全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (12): 1625−1631 · 1625 ·



基于分子标记和代谢组学技术的黄芪与红芪比较研究
焦美丽 1, 2, 李震宇 1*, 张福生 1, 秦雪梅 1*
(山西大学 1. 中医药现代研究中心, 2. 化学化工学院, 山西 太原 030006)
摘要: 黄芪和红芪虽然为不同属植物, 但在中医理论中具有相似的功效, 而且红芪曾经作为黄芪的法定药
材使用。本文以多序岩黄芪和蒙古黄芪为研究对象, 通过聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) 扩增
内部转录间隔区 (internal transcribed spacer, ITS) 序列再进行双向测序, 获得二者的 ITS/ITS2 片段并分析其位
点信息的异同。黄芪和红芪的 ITS 碱基序列对齐长度为 616, 其中 508 个位点保持一致, 占总 ITS 碱基长度的
82.47%; 有 103 个位点存在差异, 占总 ITS碱基长度的 16.72%。基因型决定表现型, 采用 1H NMR代谢组学技
术对黄芪和红芪进行化学分析, 找出二者所含化学成分的异同。根据核磁图谱共指认出代谢产物 34 个, 黄芪与
红芪共有代谢产物为 27 个, 氨基酸、糖类等初级代谢产物较为相似, 黄酮类、皂苷类物质差异较大。本研究从
分子和化学角度证明黄芪和红芪既具有相似性, 又具有一定差异性, 为阐明其具有相似功效的物质基础和资源
利用奠定了基础。
关键词: 黄芪; 红芪; ITS/ITS2; 代谢组学
中图分类号: R917 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2015) 12-1625-07
Comparison between Astragalus membranaceus var. mongholicus and
Hedysarum polybotrys based on ITS sequences and metabolomics
JIAO Mei-li1, 2, LI Zhen-yu1*, ZHANG Fu-sheng1, QIN Xue-mei1*
(1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, 2. College of Chemistry and Chemical Engineering,
Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Abstract: Astragalus membranaceus var. mongholicus and Hedysarum polybotrys belong to different genera,
but have similar drug efficacy in traditional Chinese medicine theory, and H. polybotrys was used as the
legal A. membranaceus var. mongholicus previously. In this study, similarities and differences between them
were analyzed via their ITS/ITS2 fragments information. The ITS (internal transcribed spacer) regions were
amplified using polymerase chain reaction and then sequenced in two-way. The alignment lengths of ITS
regions were 616 bp, in which 508 loci were consistent, and 103 loci were different, accounting for 82.47% and
16.72% of the total ITS nucleotides in length, respectively. As genotype determines phenotype, 1H NMR-based
metabolomic approach was further used to reveal the chemical similarities and differences between them.
Thirty-four metabolites were identified in the 1H NMR spectra, and twenty-seven metabolites were the common
components. Amino acids, carbohydrates and other primary metabolites were similar, while a large difference
existed in the flavonoids and astragalosides. This study suggests that A. membranaceus var. mongholicus and
H. polybotrys show similarities and differences from molecular and chemical perspectives, which has laid a
foundation for elucidating the effective material basis of drug with similar efficacy and resources utilization.
Key words: Astragalus membranaceus var. mongholicus; Hedysarum polybotrys; ITS/ITS2; metabolomics

