全 文 ：收稿日期:2008-10-04;　修订日期:2008-12-29
基金项目:湖南省科技厅国际合作项目 (No.2007wk2003)
作者简介:贺晓华(1983-),女(汉族),湖南长沙人 ,现为湖南中医药大学在
读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药及其复方化学活性成分研究工作.
＊通讯作者简介:曾建国(1965-), 男(汉族),湖南常德人 , 现为湖南中医
药大学教授 ,博士学位 ,主要从事中药提取物的研究与开发工作.
不同提取方法赶黄草提取物
清除 DPPH自由基的作用研究
贺晓华1, 2 ,许　龙 1, 2 ,谈满良1 ,杜方麓 2 ,曾建国1, 2＊
(1.湖南省中药提取工程研究中心 ,湖南 长沙 410331;　2.湖南中医药大学 ,湖南 长沙　410007)
摘要:目的 研究赶黄草提取物对 DPPH自由基的清除作用。方法 采用不同溶剂 、不同提取方法制得赶黄草提取物 , 以
抗坏血酸为对照 , 研究其对 DPPH自由基的清除作用。结果 不同溶剂提取物对 DPPH自由基清除率强弱依次为 95 %乙
醇 >水 >丙酮 , 不同极性部分对 DPPH自由基清除率强弱依次为醋酸乙酯部分 >正丁醇部分 >水部分 >石油醚部分 , 赶
黄草提取物浓度达到一定浓度后与抗坏血酸对 DPPH自由基清除能力相当。结论 回流提取法是最适合提取赶黄草中
有效成分的方法 ,赶黄草 95 %乙醇回流提取物具有良好的清除 DPPH自由基的能力 ,醋酸乙酯部分清除 DPPH自由基能
力最强。
关键词:赶黄草;　DPPH自由基;　清除率
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)08-1924-02
DPPHRadicalScavengingEfectofPenthorumchinensePurshExtract
HEXiao-hua1, 2 , XULong1, 2 ,TANMan-liang1 , DUFang-lu2 ,ZENGJian-guo1, 2＊
(1.HunanEngineeringResearchCenterofBotanicalExtract, Changsha, Hunan410331, China;2.Depart-
mentofPharmacologyofHunanColegeofTraditionalChineseMedicine, Changsha, Hunan410007, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheextractsfromPenthorumchinensePurshonscavengingDPPHfreeradical.MethodsTheDP-
PHscavengingactivitiesofPenthorumchinensePurshextractedbydifferentmethodsanddiferentsolventswerestudiedandcom-
paredwiththatofascorbicacid.ResultsThescavengingactivitywasdecreasedintheorderofPenthorumchinensePurshextracts
obtainedfrom 95 % ethanol>water>acetone, andPolardiferentpartsonDPPHfreeradicalstrongscavengingactivitywerepart
ofethyl>N-butanol>water>petroleumether.PenthorumchinensePurshextractandascorbicacidinacertainconcentration
hadthesameDPPHfreeradicalscavengingactivity.ConclusionTherefluxisthebestmethod, 95% ethanolextracthasgoodac-
tivitytoscavengetheDPPHfreeradical, andethylacetatethemoststrongseavengingactivitytoDPPHfreeradical.
