全 文 ：文章编号:1004—5570(2004)04-0015-04
环草石斛(D .loddigesii Rolfe.)快速繁殖研究

卢文芸1 ,张宇斌1 ,唐金刚1 ,乙　引1 ,严志坚2
(1.贵州师范大学 生物技术与工程学院 , 贵州 贵阳　550001;
2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 ,贵州 贵阳　550002)
摘要:用环草石斛的茎段作为外植体进行组织培养 , 以MS 培养基为基本培养基 , 通过形成丛生芽的形式快速繁
殖试管苗 ,改变了过去通过原球茎诱导途径进行繁殖的方式 , 简化了操作步骤。结果表明:芽诱导 、芽增殖与继
代培养基 、壮苗与生根培养基分别以 MS+NAA 0.1mg/ L+6-BA 1.0mg/ L、MS+NAA 0.1mg/ L+6-BA 3.0mg/ L、
1/ 2MS+NAA 0.7mg/ L为最好;移栽最适基质以碳酸盐小石子∶杉木屑=1∶2 ,上面铺盖 1cm 厚的苔藓为最好 , 幼苗
的成活率达 95%;取材的位置不同对环草石斛出芽也有一定的影响 , 茎尖部位明显要高于其它部位 , 茎中部次
之 ,而茎基部几乎不能萌发;茎段外植体苗比种子苗成株快 , 茎粗 , 苗壮 , 易成活;外植体苗分段增殖时基部茎段
的增殖系数比上部茎段大 ,生长速度快。继代增殖苗段比野生植株增殖快。同时还总结了环草石斛的组织培养
和快速繁殖过程 ,并对其工业化生产进行了初步讨论。
关 键 词:环草石斛;茎段培养;快速繁殖;丛生芽诱导
中图分类号:Q945.5　　文献标识码:A
Tissue culture and rapid propagation of Dendrobium loddigesii Rolfe
LU Wen-yun1 ,ZHANG Yu-bing1 ,TANG Jing-gang1 ,YI Yin1 ,YAN Zhi-jian2
(1.School of Biological Technology and Engineering , Guizhou Normal University , Guiyang , Guizhou 550001 , China;
2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and the Chinese Academy
of Sciences , Guiyang , Guizhou 550002 , China)
Abstract:This article studied tissue culture and rapid propagation of Dendrobium loddigesii Rolfe., includ-
ing induced germination of lateral buds , formation of rosette buds , induction of roots and condition of trans-
cultivation.The results showed that the optimal media for bud induction ,propagation , root induction and cul-
tivation were MS+NAA 0.1mg/L +6-BA 1.0mg/L ,MS+NAA 0.1mg/L+6-BA3.0mg/L ,1/2MS+
NAA 0.7mg/L , and carbine stone∶saw dust=1∶2 respectively.The propagation coefficient was 6.2 , and the
survival rate of tubing shoots approached 95%.
Key words:Dendrobium loddigesii Rolfe.;stem culture;rapid propagation;bud induction
　　目前以石斛加工而成的各类药品及滋补品走
俏市场 ,加之石斛对生长条件要求苛刻 ,自然繁殖
力极低 ,生长缓慢 ,因而导致野生石斛遭到掠夺性
的采挖 ,数量急剧减少 ,有的品种已处于濒危状态 ,
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收稿日期:2004-06-02
基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长基金项目(200104 , 200105)
作者简介:卢文芸(1969.12-),女 , 在读硕士研究生 ,研究方向:植物生理生态。
