全 文 ：Vo.l 28 高 等 学 校 化 学 学 报 No. 1
2 0 0 7 年 1月 　 　　　　　CHEM ICAL JOURNAL OF CH INESE UN IVERSITIES　　　　　 　 87～ 91
一种碱溶性灰树花菌丝体多糖 GFM2A
的制备和结构表征
于广利 , 王　莹 , 赵　峡 , 高昊东 , 管华诗
(中国海洋大学海洋药物与食品研究所 , 糖化学与糖工程实验室 , 青岛 266003)
摘要　以灰树花菌丝体为原料 , 经过碱提取和柱色谱分离纯化 , 得到一种碱溶性多糖 (GFM2A). 经高碘酸
氧化 、 Sm ith降解 、 乙酰解并采用 GCMS, IR, 2D NM R等方法对该多糖的化学结构进行了表征. 结果表明 ,
该多糖由葡萄糖(G lc)、甘露糖(M an)和木糖(Xy l)组成 , 其摩尔比为 9∶2∶1, 其主链由 6个 α-1, 3-D-G lc和 2
个 α-1, 3-D-M an构成 , 且 α-1, 3-D-G lc残基 O-4位有两个分支 , 其中一个分支连接 3个 β-1, 4-D-G lc, 另一个
分支连接一个 α-1, 4-D-Xy.l
关键词　灰树花菌丝体;多糖;制备;结构表征
中图分类号　O62;TQ464. 1　　　　文献标识码　A　　　　文章编号　0251-0790(2007)01-0087-05
收稿日期:2005-12-15.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:30370345)资助.
联系人简介:于广利(1964年出生), 男 , 博士 , 教授 , 主要从事糖化学与糖生物学研究. E-m ail:glyu@ ouc. edu. cn
灰树花 (Grifola. frondosa)属于担子菌纲多孔菌属担子菌 , 为名贵药食两用真菌. 目前 , 大规模液
体发酵工艺已经成熟 , 动物试验结果表明 , 灰树花菌丝体水溶性多糖具有良好的免疫调节和抗癌活
性 [ 1, 2] . 在灰树花多糖研究方面 , 国内外主要从事灰树花水溶性多糖的研究 [ 3 ～ 5] , 而对于灰树花菌丝体
中大量碱溶性多糖结构与活性研究则较少.
本文以发酵灰树花菌丝体为原料 , 采用冷碱提取方法 , 经纯化获得了 1种多糖 , 该多糖不溶于水
而溶于稀碱溶液 , 采用气相色谱(GC)、高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、红外光谱 (IR)和二维核磁共振
(2D NMR)等方法对其结构进行了表征. 该多糖经硫酸酯化修饰后得到一种水溶性化合物 , 初步小鼠
实验结果表明 , 其具有良好的抗肿瘤活性 , 为该类多糖结构与活性关系研究提供了有用信息.
1　实验部分
1. 1　试剂和仪器
灰树花菌丝体(济南澳利生物工程公司 , 批号 20040617);葡萄糖 、甘露糖 、半乳糖 、岩藻糖 、鼠李
糖 、阿拉伯糖 、木糖 、赤藓糖醇 、碘甲烷均为 S igma公司产品;葡聚糖分子量标准品购于日本 SHODEX
公司;其它试剂均为分析纯.
高效液相色谱仪 (Ag ilent 1100series);色谱柱 (Am inex HPX-87H , 7.8m ×300mm , B ioRad公司;
Supe rose 12, 10mm ×300 mm , Pharmacia公司 );紫外-可见分光光度计 (UV2102-PC , UN ICO上海公
司 );示差检测器(R132型 , G ILSON公司 );玻璃层析柱及填料(Sepharose CL-6B , XK26 /90 cm;Super-
dex 30
TM , XK16 /60 cm;Amersham B iosciences公司 ). 傅里叶变换红外光谱仪 (N ico let Nexus 470型;
Thermo E lectron公司 );超导核磁共振波谱仪 (Jeo l JNM-ECP 600M , 日本电子 );气质联用仪 (GC ,
HP5890Ⅱ;MSD , 5971A , Ag ilent公司).
1. 2　实验方法
参照文献 [ 5]的方法制备灰树花多糖. 将灰树花菌丝粉用乙醇脱脂 , 然后用蒸馏水回流提取 3次 ,
残渣用一定浓度的 N aOH 于 4 ℃提取离心后 , 上清液经中和离心 , 收集沉淀 , 得到碱溶性多糖
(GFM2). 采用低压凝胶渗透色谱(LPGPC)法对上述多糖进行纯化 , 用 Sepha rose CL 6B柱 (2.6 cm ×
100 cm)分离纯化 , 以 0.5mol /L N aOH洗脱 , 流速为 0.8mL /m in, 部分收集器收集各组分 , 用硫酸-苯
酚法测定多糖含量 , 收集合并含糖组分 (GFM2A).