Keywords:PenthorumchinensePursh;　DPPHfreeradical;　Scavengingactivity
　　赶黄草为虎耳草科扯根菜属 PenthorumGronvexl植物扯根菜
PenthorumchinensePursh的干燥地上部分 [ 1] 。赶黄草为苗族民间
的草药 , 主要分布于四川 、贵州 、湖南等地 , 具有清热解毒 、退黄利
湿 、活血散瘀 、利水消肿之功效 [ 2] 。赶黄草中含有黄酮 、有机酸 、
挥发油等成分 , 其中没食子酸和槲皮素为赶黄草中有效成分 [ 3] ,
具有抗乙肝病毒和保肝的作用。对于赶黄草清除 DPPH自由基
的活性研究及其抗氧化研究尚未见报道。
衰老 、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有直接
关系 , 因为自由基可与生物体内的许多物质如脂肪酸 、蛋白质等
作用 , 夺取它们的氢原子 ,造成相关细胞的结构与功能的破坏 ,更
重要的是其氧化产物和中间产物会伤害生物膜 、酶 、维生素 、蛋白
质及活细胞功能 , 其中一些还被认为是致癌物质 , 因此对消除自
由基的探讨已得到普遍关注 [ 4] 。清除自由基的检测方法很多 ,
如电子顺磁共振法 、电子自旋共振法 、化学发光法等 ,但这些方法
大多需用昂贵的仪器 ,一般实验室难以应用。 DPPH分析法是一
种筛选自由基清除剂 , 评价抗氧化活性的简便方法 [ 5] 。当有自
由基清除剂存在时 , 由于其与 DPPH中电子配对使 DPPH液吸收
逐渐消失 , DPPH液褪色程度与配对电子数成化学计量关系 , 因
而可用分光光度法进行定量分析。为了了解赶黄草的抗氧化性
质 , 进而阐明其所具有的抗病毒保肝作用机制 , 本文对赶黄草提
取物清除 DPPH自由基的活性进行了研究。
1　仪器与试剂
双光束紫外可见分光光度计 TU-1901(北京普析通用仪器
有限公司),电子天平(梅特勒 -托利多仪器有限公司), 旋转蒸
发仪(上海亚荣生化仪器有限公司), 电热恒温鼓风干燥箱 (北
京市永光明医疗仪器厂), 超声清洗仪(昆明市超声仪器有限公
司),数显恒温水浴锅(江苏省荣华仪器制造有限公司)。
二苯基苦味酰基苯肼(DPPH), 购自 sigma公司 。
供试药材赶黄草 2007-10下旬采自湖南浏阳 , 由湖南中医
药大学周日宝教授鉴定为虎耳草科植物赶黄草 Penthorum
chinensePursh。
2　方法
2.1　赶黄草有效成分的提取
2.1.1　回流提取法 准确称取药材 10.0 g,加入 10倍量的溶剂 ,
回流提取 2 h, 重复两次 ,将提取液过滤 , 滤液真空浓缩至浸膏 , 干
燥待用 。
2.1.2　超声提取法 准确称取药材 10.0 g,加入 10倍量的溶剂 ,
加热超声 2 h, 重复两次 ,将提取液过滤 , 滤液真空浓缩至浸膏 , 干
燥待用 。
2.1.3　温浸法 准确称取药材 10.0 g,加入 10倍量的溶剂 ,温浸
2 h, 重复两次 ,将提取液过滤 ,滤液真空浓缩至浸膏 , 干燥待用。
2.1.4　不同极性溶剂萃取法 准确称取药材 50.0 g, 以 “ 2.1.1”
方法用 75%乙醇提取两次 ,提取液经真空浓缩至小体积 , 依次用
石油醚 、醋酸乙酯和正丁醇萃取 , 所得各萃取部分浓缩成浸膏 , 干
燥待用 。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8
2.2　赶黄草提取物清除 DPPH自由基能力的测定
2.2.1　清除率的测定 精密称取 8.0 mgDPPH于 50 ml容量瓶
中 , 用 95 %乙醇溶解;样品溶解于 95 %乙醇溶液中。取样品溶
液 1 ml加入到离心管 , 再加入 3ml的 DPPH溶液配成样品溶液。
95 %乙醇溶液 1 ml加入到离心管 ,再加入 DPPH溶液 3 ml配成
未加样品液的 DPPH溶液。取样品溶液 1 ml加入到离心管 , 再
加入 3 ml的 95 %乙醇配成样品空白溶液。 上述溶液在室温下
离心 20min后用紫外分光光度计在 517 nm下检测。测定样品
