全 文 ：多棘海盘车多糖的提取及体外抑菌活性初探
周燕霞 , ＊赵丽华 , 邢翔 ,张超
(山东大学威海分校海洋学院 ,山东 威海 264209)
摘　要:目的 以威海沿海产多棘海盘车为原料 , 确定多糖的最佳提取工艺 ,并测定其抑菌活性。方法 以苯
酚-硫酸分光光度法测定多糖含量 ,考察酶解法 , 碱法 , 碱-酶结合等提取工艺的条件和优越性;采用滤纸片法
测定海星多糖体外抑菌作用。结果 氢氧化钠浓度为 1mol· L-1 , 料液比为 1∶2 , 提取 2h 时有最大产率。提
取物对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。结论 碱法优于其他制备方法;多棘海盘车粗多糖对细菌的抑制作
用具有选择性。
关键词:多棘海盘车;多糖;提取;抑菌活性
中图分类号:TQ460.6 , R965　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2009)03-0058-03
Extraction of polysaccharides from Asterias amurensis and
preliminary study on their antibiotic activities in vitro
ZHOU Yan-x ia ,ZHAO Li-hua ,XING Xiang ,ZHANG Chao
(Marine Col lege Weihai Branch S chool o f Shandong University , Weihai 264209 , China)
Abstract:Objective To explore the ex t raction technology of polysaccharides from Asterias
amurensis and study their antibacte rial activi ties in vi tro.Methods Determined by spect ro-
scopic methodolo gy wi th phenol - sulfuric acid , the po lysaccharide content w as taken as in-
specting index to select the ex t raction techno logy such as enzyma tic hydroly sis , alkali , and
alkali-enzymatic combined.Filter paper me thod w as used to test the polysaccharides antibiot-
ic activit ies in v itro.Results The opt imum ex traction techno logy w as adding 2 t imes amount
of 1 mol·L-1 sodium hydroxide , heating fo r 2h , unde r these condi tions the g reatest y ield of
starfish po lysaccharides w ould be obtained which show ed inhilito ry ef fect on S taphy lococcus
aureus.Conclusion The alkal hydro ly sis ex t raction technolog y is superio r to the o ther meth-
ods;po lysaccharides f rom Asterias amurensis show ed antibiotic activity to some kinds of bac-
teria.
Key words:Asterias amurensis;poly saccharides;ex t ract ion;antibacterial act ivity
　　海盘车(海星)属棘皮动物门海星纲 ,有
50余种[ 1] ,其中多棘海盘车具有平肝和胃 、
止痛 、镇惊功效[ 2] 。海星中已经分离出甾类
糖苷 、甾醇 、蛋白酶 、氨基酸 、生物碱等十几类
化学物质 ,并且其提取物常具有抗癌 、抗心律
失常 、降低血压 、抗菌抗病毒 、溶血等多种药
理活性[ 3] ,其中对于海星多糖的制备工艺和
抑菌活性研究较少[ 4] 。另外 ,威海近几年海
星屡次泛滥(主要品种是多棘海盘车),严重
危害贝类养殖 ,因此开发利用海星药用资源 ,
具有巨大的经济和社会效益。本文以威海海
域的多棘海盘车制备多糖 ,并对抑菌活性进
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Chin J Mar Drugs , 2009 June , Vol.28 No.3 中国海洋药物杂志 2009 年 6 月第 28 卷第 3 期
＊ 作者简介:周燕霞 ,女 ,硕士 ,讲师　Tel:13863103702;E-mail:zhouyx@sdu.edu.cn
DOI :10.13400/j.cnki.cjmd.2009.03.008
行了初步的研究 ,为今后深入研究和开发提
供依据。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　原料:多棘海盘车 ,采自山东省威海
沿海 ,由山东大学威海分校生药学专业张崇
禧教授鉴定。去除其内脏 ,洗净 ,取 7kg 置
沸水中 15s ,冷却后切成小块 ,用组织捣碎机
捣碎 ,3000r ·min-1离心 10min ,取沉淀作为
样品备用 。
1.1.2　试剂:牛肉膏 ,蛋白胨 ,胃蛋白酶(1∶
3000)等均为国产生化试剂;氢氧化钠 ,盐酸 ,
苯酚 ,硫酸 ,三氯乙酸 ,双氧水 ,氯化钠 ,醋酸 ,
葡萄糖等均为国产分析纯 。
1.1.3 　主要仪器:紫外可见分光光度计
(Spectrum752型 ,上海光谱仪器有限公司);
冷冻箱(BCD-216YH 型 ,青岛海尔股份有限
公司);生化培养箱(S PX-250B-Z 型 ,上海博
迅);高速组织捣碎机(A-88 型 ,江苏省金坛
市医疗仪器厂);高速冷冻离心机(TGL-16G-
A型 ,上海安亭科学仪器厂)等。
1.1.4　菌株:啤酒酵母 、大肠杆菌 、金黄色葡
萄球菌 、枯草芽孢杆菌均由本校微生物教研
室提供。
1.2　实验方法
1.2.1　多棘海盘车多糖的制备
1.2.1.1　酶解法:称取样品 50g ,加入适量
水 ,调 pH 至 1.5。加胃蛋白酶浓度至 50u·
g
-1 ,45℃恒温水浴中 6h。取消化液加热至
90℃灭酶活 , 冷却后调 pH 至4.0 , 5000r ·
min-1离心 15min ,取上清液 ,加 5%双氧水
脱色 ,加入量约为样品体积的 1/7 , 55℃保温
至溶液变为浅黄色 , 然后加入 2 倍体积的
95%乙醇 ,静置过夜 ,抽滤 ,取沉淀用 95%乙
醇洗 3次 ,再用无水乙醇洗 3次 ,自然干燥 ,
得粗多糖[ 4 ～ 6] 。
1.2.1.2　碱法:称取样品 50g ,加入 100mL
浓度为 1mo l·L-1NaOH 溶液 ,在 60℃恒温
水浴中搅拌 2h ,冷却后调 pH 至 4.0 , 5000r
·min-1离心 15min ,取上清液 ,以后则沿用
1.2.1.1法中程序加双氧水和乙醇 ,最后得
粗多糖[ 4 , 6] 。
1.2.1.3　碱-酶结合法:称取样品 50g ,加入
100mL 浓度为 1mol · L -1 NaOH 溶液 ,在
60℃恒温水浴中搅拌 2h ,冷却后调 pH 至 4.