收稿日期: 2015-02-03; 修回日期: 2015-04-15.
基金项目: 国家十二五科技支撑计划资助项目 (2011BA107B01); 山西省高等学校创新人才支持计划; 山西省科技创新重点团队 (2013131015).
*通讯作者 Tel/Fax: 86-351-7018379, E-mail: lizhenyu@sxu.edu.cn; qinxm@sxu.edu.cn
DOI:10.16438/j.0513-4870.2015.12.009
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黄芪是我国传统补益中药材, 性微温, 具有补气
固表、利尿生津、托毒排脓和敛疮生肌的作用。《中
国药典》2010 年版规定, 黄芪来源为豆科植物蒙古
黄芪 [Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var.
mongholicus (Bge) Hsiao] 或膜荚黄芪 [Astragalus
membranaceus (Fisch.) Bge] 的干燥根, 主产于山西、
内蒙、甘肃和黑龙江等地; 红芪为豆科植物多序岩黄
芪 (Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.) 的干燥根 ,
主产于甘肃陇南地区[1]。传统中医理论认为两者的性
味、归经、功效和主治基本相同, 我国西北一些地方
曾将红芪作为黄芪使用[2], 台湾、港、澳及东南亚一
些地区有药用红芪的习惯, 认为红芪是黄芪的优质
品种[3]。1977年版《中国药典》曾将红芪与蒙古黄芪、
膜荚黄芪作为正品黄芪的三大来源之一, 但之后的
各版药典将其单列为红芪。
近年来, 众多学者对黄芪和红芪的黄酮类、皂苷
类等次级代谢产物进行了深入的比较研究。红芪中主
要含有芒柄花素和芒柄花苷, 其他异黄酮类成分种
类丰富但含量均较低; 黄芪中则主要含有毛蕊异黄
酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素等六种异黄
酮类成分。其中, 芒柄花素和芒柄花苷是黄芪和红芪
的共有成分。黄芪主要含有环阿尔廷型四环三萜皂苷
类成分和较少量的齐墩果烷型三萜皂苷; 红芪主要
含有齐墩果烷型的大豆皂苷类成分[4]。
DNA 条形码技术已成为新兴的中药材物种鉴别
手段。2011年中国植物条形码工作组 (Chinese Plant
BOL Group) 研究发现, ITS 序列具有最高的物种分
辨率, 将 ITS/ITS2序列作为种子植物的核心 DNA条
形码[5]。DNA 分子标记技术可在分子水平上利用基
因序列间的变异位点对物种进行分析和比较, 如羌
活[6]、山茱萸[7]、党参[8]、花椒[9]等。代谢组学是近年
来出现的继基因组学、蛋白组学之后的一种新型的组
学技术, 具有整体观的研究思路。其中植物代谢组学
以植物提取物为研究对象, 特别适合于中药材等复
杂体系的分析, 近年来已成功应用于中草药的品质
评价和化学组成比较, 如款冬花[10]、黄芪[11]、厚朴[12]
和人参[13]等。
由于基因型决定化学表现型 , 本研究拟采用
ITS/ITS2 序列分析结合 1H NMR 代谢组学技术对黄
芪和红芪进行遗传学和化学组成的系统比较, 揭示
二者的相似性和差异性, 为阐明两者相似功效的物
质基础、合理用药和资源利用奠定了基础。目前蒙古
黄芪是商品黄芪药材的主要来源。因此, 本研究中黄
芪选择 3个主产区的蒙古黄芪。
材料与方法
样品来源 本研究采用的黄芪和红芪样品来源
及详细信息见表 1。样品经山西大学秦雪梅教授鉴定,
黄芪样品为蒙古黄芪 [A. membranaceus (Fisch.) Bge.
var. mongholicus (Bge.) Hsiao] 的干燥根, 红芪样品为
多序岩黄芪 (H. polybotrys Hand.-Mazz.) 的干燥根。
样品均保存在山西大学中医药现代研究中心。

Table 1 The samples of A. membranaceus var. mongholicus
and H. polybotrys
Latin name Specimen No. Locality Genotype
GenBank
No.
Astragalus membranaceus var. mongholicus
GS-1 Gansu Longxi Cultivated KJ999353.1
GS-2 Gansu Minxian Cultivated KJ999353.1
GS-3 Gansu Cultivated KJ999353.1
NM-1 Neimenggu Chifeng Cultivated KJ999353.1
NM-2 Neimenggu Guyang Cultivated KJ999353.1
NM-3 Neimenggu Xinghe Cultivated KJ999353.1
SX-1 Shanxi Yingxian Wild KJ999352
SX-2 Shanxi Hunyuan Wild KJ999353.1
SX-3 Shanxi Hunyuan Wild KJ999353.1
Hedysarum polybotrys
RQ-1 Gansu Unknown KJ999375.1
RQ-2 Gansu Unknown KF032294.1
RQ-3 Gansu Unknown KF032294.1