溶液吸光度 Ai, 未加样品液的 DPPH溶液吸光度 Ac, 样品空白溶
液吸光度 Aj。根据下列公式计算清除率:
清除率 =[ 1-(Ai-Aj)/Ac] ×100%
2.2.2　半清除率的测定 抗氧化剂清除自由基能力采用清除
DPPH的半清除率(IC50值)表示。 将待测液配制成不同浓度溶
液 , 测定 DPPH自由基清除率 , 并绘制 DPPH自由基清除率对待
测液浓度曲线 , 由曲线读取或用方程计算出 DPPH自由基清除率
为 50%时所需赶黄草提取液浓度 , 计算出赶黄草提取液中溶质
质量 , 按公式计算 IC50值。溶质质量所需浓度越低 , 表明半清除
率越高。
IC50 =50%×消耗的 DPPH质量 /加入的试样溶液中溶质的质量
3　结果
3.1　DPPH吸收光谱与测定波长的确定 DPPH在溶液中具有
典型紫红色 , 当它与能提供 1个电子的自由基清除剂作用时 ,生
成浅色产物 , 使溶液的典型紫红色变浅。测定 DPPH溶液在 200
～ 600nm之间的光谱图 , 由图 1可知 , DPPH溶液在醇 -水体系
中其 327 nm和 517 nm处吸光度都具有极大值 ,但 517 nm处的
极大值在加入槲皮素后降低较显著 , 故选用在 95%乙醇体系下
517nm处 DPPH含量的变化来进行测定。
图 1　DPPH在醇 -水体系中的光谱图
3.2　DPPH溶液稳定性实验 测定 DPPH在 95 %乙醇中吸光度
变化与时间的关系 , 结果显示 DPPH的吸光度在 40 min内基本
不变。加入样品后 , 测定吸光度与时间的关系 , 发现吸光度随时
间增长呈线性降低 ,但 30 min后 , 吸光度的变化已经很小。结果
见图 2。为了提高测试准确度 , 在加入样品反应 20 min后 , 迅速
测定吸光度。
图 2　DPPH+槲皮素后的时间扫描曲线
3.3　抗氧化剂浓度与其清除 DPPH的关系 抗坏血酸 、没食子酸
和槲皮素是常见的抗氧化剂 [ 6] , 配制槲皮素 、抗坏血酸 、没食子
酸标准溶液 , 逐级稀释使用。 按 “ 2.2.1”方法测定 , 图 3可见抗
氧化剂浓度在一定范围内 , 随着浓度的增高 , 清除 DPPH自由基
的能力逐渐增大。各抗氧化剂浓度与清除率之间线性方程分别
表示如下 , 槲皮素:Y=1.273 6×103C+5.715 7, R2 =0.995 9;没
食子酸:Y=0.967 1 ×103C+9.561 4, R2 =0.986 0;抗坏血酸:Y
=1.073 6×103C+3.981 4, R2 =0.985 5。可见 ,在一定范围里 ,
可以用清除率来表示抗氧化剂 SPPH自由基的清除能力。
从图 3曲线可知 , 采用清除率极大值点或其他特征点所对应
的抗氧化剂含量来比较 DPPH自由基清除能力的方法比较合理。
由于极值点测定比较困难 ,误差较大 ,而自由基清除率在 50%时
对应的点较容易在曲线上标定 ,因此选定抗氧化剂的自由基半清
除率 IC50值为测定指标 。采用该法测定的槲皮素 、抗坏血酸 、没
食子酸的 IC50为 6.56, 5.32, 5.45。结果见图 4。
图 3　氧化剂浓度与 DPPH吸收关系
图 4　不同抗氧化剂清除 DPPH自由基的 IC50比较
3.4　不同提取方法清除 DPPH自由基的能力 按 “ 2.1.1”,
“ 2.1.2”, “ 2.1.3”不同方法提取 , 使用相同溶剂得到提取物 , 逐
级稀释 ,按 “ 2.2.1”方法测定 ,结果见图 5。
图 5　赶黄草对 DPPH自由基清除能力
不同提取方法得到的提取物都具有一定的清除自由基的能
力 , 在一定浓度范围内 , 呈现正向变化 ,但随着浓度增加到一定值
后 , 清除率趋于平缓。回流提取得到的提取物的 IC
50
为 2.15, 超
声提取得到的提取物的 IC50为 1.82, 温浸提取得到的提取物的IC50为 1.52,回流提取得到的提取物的 IC50最高。
3.5　不同溶剂提取物清除 DPPH自由基的能力 按 “ 2.1.1”回流
提取法分别用 95 %乙醇 ,水 , 丙酮提取 , 逐级稀释 ,按 “ 2.2.1”方
法测定 。结果见图 6。