采用高效凝胶渗透色谱法 (HPGPC)测定多糖分子量. 采用 Supero se 12(10 mm ×300 mm)柱 , 用
0.5mo l /L NaOH洗脱 , 柱温度 45 ℃, 流速 0.5mL /m in, 进样量 20μL, RI在线检测.
采用气相色谱(GC)法对样品进行单糖组成分析. 将样品全水解后经衍生为糖腈乙酸酯 , 以肌醇
六乙酸酯为内标 , 进行 GC分析 , 采用石英毛细管柱 QC3 AC225(0.25 mm ×30 m);进样口温度 250
℃;柱温 210℃;氢火焰离子化检测器(FID);检测器温度 250℃;载气为 N2气. 根据出峰时间和峰面
积比确定单糖组成并计算其摩尔比.
参照文献 [ 6 ～ 9]方法进行高碘酸氧化 、 Sm ith降解以及甲基化分析. 降解产物用 Am inex HPX-87H
柱分析 , 流动相为 5mmo l /LH2 SO 4溶液 , 流速为 0.6mL /m in, 柱温 65℃, 示差检测器检测. 部分甲基
化糖醇乙酸酯采用 GCMS进行分析.
参照文献 [ 10]方法采用溴化钾压片法对样品进行红外光谱 (IR)测定以及核磁共振波谱 (NMR)分
析. 将 30mg样品用 DMSO-d6溶解交换 3次 , 经 DMSO-d6溶解后加入核磁管 , 在 303 K下测定. 其中
1
H NMR和 13C NMR数据点分别为 1024和 512个 , 频率分别为 600MHz和 150MHz;二维 1H -1H COSY
和 1H-13C HMQC采集数据点(X轴 , Y轴 )分别为 1024×1024和 1024×512个.
2　结果与讨论
2. 1　GFM 2A的分离纯化
发酵灰树花菌丝粉经过超微粉碎后喷雾干燥 , 颜色为淡黄色. 经体积分数为 85%的乙醇脱脂 , 离
心除去脂质成分 , 然后对脱脂样品用沸水回流提取 3次去除水溶性杂质 , 最后将残渣用 2mo l /L NaOH
水溶液于 4℃搅拌提取 2次;上层粘稠液体经离心 、中和以及洗涤等步骤 , 得到粗多糖 GFM2(得率
4.2%). 该粗多糖为淡棕色 , 不溶于水 , 质量分数为 1%时能全溶于 0.5 mo l /L N aOH溶液中 , 表明该
类多糖分子间氢键作用力较强 , 需要一定浓度的碱才能溶解 , 属于碱溶性多糖. 将一定量 GFM2样品
溶于 0.5mo l /L N aOH溶液中 , 用 Sepha rose CL6B柱(V0 =140 mL, V t =540 mL)分离 , 碱溶液洗脱 , 分
步收集 (4.5 mL /管 ), 分别测定每管多糖 (490 nm)含量和蛋白质 (280 nm)含量 , 结果见图 1. 可以看
出 , GFM2主要含有 2个组分:组分 1(169 ～ 205mL)为多糖 , 组分 2(380 ～ 520mL)为杂蛋白. 将组分
1合并收集 , 用醋酸中和 , 用体积分数为 70%的乙醇洗涤至无盐 , 减压得到白色粉末 GFM2A.
F ig. 1　Pur ification ofGFM 2A on Sepharose
CL6B column
Fig. 2　Purity and m olecu lar we igh t analysis
of GFM 2A on superose 12 colum n
2. 2　GFM 2A的纯度和分子量分析
纯度和分子量采用 Supero se 12柱进行分析. 将系列葡聚糖标准品 (10000;21400;41100;84400,
133800)和样品用 0.5 mo l /L NaOH 配成 5 mg /mL溶液 , V t 和 V0分别采用葡萄糖和蓝色葡聚糖
(M r =2000000)进行标定. 所得方程为
Y =6.5059 - 0.9598X - 0.101X 2(R2 =0.9995, n =5;X:Ve /V0;Y:lgM r)
GFM2A在 HPGPC柱上得到一个单一对称峰 (图 2), 表明纯度很高 , 经过计算 , 其分子量为
109000.
