸
腺细胞凋亡的作用 ,提示广枣具有免疫调节功
能。 有关 T FC此两种不同的作用机制尚不清
楚 ,鉴于 bcl-2能在多种正常细胞激活后和发育
中表达 ,并且 bcl-2表达可抑制多种细胞凋
亡〔9, 10〕 ,胸腺细胞多为不成熟 T细胞 ,所以当
TFC激活胸腺细胞使其增殖后可促进 bcl-2表
达 ,以致专一性地抑制由许多刺激因素 (包括
DEX )所诱导的凋亡。提示 T FC似与丝裂原和
生长因子等免疫增强剂作用相同。因此 ,我们推
想 , TFC抑制细胞凋亡可能的机制主要与其促
进细胞分裂、增殖有关。
ADA是嘌呤核苷酸分解代谢过程中的关
键酶 ,以淋巴细胞中活性最高 , T淋巴细胞比 B
淋巴细胞活性更高。当 ADA缺乏或活性受抑制
时 ,能引起腺苷积聚 ,干扰内源性嘧啶合成 ,从
而对淋巴细胞有毒性 ,还可引起脱氧腺苷积聚 ,
导致脱氧三磷酸腺苷 ( d ATP)堆积 ,因而干扰
DNA合成 ,所以淋巴细胞中 ADA活性改变直
接影响免疫功能。 近年来发现在伤寒、结核、重
症联合免疫缺陷病、肿瘤、 SLE等均有淋巴细胞
ADA活性降低的报道 ,因此 ADA活性成为反
映机体细胞免疫功能的一个重要指标。小鼠体
内注射 DEX后其胸腺重量及胸腺细胞内 ADA
活性明显降低 ,但在腹腔注射 DEX后再注射
TFC,尽管在实验期内未见其明显抑制 DEX造
成的胸腺萎缩 ,但却能促进胸腺细胞 ADA活性
的恢复 ,有提高细胞免疫功能的作用。
鉴于糖皮质激素可体外诱导小鼠胸腺细胞
凋亡 ,同时能降低胸腺细胞的 ADA活性 ,根据
实验 , T FC能抑制前者的凋亡和促进恢复后者
所致的 ADA活性 ,以提高机体免疫功能 ,这对
临床上应用糖皮质激素等导致的免疫缺陷和重
症感染、肿瘤等的治疗 ,提供了有力的实验依
据 ;亦拓宽了蒙药广枣总黄酮的传统应用范围 ,
开辟了蒙药的应用前景。
参　考　文　献
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(收稿: 1997-09-24　　修回: 1998-02-23)
IL-5对哮喘患者痰液中可溶性细胞间
粘附分子 -1水平的影响
陈一强　施焕中
　　本研究采用随机、双盲、安慰剂对照及交叉的设计
方法 ,对 8例过敏性哮喘和 6例正常人对照者在雾化
吸入白细胞介素 -5( IL-5)后 2小时、 24小时、 48小时及
72小时收集的诱导痰液中的可溶性细胞间粘附分子 -1
( sICAM-1)水平用酶联免疫吸附法进行测定。
结果表明哮喘患者和正常人于 IL-5或载体溶液
吸入前正常人痰中的 s ICAM-1水平相差均不明显 ,但
哮喘患者显著高于后者 ,仅以载体吸入并不能使哮喘
患者痰 s ICAM-1水平升高 ,而吸入 IL-5后 2小时
sICAM-1 即明显高于吸入前基础值 ; 48小时后
sICAM-1水平达最大值 ,而这种高水平的 sICAM-1至
少可以维持 72小时。 正常人即便给予 IL-5刺激亦不
能引起其痰 sIC AM-1出现任何变化 (见附表 )。
　　附表　 IL-5对哮喘患者和正常人痰 sICAM-1水平的影响 (x-± sx )
组别 s ICAM -1(μg /L)基础值 2小时 24小时 48小时 72小时
哮喘组 IL-5 7. 0± 2. 4 8. 2± 2. 5* 10. 5± 2. 6* * 11. 9± 2. 5* * 10. 7± 2. 4* *
载体 6. 9± 2. 2 7. 0± 2. 3 6. 7± 2. 1 7. 3± 2. 5 6. 9± 2. 3
对照组 IL-5 1. 3± 0. 5 1. 3± 0. 5 1. 2± 0. 5 1. 2± 0. 5 1. 0± 0. 5
载体 1. 5± 0. 6 1. 6± 0. 6 1. 6± 0. 6 1. 6± 0. 6 1. 5± 0. 6
　　注:哮喘组 n= 8;对照组 n= 6; * P < 0. 05; * * P < 0. 01
　　哮喘的炎症机制已经受到广泛的重视 ,而任何炎症
过程都依赖于将抗原传递给相关的白细胞以及这些细
胞募集到炎症部位并粘附到靶细胞表面。这些过程都必
须依赖于细胞与细胞间的接触 ,在细胞与细胞间的接触
作者单位: 530021南宁 ,广西医科大学第一附属医院呼吸
内科
中 ,粘附分子如 s ICAM-1等的表达发挥了关健性的作
用。 本研究结果证实吸入 IL-5可以明显提高哮喘患者
的 sICAM-1水平 , IL-5导致哮喘气道炎症和气道高反
应性的一个重要机制很可能是通过 sICAM -1的作用而
实现的。
(收稿: 1998-03-15　　修回: 1998-06-30)
·391·中华微生物学和免疫学杂志 1998年 9月第 18卷第 5期