全 文 ：作者简介:胡宗礼 ,男 ,副教授　　研究方向:中药药理　　Tel:(0751)8120123　　E-mail:sgu-hu-zl@sohu.com
甘木通抗心肌缺血的有效部位与作用研究
胡宗礼 ,黄晓萍 ,陈珺霞(韶关学院英东生命科学学院 , 广东韶关 512005)
摘要:目的　研究甘木通抗心肌缺血的有效部位及抗心肌缺血作用。方法　甘木通乙醇提取物被分离成 6个组分 ,记录各组分
对结扎家兔冠状动脉左前降支后Ⅱ导联心电图 T波与 S-T段的影响 , 筛选出有效组分。然后实验分为假手术组 、心肌缺血模型
组 、甘木通组(高 、低剂量)和丹参对照组 ,记录缺血前后的Ⅱ导联心电图 , 1 h后 , 取血测定血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶
(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平;另取缺血区心肌检测凋亡细胞及凋亡相关基因 Bcl-2与 Bax的蛋白表达。
结果　甘木通乙醇提取物的乙酸乙酯部分能明显改善心肌缺血后Ⅱ导联心电图 T波与 S-T段的偏移, 经定性检测具有黄酮类成
分的特性。与模型组比较, 甘木通提取物乙酸乙酯部分能明显降低心肌缺血家兔血清 CK、LDH和 MDA水平和升高 SOD水平
(P<0.01);显著抑制心肌缺血引起的细胞凋亡 , 增加 Bcl-2和抑制 Bax的蛋白表达(P<0.01)。结论　甘木通提取物的乙酸乙
酯部分是其抗心肌缺血的主要有效部分, 具有黄酮类特性, 通过提高抗氧化能力和抑制细胞凋亡发挥抗心肌缺血作用。
关键词:甘木通;黄酮;心肌缺血;抗氧化;细胞凋亡
中图分类号:R965　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-2494(2011)09-0668-03
StudyontheEffectivePartandActionsofClematisfilamentosaDunnonMyocardialIschemiainRabbits
HUZong-li, HUANGXiao-ping, CHENJun-xia(YingdongLifeScienceSchoolofShaoguanColege, Shaoguan512005, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　TostudytheefectivepartandactionsofClematisfilamentosaDunn(CFD)onmyocardialischemiain
rabbits.METHODS　SixpartswereseparatedfromalcoholextractofCFD.TheirefectsontheTwaveandS-Tofmind-leadECGⅡ
oftherabbitswereobservedafterligatingtheleftanteriordescendingbranchofcoronaryarteryfor1 h.Thentherabbitsweredivided
intoshamgroup, myocardialischemiamodelgroup, CFDgroup(highandlowdose)andSalviaeMiltorrhizaegroup.1 haftertreat-
ment, thelevelsofcreatinekinase(CK), lactatedehydrogenase(LDH), superoxidedismutase(SOD)andmalondialdehyde(MDA)in
serumweredeterminated, whiletheapoptoticcardiomyocytesweredetectedbyinsituendlabelingmethod, andtheexpressionsofBcl-
2 andBaxwereshownbyimmunohistochemistrymethod.RESULTS　TheethylacetatepartofCFDextractwhichhadflavonoidsfea-
tureindicatedbyqualitativetest, couldsignificantlyimproveECGⅡ deflectioncausedbymyocardialischemia.Inthegrouptreated
withethylacetatepartofCFDextract, thelevelsofCK, LDHandMDAinserumdecreased, andSODlevelincreasedmarkedlycom-
paredwithmyocardialischemiamodelgroup(P<0.01).Comparedwithmodelgroup, therewerelessapoptosismyocardialcelsin
CFDgroup.TheexpressionofBcl-2 proteininCFDgroupincreasedandBaxproteindecreased, andtheratioofBcl-2/Baxincreased
comparedwithmodelgroup(P<0.01).CONCLUSION　TheseresultssuggestthatethylacetatepartofCFDextractisthemajoran-
ti-ischemiaactivepart, whichhasflavonoidsfeature.Thepossiblemechanismistoenhanceantioxidantabilityandinhibitcardiomyo-
cyteapoptosistoalleviateinjuryinducedbymyocardialischemia.