仪器与试剂 Bruker 600-MHz AVANCE III
NMR Spectrometer (600.13 MHz质子频率, 德国布鲁
克公司 600兆核磁仪)。XP基因扩增仪 (杭州博日科
技有限公司), ZF-258 全自动凝胶成像分析系统 (上
海嘉鹏科技有限公司)。分析纯甲醇, 分析纯氯仿, 娃
哈哈纯净水 , NMR 试剂重水 (Norell, Landisville,
USA), 氘代甲醇、氘代氯仿 (99.8%, Merck, Ger-
many), 氘代氢氧化钠 (Armar, Switzerland), 氘代三
甲基硅烷丙酸钠盐 (TSP, Cambridge Isotope Labora-
tories Inc., MA)。
ITS序列测定 将每份药材样品各取三株, 称样
量为 200 mg, 加入液氮研磨后, 利用 CTAB 植物基
因组DNA快速提取试剂盒法提取总DNA。ITS扩增、
测序引物正向 ITS5F 为 5-GGAAGTAAAAGTCGTA
ACAAGG-3, 反向 ITS4R 为 5-TCCTCCGCTTATTG
ATATGC-3。PCR反应体积为 25 μL, 体系内包含 2×
EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL、ITS5F和 4R各 1
μL、模板 DNA 2 μL, 用双蒸水补足反应体系的体积。
扩增程序: 93 ℃变性 5 min, 再进行 35个循环 (93 ℃
变性 30 s, 60 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s), 最后 72 ℃
延伸 5 min。PCR 产物在全自动凝胶成像仪上成像,
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并由上海 Sunny 公司完成双向测序。测序峰图利用
CodonCode Aligner V 3.7.1 (CodonCode Co., USA)
校对拼接, 去除引物区。通过 NCBI 的 BLAST 功能
对截取后待鉴定样品的 ITS序列进行检索, 综合考虑
score值、coverage值和 evalue值鉴定样品基源。ITS
序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去
除两端 5.8 S和 28 S区段即可获得 ITS2 间隔区序列。
采用 DNAMAN 软件 (Demo Version 4.0, USA) 将测
得的黄芪和红芪的序列进行比对及同源性分析。
样品制备 参照本课题组建立的方法[10], 精密称
取液氮研磨后的药材粉末各 200 mg, 置于 10 mL离心
管中, 分别加蒸馏水及甲醇各 1.5 mL, 氯仿 3 mL, 涡
旋混匀 1 min, 超声提取 25 min, 室温下离心 (3 500
r·min−1) 25 min, 提取液分为两相, 分别减压浓缩蒸
干。于测定前用氘代试剂溶解, 其中甲醇水相层用氘
代甲醇 400 μL与缓冲重水 (取 12.5 mg TSP和 0.3～
0.325 g KH2PO4溶于 25 mL D2O中, 以 1 mol·L−1氘代
氢氧化钠溶液调节 pH 6.0) 400 μL溶解, 氯仿相部分
用氘代氯仿 800 μL溶解, 溶解液分别转移至 1.5 mL
离心管中, 离心 (13 000 r·min−1) 10 min, 分别移取上
清液 600 μL于 5 mm核磁管中待测。每份药材样品
平行备样 3份。
1H NMR测定 样品在 25 ℃下于 600 MHz NMR
仪上测定, 扫描次数为 64, 谱宽 12 345.7 Hz, 脉冲时
间 14 μs, 采样时间 2.654 s, 弛豫时间 1.0 s, 采样数
据点 65 536, FID分辨率 0.188 Hz, 采样间隔 40.5 μs,
相位调节、基线调节及峰校正均为手动。甲醇水相提
取物核磁测定采用 noesygppr1d 序列压制水峰, 用氘
代甲醇进行锁场, 内标为 TSP。氯仿相提取物核磁测
定采用 zg 30序列, 用氘代氯仿锁场, 内标为 TMS。
数据分析 核磁图谱采用 MestReNova (version
8.0.1, Mestrelab Research, Santiago de Compostella,
Spain) 进行处理。核磁图谱经过定标、相位、基线
校准后, 以 δ 0.04积分段对甲醇水相化学位移区间 δ
0.03～6.19 进行积分, 其中 δ 4.71～4.95 (残余水峰)
和 δ 3.27～3.39 (残余甲醇峰) 不进行积分。将归一
化后的积分数据导入 SIMCA-P 13.0 (Umetrics, Umea,
Sweden) 软件中进行主成分分析 (principal component
analysis, PCA), 再用偏最小二乘法判别分析 (partial
least squares discriminant analysis, PLS-DA) 和正交
偏最小二乘法判别分析 (orthogonal PLS-DA), 找出
差异代谢产物。对差异代谢产物相对峰面积进行 t检
验, 分析显著性差异代谢产物。
结果与分析
1 黄芪、红芪 ITS碱基序列的比较分析
9 份不同来源黄芪样品的 ITS 序列长度均为
601 bp, 在NCBI网站上将测得序列在线BLAST后结
果显示: 样品 SX-1 碱基序列为蒙古黄芪 KJ999352,
其余 8 个样品碱基序列为蒙古黄芪 KJ999353.1, 覆
盖率与相似度均为 100%; 两种序列高度相似, 仅有
1个位点 (474 bp处) 存在差异, 即 KJ999353.1为 C,
KJ999352 为 T。黄芪样品来源于山西、甘肃和内蒙
三个产地, 其中甘肃和内蒙的栽培黄芪与山西 2个野
生黄芪的 ITS序列完全一致, 可见不同产地和种植方
式黄芪的 ITS/ITS2 序列变异较小, 说明 ITS/ITS2 序
列用于黄芪药材的鉴定具有较好的稳定性。
不同来源的 3份红芪的 ITS序列长度为 615～616
bp, 在 NCBI 网站上将测得序列在线 BLAST 后结果
显示: 样品RQ-1碱基序列为多序岩黄芪KJ999375.1,
样品RQ-2、RQ-3碱基序列为多序岩黄芪KF032294.1,
覆盖率与相似度均为 100%。红芪的 2个单倍型共有
4个位点存在差异 (表 2)。

