全 文 ： 大孔树脂法分离纯化大血藤中原花青素
刘景玲 1，张治海 2，李鑫 1，吴小强 1，张豫 1，舒志明 1*
（1. 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100；2. 陕西安塞县果业发展局，陕西延安，717400）
摘 要：采用大孔树脂法提取和纯化大血藤中原花青素，以吸附及解吸附能力为指标，比较 D101、HPD100、
X5、AB8、及 ADS17 五种大孔树脂对原花青素的吸附效率，通过单因素实验考察上样流速、上样浓度、洗
脱流速、洗脱剂用量及洗脱剂体积分数对提取原花青素含量的影响，优选树脂的动态吸附及解吸附条件，
并评价提取得到原花青素的纯度。结果表明，HPD100 树脂对大血藤中原花青素的吸附和解吸附效果最好，
上样流速 2BV/h，上样浓度 6mg/mL，洗脱流速 1 BV/h，洗脱剂用量 2BV 的纯化效果最好，100%乙醇的洗脱
量最大，得到原花青素的纯度是粗提物的 1.76 倍。
关键词：大血藤；原花青素；大孔树脂；纯化

Purification of the Proantho Cyanidins from Sargentodoxa
cuneata( Olive. ) Ｒehd. Et Wils. by macroporous resin
LIU Jingling1，Zhang Zhihai2，Li Xin1，Wu Xiaoqiang1，Zhang Yu1, Shu Zhiming1*
(1. College of Life Sciences of NWSUAF, Yangling, Shaanxi ,712100;
2. Fruit Industry Development Council of An’Sai County, Yan’an, Shannxi 717400)
Abstract: Proantho Cyanidins(PC) from Sargentodoxa cuneata( Olive. ) Ｒehd. Et Wils. were purified by
macroporous adsorption resin. The static adsorption and desorption capacity of 5 resins including D101, HPD 100,
AB8, X5 and ADS17 were compared and the best HPD 100 resin was chosen for purification. The optimum
parameters of dynamic adsorption and desorption for PC purification were obtained by single factor tests .The
results showed the loading rate, loading concentration, eluting rate and eluting amount were 2BV/h, 6mg/mL,
1BV/h and 2 BV respectively. The pure alcohol can wash out the most PC, and the PC purity reaches 1.76 times
than that of the crude extract.
Key Words：Sargentodoxa cuneata; Proantho Cyanidins; Macroporous adsorption resin; Purification
中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文 章 编 号:
大血藤 Sargentodoxa cuneata(live.) Ｒehd. Et Wils. 属于木通科大血藤属，其干燥藤茎入药，又名红藤、
大活血等[1]。是我国特有物种，广泛分布于我国陕西、四川、贵州、湖北、湖南、云南、广西、广东、海
南、江西、浙江、安徽等省。现代药理学研究表明，大血藤具有抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等
作用，且其对心血管系统有保护作用，可扩张冠状动脉、抑制血小板聚集[2-4]。鉴于其诸多功效及在食品、
药品、化妆品等方面较大的应用价值，大血藤引起了国内外科学工作者的广泛关注[5-6]。
截至目前，人们对大血藤的研究集中在其化学成分、药理活性、遗传多样性等方面[7-8]。化学成分研究
主要集中于总黄酮、总皂苷及酚类化合物[6，9-10]。对大血藤中原花青素（Proantho Cyanidins, PC）的开发利
用鲜见报道，原花青素属于植物多酚类物质[11]，有文献报道其具有强抗氧化活性[12]。最新报道与大血藤性
味功效相似的豆科植物鸡血藤藤茎原花青素达到粗提物干燥品重量的48.81%，其乙醇提取物抗氧化活性是
L-抗坏血酸的1.25 倍[13]，Li 等［14］研究了 45 种植物的抗氧化活性，发现大血藤甲醇提取物具有较高的抗
氧化活性，并且总酚质量分数为 52.35 mg/g，高于其它 44 种植物。本课题组前期实验结果表明大血藤藤
茎中原花青素含量高达粗提物干燥品重量的40%左右。因此，提取利用大血藤中的原花青素应用于保健品、
__________________________________________________________________________________
基金：基于中药饮片炮制品“火候”数字化描述方法的研究（2015SF243，陕西省科技攻关计划）
作者简介：刘景玲( 1979－) ，博士，讲师，研究方向: 药用植物次生代谢调控，E－mail:
jinglingliu-sm@nwsuaf.edu.cn。
通讯作者：舒志明（1965-），硕士，副教授，研究方向：药用植物栽培，E-mail：shuzhiming2298@163.com
网络出版时间：2016-10-11 11:17:52
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20161011.1117.010.html
药物和化妆品等领域具有巨大潜力。大孔树脂法具有吸附快、容量大、洗脱率高、可再生等优点[15]，因而