图 6　赶黄草对 DPPH自由基清除能力
3种溶剂提取物都具有一定的清除自由基活性的能力 ,
且随着提取物浓度增加 ,清除率逐渐增高 , 但随着浓度增加到
一定值后 , 清除率趋于平缓 。在浓度范围内 , 赶黄草 95 %醇
提物的 IC50为 2.28, 水提物的 IC50为 1.66, 丙酮提取物的清
除能力最弱 , IC50为 1.30。其差异可能是因为溶剂的极性不
同 , 使其对赶黄草中抗氧化活性物质的溶解度不同 , 所提取的
抗氧化物质的总量和种类也就不同 , 导致了不同溶剂提取液
的清除 DPPH自由基能力不同。
3.6　不同极性部分清除 DPPH自由基的能力 根据实验结果 , 选
择回流提取法 ,按 “ 2.1.4”方法将提取液萃取为极性不同的 4个
部分:石油醚部分 ,醋酸乙酯部分 ,正丁醇部分以及水部分。按方
法 “ 2.2.1”测定。结果见图 7。
从图 7看出 , 在 4个不同的极性部分中 , 清除 DPPH自由基
能力最强的部分是醋酸乙酯部分。赶黄草有效成分主要是黄酮
化合物如槲皮素等存在于该极性部分 ,表明赶黄草中黄酮化合物
具有较强的清除自由基的能力。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8 时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期
图 7　不同极性部分对DPPH自由基清除能力
3.7　与抗坏血酸的清除自由基能力比较 抗坏血酸是常用的抗
氧化剂 , 将乙醇提取物按不同浓度用 “ 2.2.1”项下方法测定 , 与
相应浓度抗坏血酸比较 ,由图 8可知 , 赶黄草乙醇提取物的清除
自由基能力在达到一定浓度后接近抗坏血酸用的水平。
图 8　与常见抗氧化剂的比较
4　结论
回流提取法是最适合提取赶黄草中有效成分的方法 ,其具有
操作简单 , 方法稳定的特点。
赶黄草提取物均具有清除 DPPH自由基的作用 , 95 %乙
醇提取物的清除 DPPH自由基作用最强 , 以下依次为水 、丙酮
提取物 。
　　不同方法提取物清除 DPPH自由基的结果表明 , 在一定浓度
范围内 ,赶黄草提取物浓度越大 , 其清除自由基能力越强。
在石油醚 、醋酸乙酯 、正丁醇和水 4个不同极性部分中 ,清除
DPPH自由基能力最强的部分是在醋酸乙酯萃取部分。
赶黄草种质资源在四川 、贵州 、湖南都有分布 ,但目前其经济
价值被开发利用(药用 、保健)的还很少。本研究通过对赶黄草
提取物中具有抗氧化作用的活性物质对 DPPH自由基的清除能
力进行了考察 , 证明了赶黄草具有很强的抗氧化作用 , 这对于赶
黄草的综合利用和进一步开发具有重要意义。
参考文献:
[ 1 ] 　中国科学院植物研究所.中国高等植物属检索表 [ M].北京:科学
出版社 , 1979:205.
[ 2 ] 　全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编 ,下册 ,第 2版 [ M] .北
京:人民卫生出版社 , 2000:480.
[ 3 ] 　张　旭 ,杨　明.赶黄草有效成分研究 [ J].成都中医药大学学报 ,
2005, 25(4):46.
[ 4 ] 　MeydaniMBlumbergA.Antioxidantsandagingimmuneresponse.IN
BendichA, PhilipsM, TengerdyRedsantioxidantsNutrientsandim-
munefunctions[M].NewYorkandLondon:Plenumpress, 1990:57.
[ 5 ] 　BorsSW, VanbeekTA.Screeningofplantextractsforantioxidantac-
tivity, acomparativestudyonthreetestingmethods[ J] .Photochemical
Analysis, 2002, 13(1):8.
[ 6 ] 　成喜雨 ,崔　謦 ,刘春朝 ,等.中草药抗氧化活性研究进展 [ J].天然
产物研究与开发 , 2006, 18(2):514.