Table 2 The intraspecific variable sites in the ITS sequence of
H. polybotrys. aThe site base deletion
Site
ITS1 ITS2
6 bp 99 bp 203 bp 498 bp
KJ999375.1 A −a A C
KF032294.1 G G C T

黄芪与红芪的 ITS碱基序列输入DNAMAN后对
齐长度为 616, 两者共有 508 个位点相同, 占总 ITS
碱基长度的 82.47%; 共有 103个位点存在差异, 占总
ITS碱基长度的 16.72%。黄芪G+C含量为 53.31%, 红
芪 G+C含量为 52.32%。可见, 两者虽然为不同属的
植物, 但 ITS区间的碱基序列具有较高的相似性。ITS
可以进一步分为 ITS1、ITS2和 5.8S三个片段。二者
在这三个片段的序列对比结果见表 3。在 ITS1区, 虽
然两者的碱基序列长度不同, 但有 183个位点的碱基
是相同的, 占总 ITS1碱基长度的 76.57%, 共有 53个
差异位点存在差异, 占总 ITS1 碱基长度的 22.18%,
该区间黄芪的 G+C含量高于红芪。5.8S序列进化缓
慢且保守, 在生物种间变化小, 两者的 5.8S区间碱基
长度一致, 均为 164 bp, G+C含量均为 51.22%, 仅有
两个位点存在差异 (241 bp和 244 bp), 有 162个位点
保持一致, 占 5.8S碱基长度的 98.78%。两者的 ITS2
区有 163个位点相同, 占总 ITS2碱基长度的 76.53%,
共有 48 个位点存在差异, 占总 ITS2 碱基长度的
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22.54% , 黄芪的 G+C含量低于红芪。两者差异位点
的具体信息见表 4, 可看出在差异位点中, (红芪) T-C
(黄芪)、(红芪) C-T (黄芪) 出现的概率最高, 约为
28.16%; (红芪) A-C (黄芪)、(红芪) C-A (黄芪) 出现
的概率最低, 约为 5.83%。