被广泛用于天然产物的分离纯化。本研究拟筛选大孔树脂法纯化大血藤藤茎中原花青素的最适条件，为深
入研究大血藤中原花青素化合物及产品开发提供依据。
1 实验研究
1.1 材料与试剂
大血藤购自广西贺州，切片晒干后粉碎，过 60 目筛，于-20℃保存备用。
D101、HPD100、AB8、X5、ADS17 型大孔吸附树脂购自安徽三星树脂科技有限公司；葡萄籽原花青
素分析标准品(UV≥95%)上海源叶生物科技有限公司；香兰素美国 Sigma-Aldrich 公司；其余化学试剂为国
产分析纯，水为去离子水。
1.2 主要仪器
UV-1700 紫外可见分光光度计（日本株式会社岛津制作所）；SB25-12DTD 超声波清洗机（宁波新
芝生物科技股份有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-III 循环水式多用真空
泵（郑州长城科工贸有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 制备大血藤粗提物
取大血藤粗粉，以 1:10 的料液比（kg：L）加入 70%乙醇，充分浸泡，在 40KHz 下超声提取 30min，
减压过滤，重复 3 次，合并滤液并减压浓缩，冻干，得到大血藤粗提物，得率 21.34%，其中原花青素含量
35.33 ± 0.42 %。
1.3.2 原花青素定量分析
利用香草醛-盐酸比色法[16]对原花青素进行定量分析。配制 1%(m/v)的香草醛甲醇溶液与 1mol/L 的盐
酸甲醇溶液，临用时将二者按照 1:1 体积比充分混匀，制得比色工作液。精密称取葡萄籽原花青素分析标
准品，用甲醇溶解，配制成浓度为 0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mg/mL 的标准溶液，分别取 100μL，
加入 3000μL 的比色工作液中，混匀，室温反应 30min，以甲醇做空白对照，在波长 500nm 下测定吸光值，
绘制标准曲线。
1.3.3 筛选大孔树脂
利用静态吸附与解吸附，从 D101、AB8、X5、HPD100、ADS17 中筛选出最优树脂。参照杨志娟等[17]
的方法对树脂进行预处理，称取 2.00g 预处理好的 5 种树脂，置于 250mL 锥形瓶中，分别加入 100mL 原花
青素浓度为 3mg/mL 的大血藤粗提液，密封后置于恒温摇床中，调节温度 25℃，以 60rpm 的速率振摇，分
别于加样后 5、10、15、30、45、60、90、120、150、180、360min 及 24h 取样 500ul,测定溶液中的原花青
素含量，绘制静态吸附曲线，并以 24h 时取样浓度按照如下公式计算树脂对原花青素的吸附量：
吸附量（mg/g）=（C0-C）*100/2.00
其中，C0为吸附前溶液中原花青素浓度（3 mg/mL）；C 为吸附后溶液中原花青素浓度（mg/mL）；
100 为溶液体积（mL）；2.00 为树脂质量（g）。
将上述吸附饱和的 5 种树脂重新置于 250mL 锥形瓶中，加入 70%乙醇 100mL 充分振荡摇匀，在 40KMz
下超声 30min 使原花青素解吸附，测定解吸附后溶液原花青素浓度，按照如下公式计算树脂对原花青素的
解吸附量：
解吸附量（mg/g）=C1*100/2.00
其中，C1为解吸附后溶液的原花青素浓度（mg/mL）；100 为溶液体积（mL）；2.00 为树脂质量（g）。
解吸附率=解吸附量/吸附量。
1.3.4 考察上样流速
将 5份预处理好的树脂以湿法装柱(40mL)，用超纯水充分平衡，然后将原花青素浓度为 6mg/mL 的大
血藤粗提物 640mL 分别以 1、2、3、4、5BV/h 的流速上样吸附，每 0.1BV 流出液收集 1 份，测定流出液
的原花青素浓度，绘制泄漏曲线，根据曲线确定上样流速。
1.3.5 考察上样浓度
将 5 份预处理好的树脂以湿法装柱，用超纯水充分平衡，以去离子水充分洗去杂质，然后将原花青素
浓度分别为 2、4、6、8、10mg/mL 的大血藤粗提物以 2BV/h 的流速上样吸附，每 0.5BV 的流出液收集 1
份，测定流出液的原花青素浓度，绘制泄漏曲线，根据曲线确定上样浓度。
1.3.6 考察洗脱剂体积分数
称取 1.00g 吸附饱和的 HPD100 树脂 10 份，置于 100mL 锥形瓶中，分别加入 100mL 体积分数为 10%、
20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇及无水乙醇,在 40KMz 下超声 30min，进行解吸附，
分别取样测定溶液的原花青素浓度，绘制静态解吸附曲线。
1.3.7 考察洗脱流速和洗脱剂用量
根据上样吸附的最优条件（HPD100 树脂填充 40mL 柱，上样流速 2BV/h，上样浓度 6mg/mL），制备
4份吸附饱和的树脂柱，充分平衡，以去离子水充分洗去杂质，无水乙醇以 0.5、1.0、1.5、2.0BV/h 的流速
进行洗脱，每 0.1BV 流出液收集１份，测定流出液的原花青素浓度，绘制洗脱曲线，根据曲线确定洗脱流
速及洗脱剂用量。
1.3.8 纯度测定
制备 3 份吸附饱和的层析柱，柱体积分别为 40mL、100mL、200mL。分别用无水乙醇以 1 BV/h 的流
速进行洗脱，收集洗脱峰部分的流出液，减压浓缩，于锡箔纸上烘干，取干燥样品及粗提物干燥品分别配
制成 1 mg/mL 的溶液，测定 A500，通过标准曲线计算纯度。（原花青素纯度=流出液中原花青素浓度/1mg/mL）
1.4 统计学分析
所有指标平行测定 3 次，结果以均值±标准差表示，采用 SPSS22.0 对数据进行单因素方差分析
(One-way ANVOA)，组间差异比较用 Duncan 检验。P≤0.01 认为组间具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 原花青素含量测定
以 A500 值(Y)和葡萄籽原花青素标准品浓度(X)做出回归方程为：Y= 0.2474X-0.0128，R²=0.9928。各
样品均以此法测定(图 1)，含量由回归方程计算得到。
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
原花青素浓度（mg/mL)
吸
光
度
值
(A
50
0)