KEYWORDS:ClematisfilamentosaDunn;flavonoids;myocardialischemia;antioxidant;apoptosis
　　甘木通(ClematisfilamentosaDunn)为毛茛科丝
铁线莲属植物 ,以叶 、茎入药 ,对心血管疾病 (冠心
病 、高血压)有显著疗效 [ 1] 。目前关于甘木通的化
学成分及抗心肌缺血的有效成分尚不明确 ,该实验
通过结扎家兔冠状动脉左前降支建立心肌缺血模
型 ,筛选出甘木通抗心肌缺血的有效作用部位 ,并探
讨其可能的作用机制 。
1　材料与方法
1.1　主要药品与试剂
甘木通药材(由胡家礼副教授鉴定。广东雷霆国
药有限公司)。丹参注射液(辅仁药业集团有限公
司)。肌酸激酶(CK)试剂盒 、乳酸脱氢酶(LDH)试剂
盒 、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒 、丙二醛(MDA)试
剂盒(南京建成生物工程公司)。原位细胞凋亡及
Bcl-2与 Bax免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物
工程有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。
1.2　仪器
RM-6240C型四道生理信号采集处理系统(成
都仪器厂);UV-754型紫外可见分光光度计(上海
第三分析仪器厂);RE-52B型旋转蒸发器(上海雅
荣生化设备仪器有限公司);TC-120型智能程控生
物组织全自动脱水机(湖北泰维医疗科技有限责任
公司);HPIS-2000型病理图像分析系统(西安华海
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医疗信息技术股份有限公司);BX41型正置系统金
相显微镜(日本 OLYMPUS公司)。
1.3　甘木通有效部位的筛选
1.3.1　甘木通提取物的制备与分离　甘木通药材
粉末用体积分数 70%乙醇于 90 ℃加热回流提取 1
h,合并 3次滤液减压浓缩回收至无醇味后 ,依次用
乙酸乙酯 、正丁醇各萃取 5次 ,得到 3个部分 ,减压
回收溶剂 ,分别上聚酰胺柱 ,乙酸乙酯和正丁醇部分
先用蒸馏水洗脱至流出液无色后再用 90%乙醇洗
脱 ,水层部分先用 90%乙醇洗脱至流出液无色后再
用蒸馏水洗脱 ,共得到 6个组分 ,分别减压浓缩 、干
燥 ,分别配制成 2%的溶液备用。
1.3.2　实验动物与心肌缺血模型的制备　家兔由
本校动物疫病研究所提供 ,用 20%乌拉坦静脉注射
(2 mL· kg-1)麻醉后记录标准肢体 Ⅱ导联心电图 ,
筛选出心电图正常的家兔经麻醉 、固定 ,从胸骨左侧
第 1 ～ 3肋间开胸 ,暴露心脏 ,用圆形无创缝合针将
3 /0丝线于左心耳下方冠状动脉左前降支 3 mm处
肌层穿过并结扎 。
1.3.3　甘木通抗心肌缺血部位的筛选　实验分 6
组 ,待结扎后家兔心电图 T波和 /或 S-T段发生明显
改变后由静脉注射受试药物(20 mg· kg-1),观察
给药后心电图 T波和 S-T段的变化 ,时间 1 h,然后
对筛选出的组分进行定性鉴定 。
1.4　实验分组
根据筛选结果 ,实验分假手术组 、心肌缺血模型
组 、甘木通组(高 、低剂量)和丹参对照组。各组家兔于
冠状动脉左前降支结扎前从静脉给药。假手术组和模
型组给予生理盐水(1mL· kg-1),丹参组为 0.2mg·
kg-1 ,甘木通高、低剂量组分别为 20和 10mg·kg-1。
1.5　观察指标
1.5.1　Ⅱ导联心电图 T波及 S-T段的偏移　家兔
心肌缺血后 ,每 10 min记录 1次心电图 ,测定 T波
的幅度(mV)、S-T段的偏移(mV)并计算心率 ,共记
录 60min。
1.5.2　血清 CK、LDH、SOD、MDA水平测定　缺血
1 h后 ,从左心室取血 ,按试剂盒说明测定血清 CK、
LDH、SOD、MDA水平。
1.5.3　心肌凋亡细胞及凋亡相关基因 Bcl-2与 Bax
蛋白表达检测　缺血 1 h后 ,取缺血区心肌经固定 、
切片 ,用 TUNEL法检测凋亡细胞 ,用免疫组化法检
测凋亡相关基因 Bcl-2与 Bax的蛋白表达 。每张切
片在显微镜下选择 5个不同的视野 ,计算凋亡细胞
数 ,用病理图像分析系统测定 Bcl-2、Bax蛋白免疫
反应产物的吸光度(A)值。