Table 3 Sequence characteristics of ITS/ITS2 of A. membra-
naceus var. mongholicus and H. polybotrys
Sequence characteristics ITS1 5.8S ITS2
Length in A. membranaceus var.
mongholicus / bp
228

164

209

Length in H. polybotrys / bp 238−239 164 213
G+C mean content in A. membranaceus
var. mongholicus (%)
57.02

51.22

50.90

G+C mean content in H. polybotrys (%) 51.66 51.22 53.90
Number of variable sites 53 2 48

Table 4 The variable sites in the ITS sequence between
A. membranaceus var. mongholicus and H. polybotrys. aBase is
expressed as: H. polybotrys − A. membranaceus var. mongholicus;
“−” means the site base deletion
Opposite basea
(Numbers)
bp
A-G (10) 86, 93, 102, 126, 179, 241, 482, 510, 587, 608
A-C (3) 125, 187, 571
A-T (4) 67, 223, 422, 428
A- − (2) 236, 238
C-A (3) 130, 426, 437
C-G (5) 100, 207, 544, 567, 582
C-T (14)

38, 66, 121, 178, 186, 205, 244, 420, 439, 444,
490, 564, 569, 585
C- − (3) 57, 184, 564
G-A (8) 47, 70, 175, 225, 565, 588, 597, 609
G-C (4) 116, 123, 145, 555
G-T (10) 45, 85, 96, 110, 441, 542, 575, 580, 607, 611
G- − (3) 111, 212, 443
T-A (9) 26, 70, 73, 105, 455, 539, 577, 579, 615
T-G (4) 88, 229, 414, 427
T-C (14)

108, 113, 116, 150, 168, 209, 219, 233, 425, 478,
483, 537, 568, 570,
T- − (7) 172, 234, 235, 237, 239, 517, 518

2 1H NMR分析
采用氯仿−甲醇−水 (2∶1∶1) 的两相提取法分
别得到黄芪、红芪的甲醇水相和有机相提取物。通过
标准品对照、文献报道数据以及 BMRB 数据库中的
标准物质对照, 共指认出 34个化合物 (表 5)。
由图 1 可见, 黄芪与红芪的甲醇水相图谱在 (δ
6.19～δ 0.00) 区间较为相似, 在有机酸和氨基酸区
(δ 3.10～δ 0.00), 二者均含有缬氨酸、丙氨酸、精氨
酸、柠檬酸、天冬酰胺等物质信号, 其中琥珀酸 (2.45,
s) 仅能在黄芪图谱中检测到; 在碳水化合物区 (δ
6.19～δ 3.10), 二者均主要含有蔗糖, 以及少量的葡
萄糖、鼠李糖和半乳糖等。在芳香区 (δ 9.55～δ 6.19),
二者则存在较大差异, 黄芪中含有腺嘌呤 (8.22, s;
8.28, s)、毛蕊异黄酮苷 (7.26, dd, J = 2.4, 9.0 Hz; 7.31, d,


Figure 1 1H NMR spectra of aqueous methanol extracts in A.
membranaceus var. mongholicus (HQ) and H. polybotrys (RQ)