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2. 3　单糖组成分析
GFM2A全水解后 , 进行 TLC定性以及 GC定量分析 , 结果表明 , 该多糖由葡萄糖 (G lc)、甘露糖
(Man)和木糖(Xy l)三种单糖组成 , 其摩尔比为 9∶2∶1.
2. 4　相邻糖残基之间连接方式分析
高碘酸氧化与 Sm ith降解:GFM2A在室温下经高碘酸氧化 , 每天测定 A223吸收值 , 至反应 7 d后
A223达到一稳定值 , 经计算共消耗高碘酸 0.0465mmol, 然后向反应体系中加入乙二醇中止反应 , 并以
0.01mo l /L N aOH溶液滴定甲酸 , 经计算共释放甲酸 0.0157 mmo l, 二者比例约 3∶1. 高碘酸的消耗量
大于甲酸释放量 , 说明支链分子中存在只消耗高碘酸而不释放甲酸的 1→4键型以及端基消耗高碘酸
并产生甲酸的 1→连接的键型. 高碘酸总体消耗量不高 , 且有大量不溶物 , 说明主链不易被氧化 , 尤其
是将不溶物进行完全酸水解后 , 产物中只有葡萄糖和甘露糖 , 表明主链由 1→3连接的 G lc和 M an组
成. 高碘酸氧化后的上清液经还原和酸水解后 , 产物中有赤藓糖醇和甘油 , 表明糖链中含有 1→4连接
的 G lc, 甘油的产生来自端基→1G lc和→1Xy l氧化产物.
甲基化分析:采用改良的 Hakomori法进行甲基化分析 , 甲基化产物经 IR分析 , 在 3500 cm - 1无吸
收峰 , 表明甲基化完全 , 然后采用体积分数为 90%的甲酸水解 、还原 , 得到甲基化糖醇 , 再经乙酰化 ,
得到部分甲基化糖醇乙酸酯 , 并进行 GCMS分析 , 各单糖衍生物质谱数据见表 1.
Tab le 1　GCMS analysis of ald itol ace tate s from GFM 2A
tR /m in A lditol acetates of sugar Fragm en tm /z Linkage M olar ratio
18. 58 2, 3, 4-T ri-O-M e-Xyl 43, 45, 87, 101, 117, 161 — 1Xy l 0. 97
21. 54 2, 3, 4, 6-Tetra-O-M e-G lc 43, 45, 71, 87, 101, 117, 129, 145, 161, 205 — 1G lc 1. 00
23. 89 2, 4, 6-Tri-O-M e-M an 43, 45, 87, 101, 117, 129, 161, 233 ― 1M an3― 2. 05
23. 89 2, 4, 6-T ri-O-M e-G lc 43, 45, 87, 101, 117, 129, 161, 233 ― 1G lc3― 4. 06
24. 07 2, 3, 6-T ri-O-M e-G lc 43, 45, 87, 101, 117, 129, 161, 233 ― 1G lc4― 2. 12
25. 94 2, 6-D i-O-M e-G lc 43, 87, 117, 129, 159, 305 ― 1G lc3―4 2. 00
　　由表 1数据分析可知:(1)在 GFM2A中 1→3连接为主要键型 , 1→4及 1→3, 4键型次之 , 非还原
端各有一个 G lc和一个 Xy l, 各单糖摩尔比约为 9∶2∶1, 符合 GC分析结果;(2)因 2, 4, 6-三-O-甲基-甘
露糖和葡萄糖醇乙酸酯保留时间相近 , 在 GC中显示为单一峰 , 又由于相同连接位置的部分甲基化糖
醇乙酸酯的异构体具有相同的质谱图 , 所以保留时间 23.89m in是 1→3键型的 G lc和 M an, 又根据选
择性乙酰解结果得到主链上 G lc与 M an的摩尔比为 3∶1, 以及 1, 3, 4-G lc摩尔数为 2, 从而确定
― 1G lc3―和― 1Man3―摩尔数分别为 4和 2;(3) 2, 3, 4 , 6-te tra-O-M e-G lc和 2, 3, 4-tri-O-M e-D-Xy l为非
还原末端残基 , 表明侧链末端为→1G lc和→1Xy l, 从而确定了侧链 Xy l的键型和位置;(4)由于只存在
2, 6-di-O-Me-G lc, 从而可确定主链分支点为(1→3, 4)-G lc, M an上无分支;(5)由于存在 2, 3, 6-tri-O-
M e-G lc, 结合高碘酸氧化和 Sm ith降解结果 , 可确定另一个侧链由 1→4G lc重复单元构成.