1.6　统计学处理
实验数据用 x±s表示 ,采用 SPSS11.5统计软
件进行方差分析和组间 t检验 ,以 P<0.05作为有
无统计学意义的界值。
2　结　果
2.1　甘木通抗家兔心肌缺血的有效部位
除乙酸乙酯的乙醇洗脱组分 ,其他 5个组分对
缺血后家兔Ⅱ导联心电图 T波及 S-T段的偏移均无明
显影响。经盐酸-镁粉反应和硝酸铝反应乙酸乙酯组
分呈紫红色 ,显示黄酮类化合物的特性 ,初步判定属
于黄酮类 、二氢黄酮类 、黄酮醇类或二氢黄酮醇类。
2.2　甘木通黄酮对心肌缺血家兔 Ⅱ导联心电图的
影响
与假手术组比 ,模型组家兔心电图 T波高耸 , S-
T段明显抬高 ,心率明显增快(P<0.01),这些表现
在甘木通黄酮组和丹参对照组均显著改善 (P<
0.01),结果见表 1。
2.3　甘木通黄酮对心肌缺血家兔血清 CK、LDH、
SOD及 MDA水平的影响
与假手术组比较 ,模型组家兔血清 CK、LDH和
MDA水平明显升高 ,而 SOD水平显著降低 (P<
0.01)。甘木通黄酮能显著升高血清 SOD, 降低
CK、LDH和 MDA水平(P<0.01),结果见表 2。
2.4　甘木通黄酮对家兔心肌缺血细胞凋亡和 Bcl-2
与 Bax蛋白表达的影响
在假手术组仅见极少数的凋亡细胞 ,模型组凋
亡细胞明显增多 , Bcl-2与 Bax蛋白表达虽然也显著
增多 ,但 Bcl-2/Bax值显著降低(P<0.01)。甘木通
黄酮组与丹参组的凋亡细胞数明显减少 , Bcl-2蛋白
　　
表 1　甘木通提取物对心肌缺血 1 h时家兔心电图的影响.
n=10, x±s
Tab.1　EffectsofCFDextractonECGinrabbitswithmyocar-
dialischemia.n=10, x±s
Group Dose/mg· kg-1 Twave/mV S-T/mV HR/min-1
Sham 0.148±0.024 0.042±0.028 241.4±35.3
Model 0.376±0.0881) 0.727±0.2131) 371.3±56.41)
CFD 10 0.197±0.0452) 0.437±0.1882) 268.3±32.62)
20 0.184±0.0322) 0.383±0.1722) 246.4±45.62)
SM 0.2 0.193±0.0212) 0.397±0.1312) 281.8±36.12)
注:与假手术组比较 , 1)P<0.01;与模型组比较 , 2)P<0.01。 CFD-甘木通提
取物乙酸乙酯部分;SM-丹参注射液
Note:1)P<0.01, vssham;2)P<0.01, vsmodelgroup.CFD-ethylacetatepartof
extractionfromClematisfilamentosaDunn;SM-injectionofSalviaeMiltorrhizae
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表达明显增加 , Bax蛋白表达明显降低 , Bcl-2/Bax
值显著提高(P<0.01),结果见表 3。
3　讨　论
大量的研究证实 ,心肌缺血时使氧自由基大量
产生 ,对心肌细胞膜产生脂质过氧化作用 ,破坏细胞
膜的结构和功能 ,加速心肌细胞损害程度 [ 2] 。心电
图 S-T段及 T波常用来反映心肌的缺血程度;血浆
及心肌组织中 LDH、CK活性增加被认为是心肌细
胞损伤最敏感的指标 ,心肌酶释放入血的多少与心
肌坏死程度呈正相关 [ 3] ,因此测定心电图 S-T段的
偏移幅度 、T波的幅度以及心肌酶活性对于判断心
肌缺血损伤的程度和范围具有一定的参考价值 [ 4] 。
实验结果显示 ,甘木通提取物的乙酸乙酯部分能明
显改善缺血心肌家兔 Ⅱ导联心电图 T波和 S-T段的
异常 ,并显著提高血清 SOD水平 、降低 CK、LDH水
平 、减慢心率。心肌耗氧量与心率 、心肌收缩力 、心
室壁肌张力等密切相关 ,实验结果表明 ,甘木通提取
物乙酸乙酯部分通过减慢心率降低心肌耗氧量可能
　　
表 2　甘木通提取物对心肌缺血家兔血清 CK、LDH、SOD及
MDA的影响.n=10, x±s
Tab.2　EfectsofCFDextractonthelevelsofCK, LDH, SOD
andMDA ofserum inrabbitswithmyocardialischemia.