J = 2.4 Hz; 8.17, d, J = 8.4 Hz; 8.31, s) 和芒柄花苷
(7.05, d, J = 2.4 Hz; 7.26, dd, J = 2.4, 9.0 Hz; 7.31, d, J =
2.4 Hz; 7.53, d, J = 9.0 Hz; 8.18, d, J = 8.14 Hz; 8.32, s),
而红芪在同样的位置观测不到上述物质信号。从红芪
图谱中可直观看出富马酸 (6.53, s) 信号明显高于黄
芪中的该物质峰信号, 红芪在该区间特有的信号为
6.36, d, J = 16.2 Hz; 7.14, t, J = 7.3 Hz; 7.22, s; 7.65, d,
J = 7.8 Hz; 7.72, d, J = 7.8 Hz; 8.13, s, 但上述信号归
属的物质未知。
氯仿相提取物为低极性成分, 从图 2中可看出黄
芪与红芪的氯仿相图谱中主要含脂肪酸类 (1.2～1.3,
m; 1.6, m; 2.36, t, J = 7.5 Hz; 2.77, t, J = 6.6 Hz; 5.35,
m) 和黄酮类苷元, 但二者黄酮苷元的种类不同。红
芪含有 3-甲氧基-4-羟基-反式苯丙烯酸正十八醇酯[14]
(6.36, d, J = 15.6 Hz; 7.61, d, J = 15.6 Hz) 和 3-羟基-
9-甲氧基紫檀烷[15] (3.53, m; 3.77, s; 4.24, dd, J = 10.9,
5.0 Hz; 5.49, d, J = 6.8 Hz; 7.13, d, J = 8.8 Hz; 7.39, d,
J = 8.4 Hz); 而黄芪中的黄酮苷元类成分为 8,2-羟基-
7,4-甲氧基异黄烷[16] (6.35, d, J = 2.4 Hz; 6.39, dd, J =
8.4, 3.0 Hz; 6.44, d, J = 8.4 Hz; 6.78, d, J = 9.0 Hz;
6.94, d, J = 8.4 Hz)。
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Table 5 1H NMR (600MHz, J in Hz) assignments of major metabolites in HQ and RQ. aFrom HQ, bFrom RQ
No. Metabolite δ 1H (multiplicity)
1 Valine 1.01 (d, 7.0), 1.06 (d, 7.0)
2 Threonine 1.33 (d, 6.6)
3 Alanine 1.48 (d, 7.2), 3.78 (m)
4 Arginine 1.68 (m), 1.74 (m), 1.90 (m), 3.24 (t, 7.2), 3.75 (t)
5 Glutamate 2.06 (m), 2.35 (m)
6 Glutamine 2.14 (m), 2.46 (m)
7 Asparagine 2.83 (dd, 16.9, 8.1), 2.95 (dd, 16.9, 4.0)
8 Phenylalanine 3.44 (t, 9.6), 7.33 (m)
9 Acetic acid 1.94 (s)
10 Malic acid 2.41 (dd, 15.3, 9.3), 2.70 (dd, 15.6, 3.4), 4.29 (dd, 9.1, 3.3)
11 aSuccinic acid 2.45 (s)
12 Citric acid 2.54 (d, 16.7), 2.72 (d, 16.7)
13 GABA 2.30 (t, 7.2), 3.01 (t, 7.2)
14 Malonic acid 3.13 (s)
15 Taurine 3.24 (t), 3.44 (t), 3.54 (s)
16 Fumaric acid 6.53 (s)
17 Formic acid 8.47 (s)
18 Sucrose 3.51 (dd, 9.9, 3.8), 3.66 (s), 4.03 (t, 8.4), 4.17 (d, 8.6), 5.41 (d, 3.8)
19 β-Glucose 4.59 (d, 7.9)
20 α-Glucose 5.20 (d, 3.8)
21 Raffinose 4.96 (d, 3.70), 5.43(d, 3.6)
22 Maltose 5.26 (d, 3.7)
23 Choline 3.22 (s)
24 Uridine 3.79 (d, 4.2), 3.92 (d, 2.7), 5.90 (d, 4.8), 7.53 (d, 8.7), 7.92 (d, 8.2)
25 Trigonelline 8.10 (m), 8.86 (m), 9.14 (s)
26 aAdenine 8.22 (s) , 8.28 (s)
27 aAstragaloside 0.34 (m), 0.55 (m)
28 aOnonin 7.05 (d, 2.4), 7.26 (dd, 2.4, 9.0), 7.31 (d, 2.4), 7.53 (d, 9.0), 8.18 (d, 8.14), 8.32 (s)
29 aCalycosin-7-O-β-D-glucoside 7.26 (dd, 2.4, 9.0), 7.31 (d, 2.4), 8.17 (d, 8.4), 8.31 (s)
30 β-sitosterol 1.68 (s), 0.82 (d, 6.8), 0.88 (d, 6.0), 0.89 (d, 7.0), 0.92 (d, 6.5), 1.01 (s)
31 Fatty acid 1.2−1.3 (m), 1.6 (m), 2.36 (t, 7.5), 2.77 (t, 6.6), 5.35 (m)
32 b3-Hydroxy-9-methoxy pterocarpan 3.53 (m), 3.77 (s), 4.24 (dd, 10.9, 5.0), 5.49 (d, 6.8), 7.13 (d, 8.8), 7.39 (d, 8.4)
33 a8, 2’-Dihydroxy-7, 4’-dimethoxyisoflavan 6.35 (d, 2.4), 6.39 (dd, 8.4, 3.0), 6.44 (d, 8.4), 6.78 (d, 9.0), 6.94 (d, 8.4)
34 bOctadecanyl-3-methoxy-4-hydroxybenzeneacrylate 6.36 (d, 15.6), 6.97 (d, 8.4), 7.03 (d, 1.8), 7.61 (d, 15.6)