图 1原花青素含量标准曲线
Fig. 1 The standard curve of PC content
2.2 树脂筛选
大孔树脂因为具有选择性好、吸附迅速、绿色环保等优势，在天然产物的提取纯化方面得到了广泛的
应用[18]。不同类型的树脂具有不同的极性、孔径、比表面积，对原花青素的吸附和解吸附能力各不相同，
且被吸附材料包含化合物的复杂性对树脂吸附率也有很大影响。本试验选择 3 种非极性和 2 种弱极性树
脂，利用静态吸附和解吸附实验考察它们对大血藤原花青素的吸附、解吸附能力，结果如表 1 所示。
表 1 五种树脂的性质及对原花青素的吸附和解吸附能力
Tab.1 The adsorption and desorption capacity of five macroporous adsorption resins for PC
树脂类型 极性
比表面积
（m2/g）
平均孔径
(nm)
饱和吸附量
(mg/g)
解吸附量
(mg/g)
解吸率(%) 吸附率（%）
D101 非极性 500～550 9～10 113.93±0.68a 92.86±0.49a 81.51±0.00a 75.95±0.00a
HPD100 非极性 650～700 80～90 110.70±0.55a 94.41±1.99a 85.28±0.02a 73.80±0.00a
AB8 弱极性 480～520 12～16 98.98±2.23b 62.54±1.64b 63.18±0.01b 65.95±0.01b
X5 弱极性 500～600 29～30 98.64±1.25b 61.47±3.97b 62.32±0.03b 65.76±0.01b
ADS17 非极性 90～150 25～30 83.82±0.95c 38.83±0.84c 46.33±0.01c 55.88±0.01c
注：每行不同的字母表示在 P≤0.01 水平上具有显著性差异。
李彦等[13]研究表明 X5 树脂对鸡血藤原花青素的吸附量为 126.51mg/g，解吸率可达 92.14%，综合考
量认为 X5 树脂分离纯化鸡血藤原花青素优于 AB8 和 D101。梁敏等[19]研究发现 HPD100 树脂分离葡萄籽
提取物中原花青素的吸附量可达 101.2 mg/g，乙醇总洗脱率达 96.5%，优于 HPD300 和 HPD400 树脂。柯春
林[20]等从 6 种大孔树脂中筛选出 HPD600 树脂，其对石榴皮原花青素的吸附率为 95.7%；梁华正等[21]筛选
发现 HPD400 树脂对太空荷叶中原花青素吸附率达到 88.21%，解吸率达到 96.83%。本试验条件下，5 种树
脂对大血藤原花青素均具有较强的吸附能力，D101 和 HPD100 树脂的吸附和解吸附量均大于其它 3 种树
脂，而解吸率和解吸附量 HPD100 高于 D101，因此，本试验选择 HPD100 树脂用于大血藤原花青素的纯
化。
2.3 上样流速对纯化大血藤原花青素的影响
不同上样流速时 HPD100 树脂的泄漏曲线如图 1 所示，当上样浓度为 6 mg/mL 时，上样流速越大穿
透点出现越早（如图 1），5 BV/h 和 4 BV/h 流速处理在流出液 6BV 之前就达到穿透点，3 BV/h 流速下流
出液体积 7.5 BV 时达到穿透点，2BV/h 流速下流出液体积为 10.5BV 时出现穿透点。表明随流速增加树脂
吸附能力变差，穿透点更早出现。因此，上样流速不宜过大。而较慢（1 BV/h）的流速使树脂达穿透点耗
时 11h，耗时间长，影响树脂吸附效率，且流速过慢易造成大血藤粗提取物在树脂柱上层析出和沉积，影
响柱床的稳定从而影响纯化效果。综合考虑，选择 2BV/h 为最适上样流速。
0
1
2
3
4
5
6
0
0.
5 1
1.
5 2
2.
5 3
3.
5 4
4.
5 5
5.
5 6
6.
5 7
7.
5 8
8.
5 9
9.
5 10
10
.5 11
11
.5 12
12
.5 13
13
.5 14
14
.5 15
15
.5 16
流出液体积（BV）
原
花
青
素
浓
度
（
mg
/m
L)
1BV
2BV
3BV
4BV
5BV