n=10, x±s
Group Dose/mg· kg-1
CK/
U· kg-1
LDH/
U· kg-1
SOD/
U· kg-1
MDA/
nmoL· kg-1
Sham 92.4±17.6 2 235.3±574.2 251.3±37.2 2.28±0.76
Model 161.5±28.21) 4 157.7±823.61)105.5±24.81) 6.74±0.921)
CFD 10 112.7±28.12) 3 044.4±542.52)162.6±22.72) 4.18±0.642)
20 98.2±22.72) 2 665.3±635.52)209.8±38.22) 3.25±0.652)
SM 0.2 98.4±24.72) 2 684.2±728.32)194.4±25.62) 3.08±0.732)
注:与假手术组比较 , 1)P<0.01;与模型组比较 , 2)P<0.01
Note:1)P<0.01, vssham;2)P<0.01, vsmodelgroup
表 3　甘木通提取物对家兔心肌缺血细胞凋亡及 Bcl-2与
Bax蛋白表达的影响.n=10, x±s
Tab.3　EfectsofCFDextractonapoptosisandtheexpression
ofBcl-2 and Bax in rabbitswith myocardialischemia.
n=10, x±s
Group Dose/mg· kg-1
Apoptosis
/count ABcl-2 ABax ABcl-2 /ABax
Sham 1.96±0.58 0.06±0.03 0.05±0.02 1.13±0.14
Model 14.37±2.191) 0.18±0.031) 0.24±0.031) 0.74±0.221)
CFD 10 8.73±2.243) 0.24±0.032) 0.18±0.032) 1.15±0.242)
20 7.52±1.943) 0.38±0.043) 0.14±0.023) 2.69±0.333)
SM 0.2 8.48±2.193) 0.32±0.023) 0.17±0.033) 2.01±0.433)
注:与假手术组比较 , 1)P<0.01;与模型组比较 , 2)P<0.05, 3)P<0.01
Note:1)P<0.01, vssham;2)P<0.05, 3)P<0.01, vsmodelgroup
是其保护缺血心肌的一个重要途径 ,减慢心率的机
制有待进一步研究 。
细胞凋亡是一种不同于病理性坏死的细胞死亡
方式 ,是维持细胞增殖与死亡间平衡的重要方式。
在缺血状态下 ,心肌细胞可发生凋亡和坏死 ,而凋亡
可能超前于凝固性坏死 ,提示早期心肌损伤的主要
形式是细胞凋亡[ 5] 。细胞凋亡是由基因调控的细
胞主动死亡过程 , 调控基因包括:①促凋亡基因
ICE、Bax、P53、Fas等;②抗凋亡基因 Bcl-2、EIB、IAP
等;③双向调节基因 C-myc、Bcl-X等 。其中 Bcl-2、
Bax基因是目前研究较明确的一对在功能上相互对
立的凋亡调控基因 ,二者相互作用 ,共同决定细胞是
否进入凋亡程序 ,二者的表达比率是决定细胞在体
内受到某种刺激之后是否会发生凋亡的一个重要因
素 ,即 Bcl-2表达增加抑制凋亡 , Bax表达增加则促
进凋亡[ 6-8] 。实验表明 ,甘木通提取物的乙酸乙酯部
分通过提高 Bcl-2和抑制 Bax的表达 ,能明显抑制
缺血心肌的细胞凋亡。
黄酮类化合物的突出特点是其强大的清除自由
基和抗氧化作用 ,实验发现甘木通抗心肌缺血的提取
物乙酸乙酯部分具有黄酮类化合物的特性 ,可能通过
提高抗氧化能力和抑制心肌细胞凋亡 ,发挥对缺血心
肌的保护作用 ,确切的有效成分有待于进一步研究。
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