Figure 2 1H NMR spectra of chloroform extracts in HQ and
RQ

3 多元统计分析
由于黄芪和红芪二者甲醇水相的氨基酸、有机酸
和糖区相似, 因此采用多元统计分析方法对这一位
移区间 (δ 6.19～δ 0.00) 进行深入分析。在 PCA得
分散点图 (图 3a) 中, 第 1主成分和第 2主成分共解
释了 55.4% (PC1: 34.4%, PC2: 21.0%) 的原始变量信
息, 二者既有部分重叠, 又有一定分离趋势, 说明黄
芪与红芪在该区域既有相似性, 又存在一定差异性。
虽然样品 RQ-1、SX-1与种内其他样品的 ITS序列不
同, 但在化学组成上与种内其他样品无显著性差异。
为了进一步确定黄芪与红芪在这一区间的化学差异,
需要采用有监督的PLS-DA分析进一步放大组间差异,
而缩小组内差异。排列实验模型验证结果 (图 3b) 显
示, 模型虽然较差, 但仍然有效 (R2X = 0.689, R2Y =
0.932, Q2 = 0.871), 进一步说明二者既存在相似性
又有差异性。OPLS-DA 分析的 S-plot 图 (图 3d) 和
· 1630 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (12): 1625−1631


Figure 3 PCA score plot (a), permutation test model validation
plot (b), OPLS-DA score plot (c) and loading S-plot (d) between
HQ and RQ of aqueous methanol extracts

VIP > 1 对应的变量显示黄芪和红芪在丙氨酸、精氨
酸、乙酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、谷氨酰胺、蔗糖、
尿苷和牛磺酸的含量上可能存在一定差异。然后以
TSP 为内标对两者的 18 个共有化合物做进一步 t 检
验分析, 结果如图 4所示, 这些成分在红芪中含量均
高于黄芪, 其中缬氨酸、牛磺酸、尿苷和麦芽糖具有
显著性差异 (P < 0.05); 丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、
γ-氨基丁酸、柠檬酸和苹果酸具有极显著性差异 (P <
0.01)。