0 ,5000r · min-1离心 15min , 取上清液 ,调
pH 至 1.5 , 加入胃蛋白酶(50u · g-1),在
45℃恒温水浴中维持 6h 。取消化液加热至
90℃灭酶活 ,5000r ·min-1离心 15min ,以后
则沿用 1.2.1.1法中相应程序 ,最后得粗多
糖[ 4] 。
1.2.2　多棘海盘车多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法[ 7] ,绘制标准曲线 ,得回
归方程为:A=8.64C +0.1189.r=0.9984。
1.2.3　多棘海盘车多糖体外抑菌活性的测
定
将已灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(细
菌培养基)或马铃薯培养基(真菌培养基)倒
平板 ,作为底层;取 0.2mL 培养细菌或真菌
菌液 ,均匀涂布于底层上 。将浸有不同梯度
多糖溶液的小圆滤纸片(D=5mm)分别贴在
平板相应区域 ,以无菌水的滤纸片作为对照 ,
然后将该含菌平板于 37℃恒温培养箱中倒
置培养 36h ,观察抑菌圈的大小。
2　结果与讨论
2.1　提取方法的考察
按照 1.1项操作 ,并测定多糖含量及干
膏率 ,所得结果见表 1 。
表 1　提取方法的考察
Tab 1　The selection o f ex traction methods
指标 酶解法 碱法 碱-酶结合法
多糖含量(g· g -1生药) 0.81 0.84 0.47
干膏率(%) 0.57 0.77 0.76
　　三种方法中 ,碱-酶结合法所得多糖含量
最低 ,干膏率很大 ,产品中可能含大量杂质 。
碱法比酶法提取的多糖含量高 ,操作简便 ,且
无酶残留 ,后期纯化容易[ 8] 。综上 ,确定碱法
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为本实验提取方法。
2.2　碱法提取的工艺条件优化
根据预实验结果 ,选择碱液浓度 、反应时
间 、料液比 3 个因素进行考察 ,见表 2 和表
3。
表 2　L 9(34)因素和水平表
Tab 2　The facto r-lev el table o f L9(34)
水平 因素 A碱液浓度(mol·L-1)
因素B
料液比(g·mL-1)
因素 C
保温时间(h)
1 0.5 1∶2 1
2 1 1∶4 1.5
3 1.5 1∶6 2
表 3　正交实验结果
Tab 3　Orthogonal design and results
序号 因素
A B C D
多糖含量
/ g· g -1生药
1 1 1 1 1 0.711
2 1 2 2 2 0.790
3 1 3 3 3 0.761
4 2 1 2 3 0.820
5 2 2 3 1 0.836
6 2 3 1 2 0.783
7 3 1 3 2 0.794
8 3 2 1 3 0.776
9 3 3 2 1 0.789
多糖含量
(g· g-1生药)
Ⅰ/3 0.7540 0.7750 0.7570 0.7790
Ⅱ/3 0.8130 0.8006 0.7997 0.7890
Ⅲ/3 0.7863 0.7777 0.7970 0.7857
极差 R 0.059 0.0256 0.043 0.0106
表 4　方差分析
Tab 4　Variance analy sis
指标 误差来源 偏差平方和 自由度 方差 显著性
多糖含量
(g· g -1生药)
A 0.005238 2 31 <0.05
B 0.001195 2 8 >0.10
C 0.003483 2 21 <0.10
D 0.000167 2
F0.01(2 , 2)=99 , F0.05(2 , 2)=19, F0.10(2 , 2)=9.00
　　由表 4可以看出 ,因素 A 与因素 C
有显著性差异(影响次序是 A>B),B因素没
有显著性差异。根据多糖含量极差结果及经
济成本因素 ,可以得出优化的工艺条件 A 2B1
C2 。该优化条件下 ,验证实验的结果为多糖
含量 0.825g ·g -1生药±2.29%(n=3)。
3.3　多棘海盘车多糖的体外抑菌活性
据报道 ,从多棘海盘车中分离出的皂苷
样品具有抗菌活性[ 9] ,但国内尚未有关多棘
海盘车多糖抗菌活性的报道。本实验针对几
种代表性的细菌和真菌进行了体外抑菌作用
的初步探讨 ,结果见表 5。
表 5　多糖的体外抑菌活性
Tab 5　The antibacterial action o f
poly saccha rides(cm)
多糖浓度(mg·mL-1) 30 25 20 18 15 10 0
大肠杆菌 0 0 0 0 0 0 0
金黄色葡萄球菌 1.029 0.974 0.798 0 0 0 0
枯草芽孢杆菌 0 0 0 0 0 0 0
啤酒酵母 0 0 0 0 0 0 0
　　多棘海盘车粗多糖溶液对大肠杆菌 、枯
草芽孢杆菌 、啤酒酵母没有抑制作用;当溶液
浓度高于 20mg · mL-1时 ,对金黄色葡萄球
菌有一定的抑制效果。
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(收稿日期:2008-08-24)
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