图 2 上样流速对 HPD100 树脂动态吸附原花青素的影响
Fig.2 The influence of loading rate on the PC dynamic adsorption of the HPD100 resin
2.4 上样浓度对纯化大血藤原花青素的影响
图 2为不同浓度的大血藤粗提取物以 2BV/h 流速上样所得泄漏曲线。上样浓度为 10 mg/mL 和 8mg/mL
时，原花青素泄漏较多，树脂过早达到穿透点，且容易造成样品的浪费及柱床堵塞；而浓度为 2mg/mL 和
4mg/mL 时，树脂吸附效率较低进而影响纯化效率。综合纯化效率及经济效益，认为上样浓度以 6mg/mL
为宜。

图 3 上样浓度对 HPD100 树脂动态吸附原花青素的影响
Fig.3 The influence of loading concentration on the PC dynamic adsorption of the HPD100 resin
2.5 洗脱剂体积分数对纯化大血藤原花青素的影响
从纯化原花青素的经济性、安全性考虑，本试验选用廉价、安全、低毒的乙醇溶液洗脱 HPD100 树脂
上的大血藤原花青素。采用体积分数为 10%-100%的乙醇分别对吸附饱和的 HPD100 树脂进行静态解吸附，
考察乙醇浓度对大血藤原花青素解吸率的影响。结果如图 3 所示。原花青素解吸率随着乙醇浓度增大而显
著增加，乙醇浓度为 70%、80%和 90%时原花青素解吸率无显著变化，而 100%乙醇洗脱效果最好。
a
bbbc
d
e
f
g
h
a
bbb
c
de
f
g
h
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
乙醇体积分数
解
吸
附
量
（
mg
/g
)
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
45.00
50.00
解
吸
率
（
%）
解吸附量（mg/g)
解吸率（%）