讨论
本文采用 ITS/ITS2 分子标记方法对黄芪与红芪
的 ITS序列进行了比较, 二者的 ITS碱基序列一致性
为 82.47%, 差异位点占 16.72%。黄芪与红芪同科不
同属, 但两者 ITS序列相同位点远多于差异位点, 说
明二者在植物学上亲缘关系密切。此外, 本研究还以
核磁图谱中鉴定的 34 个化合物为指标对二者进行了
全面比较, 结果显示二者初级代谢产物差异较小, 仅
存在物质含量的不同; 次级代谢产物差异较大, 主要
体现在化学成分种类的不同。已有研究表明红芪和黄
芪的皂苷类成分存在较大差异, 黄芪以阿尔廷型四
环三萜皂苷类为主, 而红芪以齐墩果烷型的大豆皂
苷类成分为主[4]; 对于黄酮类成分, 黄芪中毛蕊异黄
酮苷的含量高出红芪约 10 倍, 而红芪的芒柄花素含
量约为黄芪的 3 倍[17], 另外红芪还含有特征的黄酮
类成分 3-羟基-9-甲氧基紫檀烷[18]。本研究显示, 黄
芪与红芪在黄酮类和皂苷类成分上的差异与文献报
道一致; 但由于核磁共振的灵敏度较低, 两者的核磁
共振指纹中均未检测到芒柄花素, 后续的研究中还
应结合液质联用等技术手段进一步分析两者的次级
代谢产物差异。此外, 本研究在红芪的极性成分核磁
指纹中发现的若干特征信号也有待于进一步鉴定。虽
然黄芪和红芪的黄酮类成分种类不同, 但苷元的母
体化学结构相近, 在体内相关酶的作用下很可能会
发生相互转化, 因而可能发挥相似的功效。因此, 黄
酮类成分结构与黄芪、红芪功效的相关性也值得进一
步深入研究。之前对黄芪和红芪的化学比较大多限于
次级代谢产物, 本研究揭示了两者在初级代谢产物
上的相似性和差异性。已有研究显示黄芪和红芪中的
γ-氨基丁酸 (GABA) 具有显著的降压活性, 红芪中
GABA含量高于黄芪, 其降压活性也强于黄芪[19]。鉴
于黄芪与红芪具有相似的功效, 但在次级代谢产物
上存在较大差异, 因此, 两者所含初级代谢产物与功
效的相关性值得进一步研究。除了小分子化合物外,
多糖也是黄芪的重要活性成分, 虽有研究显示红芪
总多糖含量高于黄芪总多糖的含量[20], 但总多糖指


Figure 4 Quantitative comparisons of the intensive polar compounds in HQ and RQ. Y axis expressed as relative intensity against the
peak area of the internal standard TSP at δ 0. *P < 0.05, **P < 0.01
焦美丽等: 基于分子标记和代谢组学技术的黄芪与红芪比较研究 · 1631 ·

标难以反映两者在多糖结构上的差异性和相似性 ,
因此, 后续的研究还应采用糖谱等技术[21, 22]对两者
的多糖进行结构分析比较。
本课题组前期曾采用核磁共振代谢组学技术结
合 ITS2 分子标记技术对恒山黄芪与川黄芪的差异性
进行了比较[11]。与前期工作相比, 本研究不仅关注了
黄芪与红芪的差异性, 而且针对红芪曾作为黄芪法
定代用药材的现象分析了两者的相似性。通过两者的
化学相似性对黄芪的功效贡献成分进行了推测; 在
对两者的分子标记比较方面, 本研究从序列长度、碱
基顺序、G+C含量等指标对两者的 ITS片段 (ITS1+
5.8S+ITS2) 进行了比较, 从分子标记角度深入揭示
了黄芪和红芪的差异性和相似性。
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