样品经全乙酰化后进行选择性乙酰解 , 由于 β-1, 4糖苷键的水解速度约是 α-1, 3糖苷键的 4倍以
上 , 因此通过控制水解温度和时间 , 可以得到侧链可溶性 β-1, 4糖苷键寡糖混合物以及水不溶性多糖
主链. 可溶性寡糖经 MeONa脱乙酰基后 , 采用 Superdex 30TM Prep柱进行分离和制备 , 通过荧光标记糖
电泳(FACE)以及 TLC分析表明 , 乙酰解产物中除了单糖(G lc和少量 Xy l)外 , 主要为二糖和三糖. 通
过对支链寡糖产物采用微量甲基化分析 , 结合 GCMS碎片分析 , 表明该寡糖均由葡萄糖组成 , 且糖链
之间为 1 , 4糖苷键连接 , 由此证明 GFM2A含有 2个侧链 , 一个为纤维三糖 , 另一个为木糖. 乙酰解不
溶物 , 经酸全水解并进行 GC分析 , 结果表明只含有 G lc和 Man, 且二者摩尔比为 3∶1 , 进一步确定主
链只由 G lc和 Man二种单糖组成.
2. 5　IR分析
IR分析结果表明 , GFM 2A在 2931和 1362 cm -1处有两组特征吸收峰 , 分别代表了糖类化合物的
C—H伸缩振动和变角振动 , 3420 cm - 1处有强吸收 , 为糖类化合物 O—H伸缩振动;1148和 1039 cm - 1
处的强吸收为糖环内醚 C—O—C中的 C—O伸缩振动和 C—O—H的 O—H变角振动;930 cm -1为吡
89　No. 1 　 于广利等:一种碱溶性灰树花菌丝体多糖 GFM2A的制备和结构表征
喃糖 C—O—C吸收;847 cm - 1为 α-D-G lc吡喃构型的特征吸收;822 cm - 1为 α-M an吡喃构型的特征吸
收 , 在 890 cm -1附近有一弱吸收 , 表明分子中有 β-D-G lc的 C—H差向异构吸收峰 , 740 cm - 1为 α-D-
Xy l信号. 综上 IR信息表明 , GFM2A主要为 α构型 , 同时也存在少量 β构型.
3. 6　NMR分析
为进一步确定各多糖结构 , 本文应用1H NMR和 13 C NMR(图略)以及 1H-1H COSY和 1H-13C HMQC
(图 3)对 GFM2A结构进行了进一步分析. 在 1H NMR中 , δ5.07为 G lc和 M an的 H1α信号峰 , δ4.96
为 α-Xy l的 H1信号峰 (参考 h ttp:/ /www. ccrc. uga. edu /specdb /specdbframe. htm l), δ4.89为侧链 G lc
的 H1β信号峰 , δ83.8和 82.8分别为 G lc和 Man的 C3信号峰.
F ig. 3　The 1H-1H CO SY and 1H-13C HMQC spectra ofGFM 2A
(A) a. α- 1, 3-G lc H 1 /H2;b. α-1, 3-ManH 1 /H2;c. β-1, 4-G lc H1 /H 2;d. α-1, 4-Xyl H1 /H 2. (B) a. α-1, 3-G lc H 1 /C1;
b. α-1, 3-M anH 1 /C 1;c. α-1, 4-Xy lH 1 /C1;d. β-1, 4-G lc H1 /C1;e. β-1, 4-G lcH 2 /C2;.f α-1, 3-M an H5 /C5;g. α-1, 3-G lc
H 5 /C5;h. α-1, 3-M an H 3 /C3; .i α-1, 3-G lc H3 /C3; .j β-1, 4-G lc H6 /C6;k. α-1, 4-Xyl H 5 /C5; .l α-1, 3-G lc H 2 /C2;
m. α-1, 3-G lcH 6 /C 6.
13
C NMR中 , δ102为侧链 G lc的 C1β信号峰 , δ100.1弱吸收为侧链 Xy l的 C1α信号峰 , δ99.87
强吸收峰为主链 G lcC1α信号 , δ99.80弱吸收为主链M an C1α信号峰 , 在 HMQC谱低场区域中 , 主链
中 α-1, 3-D-G lc和 α-1, 3-D-M an以及支链中 β-1, 4-D-G lc和 α-1 , 4-D-Xy l的 C1 /H1相关信号分别为
99.88 /5.07, 99.80 /5.07, 102.2 /4.89和 100.1 /4.96, 此外还可以得到主链中 β1, 4-G lc取代的 1, 3-α-
G lc分支点的 C1 /H1信号(99.88 /5.13), 其它有关数据见表 2.