收稿日期:2008-11-07;　修订日期:2009-01-19
基金项目:广西中医学院院级项目资助课题(No.Q03004)
作者简介:罗　眈(1977-),女(汉族),湖南株洲人 ,现任广西中医学院讲
师 ,湖南中医药大学 2007级在读博士研究生 ,硕士学位 , 主要从事方剂配
伍和作用机理研究工作.
加减葛花解酲汤对大鼠酒精性肝损伤的防治作用
罗　眈 ,易自刚 ,杨力强
(广西中医学院 ,广西 南宁　530001)
摘要:目的 通过观察加减葛花解酲汤对慢性酒精性肝损伤大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH)的影响 ,探讨其对慢性酒精性肝损伤的防治作用。方法 采用白酒灌胃的方法建立慢性酒精性肝损伤动物模型 ,
以益肝灵 、葛花解酲汤为对照 ,给予加减葛花解酲汤高 、低剂量药物治疗后检测各组大鼠血清 ALT、GSH含量。结果 模
型大鼠血清 ALT含量较正常组显著增高(P<0.01), GSH含量较正常组显著降低(P<0.01);给药各组血清中上述指标
较模型组有较明显的改善(P<0.01或 P<0.05)。结论 加减葛花解酲汤可通过保护酒精引起的慢性肝细胞损伤 ,抑制
肝组织内 ALT的升高 ,并能同时提高 GSH活性 , 增加 GSH的含量 , 对抗过氧化反应 , 从而达到防治慢性酒精性肝损伤的
作用 , 且疗效优于益肝灵与葛花解酲汤。
关键词:酒精性肝损伤;　加减葛花解酲汤;　大鼠;　血清丙氨酸氨基转移酶;　谷胱甘肽过氧化物酶
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)08-1926-02
　　加减葛花解酲汤主要由葛花 、葛根 、枳椇子 、党参 、白术 、茯
苓 、泽泻 、茵陈 、虎杖 、大黄 、丹参 、山楂等药组成 , 经临床验证对慢
性酒精性肝病有较好的防治疗效。为了进一步验证其防治作用
及其药效 , 以益肝灵 、葛花解酲汤为对照 ,分别观察了加减葛花解
酲汤对慢性酒精性肝损伤大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷
胱甘肽过氧化物酶(GSH)的影响 ,借以了解其对慢性酒精性肝损
伤的治疗作用。
1　材料
1.1　动物与分组 选取 SD大鼠 60只 , 雄性 , 体重 180 ～ 200 g,
清洁级 , 由广西中医学院实验动物中心提供。
1.2　药物与试剂 加减葛花解酲汤 、葛花解酲汤用广西中医学院
附属第一医院韩国煎药机制作 , 加减葛花解酲汤低剂量(等效剂
量)含生药 2.57 g/ml, 加减葛花解酲汤高剂量含生药 12.51 g/
ml, 葛花解酲汤(系解酒之古方 , 其组成与剂量按《兰室秘藏 》, 该
方由木香 、人参 、猪苓 、茯苓 、橘皮 、白术 、干姜 、神曲 、泽泻 、青皮 、
砂仁 、白豆蔻 、葛花组成)含生药 1.63 g/ml;益肝灵由北京市第四
制药厂生产;ALT、GSH试剂盒由南京建成生物研究所提供;56度
红星二锅头白酒由北京红星二锅头酒厂生产。
2　方法
2.1　动物分组与造模 将 60只 SD大鼠随机分成 6组 , 每组 10
只 , 即正常组 、模型组 、益肝灵组 、葛花解酲汤组(简称葛汤组)、
加减葛花解酲汤高剂量组(简称加减高组)、加减葛花解酲汤低
剂量组(简称加减低组)。正常组自由进食 、饮水 , 每天下午给予
等体积的等渗盐水灌胃;其余各组均参考文献 [ 1] , 用红星二锅
头(约为 10.2 mol/L酒精溶液)平均以 1.5 ml/100 g的剂量每日
早晨灌胃 1次 , 连续灌胃 8周。造模同时 , 益肝灵组 、葛汤组 、加
减低组 、加减高组分别按 0.03, 11.4, 15.8, 83.6 g/kg的剂量灌胃
给药。模型组给等体积的等渗盐水灌胃。
2.2　指标测定 全部大鼠于 8周后处死 , 剖杀前 12 h禁食 ,不禁
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8