图 4 乙醇体积分数对 HPD100 树脂静态解吸附原花青素解吸量和解吸率的影响
Tab .4 The effect of ethanol concentration on the desorption of the resin
2.6 洗脱流速和洗脱剂用量对纯化大血藤原花青素的影响
不同洗脱流速对 HPD100 树脂中原花青素的洗脱曲线如图 5 所示。以峰面积代表洗脱量，可知当以
100%乙醇洗脱时，0.5V/h 和 1.0BV/h 的流速洗脱效果较好，峰形对称，峰较高，而以 1.5 和 2.0BV/h 的流
速洗脱时，拖尾现象比较严重，峰变低。综合考虑生产效率和经济性，认为洗脱流速以 1 BV/h 为宜。洗脱
流速常因实验材料而异，石光波等[23]认为乙醇洗脱文冠果中总黄酮以 2BV/h 最适宜，王谨慧等[24]研究发现
1.5BV/h 为 60%乙醇洗脱桃儿七中的鬼臼毒素的最佳流速；本研究结果与上述结论的差异是由实验材料差
异引起。当洗脱剂用量达到 2BV 时，流出液已基本不含原花青素，故洗脱剂用量以 2BV 为佳。
0
50
100
150
200
250
0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.5 1.7 1.9 2.1 2.3 2.5 2.7 2.9
流出液体积（BV）
花
青
素
含
量
（
m
g/
m
L)
0.5BV/h
1BV/h
1.5BV/h
2.0BV/h

图 5 洗脱流速对树脂动态解吸附的影响
Tab .5 The effect of ethanol concentration on the dynamic desorption of the resin

2.7 纯度分析
利用 1.3.8 所述方法对大血藤原花青素进行纯化以考察体系的稳定性，利用 1.3.2 所述方法对各样品
原花青素纯度进行分析，结果如表 3 所示，体积为 40mL 的 HPD100 树脂经 100%乙醇纯化得到的原花青
素纯度高达 72.90%，40mL 和 100mL 柱体积对纯化原花青素效果无显著差异，该范围内层析柱柱体积对原
花青素纯化的影响很小，系统稳定。而 200mL 柱体积所得原花青素纯度略有降低。与大血藤粗提物相比，
经 HPD100 树脂纯化后原花青素纯度显著提高 31.59%，是大血藤粗提物原花青素的 1.76 倍。文冠果[23]中
总黄酮由原冻干粉中质量分数 27.01%提升到 45.79%，增加了 1.70 倍；沙枣果[25]总黄酮经 AB8 树脂纯化后
纯度是粗提物的 2.84 倍。鸡血藤[13]经纯化原花青素纯度是粗提物的 1.8 倍。葡萄籽中原花青素的分离纯度
可达 89.63%。因此，大孔树脂法分离纯化大血藤中原花青素还有一定提升空间。

表 3 不同柱体积对大血藤原花青素纯化的影响
Tab. 3 The effect of resin column volume to the Proanthocyanidins purity
柱体积（mL） 40 100 200 大血藤粗提物
原花青素纯度（%） 72.90±0.52a 72.04±0.17ab 70.75±0.75b 41.31±0.37c
注：每行不同的字母表示在 P≤0.01 水平上具有显著性差异。

3 结 论
5 种大孔吸附树脂中，HPD100 型树脂吸附量和解吸率都较高，是从大血藤中分离纯化原花青素的理
想树脂类型。筛选得到大血藤中原花青素纯化的最适条件：上样浓度 6mg/mL，上样流速 2BV/h，洗脱流速
1.0 BV/h，洗脱剂用量 2BV；100%乙醇对原花青素的洗脱量最大，可得到 72.90%纯度的原花青素，是大血
藤粗提物的 1.76 倍。
近十年来，因原花青素的抗氧化活性、保护心血管系统及抗癌的作用使其在药品、食品保健和化妆品
中备受青睐。国内外对天然抗氧化剂和植物药物的迫切要求，使得开发和研究原花青素势在必行。大血藤
原花青素的定性研究进展缓慢，毛水春从中鉴定出缩合鞣质 B2以及可能具有新连接方式的五聚体缩合鞣质
[26]并报道大血藤中酚类是抗肿瘤活性成分。截至目前，尚未见到从大血藤中开发利用原花青素的报道，本
文考察我国特有且分布广、产量大的药用植物大血藤藤茎中原花青素含量并筛选最适纯化条件，为经济高
效地制备高纯度、高活性的天然原花青素提供依据。

参考文献
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