Tab le 2　C ross peak signals of GFM 2A in 1H-13C HMQC
Sugar residue
C hem ical sh ift, δ
C 1 /H1 C2 /H 2 C3 /H 3 C 4 /H4 C5 /H 5 C6 /H6
α-1, 3-D-G lc[ 11] 99. 88 /5. 07 70. 91 /3. 37 82.80 /3. 61 69. 43 /3. 51 71. 99 /3. 81 63.06 /3. 29
α-1, 3-D-Man[ 11] 99. 80 /5. 07 70. 90 /3. 61 83.80 /3. 72 67. 40 /3. 61 72. 56 /3. 82 62.10 /3. 36
β-1, 4-D-G lc[ 11] 102. 2 /4. 89 70. 80 /3. 85 76.75 /3. 72 78. 80 /3. 41 75. 90 /3. 64 60.13 /3. 61
α-1, 4-D-Xy l[ 11] 100. 1 /4. 96 72. 50 /3. 25 73.80 /3. 64 71. 90 /3. 41 62. 20 /3. 41
α-1, 3, 4-D-G lc 　99. 88 /5. 13 88. 25 / 　
　　综合高碘酸氧化 、 Sm ith降解 、乙酰解 、甲基化分析及 GC , IR以及 NMR分析 , 确定该多糖由葡萄
糖 、甘露糖和木糖组成 , 其主链由 6个 α-1, 3-D-G lc和 2个 α-1, 3-D-M an构成 , 且主链 α-1, 3-D-G lc残
基 O-4位有两个分支 , 其中一个分支连接三个 β-1, 4-D-G lc, 另一分支连接一个 α-1, 4-D-Xy l, 一个支链
由 β-1, 4-葡聚糖组成 , 另一个支链由 α-1, 4-木糖组成 , 其可能的重复结构如图 4所示.
利用发酵工程技术获得的灰树花多糖是近年来真菌多糖研究和开发的热点之一. 由于发酵法不受
季节 、气候以及生长环境的影响 , 所得多糖结构稳定 , 有利于工艺的改进 , 通过研究发现 , 灰树花菌丝
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F ig. 5　Chem ica l structure ofGFM 2A from G rifola frondosa mylelium
体中除了含有大量水溶性 β-1, 3 /1, 6-葡聚糖外 , 仍含有大量水不溶但碱溶性的 α-葡聚糖 , 而这类不同
来源的 α-1, 3-葡聚糖及其衍生物同样具有良好的生物活性 [ 12 ～ 14] . 本文运用所得多糖 , 经硫酸酯化修饰
后得到其硫酸酯化衍生物 , 初步小鼠实验结果显示了其良好的免疫增强和抗 S180肿瘤活性 , 为该类真
菌多糖药用新资源的开发及其构效关系的深入研究 , 提供了重要的结构数据.
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Polysaccharide from Grifola frondosaMycelium
YU Guang-Li* , WANG Y ing, ZHAO Xia, GAO H ao-Dong, GUAN Hua-Shi
(MarineD rug and Food Institute, Lab of Glycochem istry＆Glycotechnology,
Ocean University of Ch ina , Qingdao 266003, Ch ina)
Abstract　An a lkali-so luble po lysaccharide(GFM2A)was ex tracted by co ld sodium hydrox ide and further
purified by co lumn chrom atog raphy from fe rmented Grifola frondosa mycelium. The structu ra l cha racterization
ofGFM 2A was confirmed by N aIO4 oxidation, Sm ith degradation, ace to ly sis, GCMS, IR and NMR tech-
niques. The resu lts showed tha tGFMZA contain glucose(G lc), mannose(M an)and xy lose(Xy l), and their
mo lar ratio w as 9∶2∶1. The re are six α-1, 3-D-G lc and two α-1, 3-D-M an in the backbone, and there are tw o
branches in them ain chain, and bo th o f them linked to α-1, 3-D-G lc residue, one branch contains three β-1,
4-D-G lc, anothe r branch contains one α-1, 4-D-Xy.l
Keywords　Grifola frondosa m yce lium;Po lysaccha ride;Preparation;Structure characterization
(Ed. :H , J, Z)
91　No. 1 　 于广利等:一种碱溶性灰树花菌丝体多糖 GFM2A的制备和结构表征