　第 22 卷 第 4期
2004 年 11 月 　　　　　　　
贵州师范大学学报(自然科学版)
Journal of Guizhou Normal University(Natural Sciences)　　　　　　　　
Vol.22.No.4
Nov.2004
DOI :10.16614/j.cnki.issn1004-5570.2004.04.004
石斛野生资源已到了相当匮乏的地步。由于石斛
的栽培也一直存在着存活率低 ,产量低 ,进入盛产
期年限长的问题 ,因此 ,石斛药源一直处于紧张状
态 ,亟待解决。[ 1]为挽救物种 ,扩充药源 ,多家研究
单位对其进行组织培养研究 ,但大多为种子苗培
养 ,试管苗茎细 ,苗弱 ,脱瓶移栽成活率低。为此 ,
我们选用贵州环草石斛为材料 ,通过研究茎段组织
培养诱导丛生芽的方法 ,摸索出了芽的诱导 、增殖 、
继代 、壮苗 、生根和移栽的最适条件;同时 ,还首次
报道了环草石斛茎段不同取材部位对侧芽萌动的
影响;不同取材部位茎段外植体苗生长发育的比
较。这为进一步提供可脱瓶移栽的种苗 ,实现工厂
化快速繁殖提供条件;为该植物商业化生产奠定了
基础;为该中药资源的保护和有效利用提供了理论
基础;同时还对贵州喀斯特石山地区的生态重建 、
环境改善 、经济发展具有重要意义 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
环草石斛(D.loddigesii Rolfe.),又名粉花石
斛 、美花石斛 、小环草 、小黄草 。环草石斛植株采自
贵州省黔西南州兴义市则戎乡枇杷村。植株采回
后置于温室中培养。
1.2　实验方法
1.2.1　材料处理与接种
从生长健壮的植株上取直径约为 0.7 ～
1.0cm ,长约 4 ～ 6cm的带侧芽的茎段 ,自来水冲洗
2 ～ 3h ,再用洗洁精浸泡 1min ,洗净后用自来水冲洗
30min。然后放于 75%乙醇中浸 30s ,再在 0.1%升
汞溶液中处理8 ～ 10min。表面消毒后 ,用无菌水冲
洗5 ～ 6次 ,用滤纸吸干水分 ,切掉基部伤口褐化部
分后 ,将茎段剪切成 0.5 ～ 1.0cm的小段(每段必须
带节),接种于培养基上 , 10d左右腋芽开始萌发 ,
20d后芽长到 1.5cm 左右 。此时 ,将芽切下转入下
一步培养基。
1.2.2　培养基筛选
本实验采用了 MS 培养基附加适量的激素进
行筛选 ,实验表明:茎段芽诱导培养基以 MS+NAA
0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L 为最好 ,芽增殖与继代
培养基以 MS+NAA 0.1mg/L+6-BA 3.0mg/L为
最好;壮苗 、生根培养基以 1/2MS +NAA 0.7mg/L
为最好;以上培养基蔗糖均为 3%,琼脂均为 1%。
以上各种培养基均用 0.2mol/L 的 HCL 或 KON来
调节 pH 值为 5.8 ～ 6.2。试管苗继代培养中 ,以 40
天换 1次培养基 ,苗长势最好。培养基采用高压蒸
汽灭菌 ,在 0.1 ～ 0.15Mpa 压(120 ～ 125℃)下保持
15 ～ 20min 。
1.2.3　培养器皿
初代培养采用 50mL 的锥形瓶 ,每瓶盛 15mL
培养基 ,用塑料膜封口 ,并用橡皮筋扎紧;继代 、增
殖和生根培养均用 250mL 的玻璃瓶 ,每瓶盛 30 ～
40mL 培养基 ,用配套的塑料盖拧紧 。
1.2.4　培养条件
培养温度为 23±2℃,光周期 12h/12h ,光照强
度 1 500 ～ 2 000lx 。
2　结果与分析
2.1　不同激素浓度对环草石斛侧芽萌发的影响
表 1　不同激素浓度对环草石斛侧芽萌发的影响
Tab.1　Effect of plant hormone concentrations on germination
of side-buds of Dendrobium loddigesii
植物激素/(mg/ L)
6-BA NAA 6-BA/NAA
外植
体数
萌发
侧芽数
出芽率
/ %
0 0 0 70 0 0
2.0 0.5 4 68 23 33.8
2.0 0.3 6.7 74 28 37.8
3.0 0.3 10.0 69 37 53.6
1.0 0.1 10.0 72 52 72.2
　　将经消毒处理的外植体接种于含不同 6-BA 、
NAA浓度配比的 MS 培养基中观察侧芽的诱导情
况(表 1)。由表1可知 ,细胞分裂素和生长素的浓
度和比例对环草石斛侧芽的诱导影响很大。在无
激素的 MS 培养基上 , 环草石斛外植体生长 30d
后 ,仍不能诱导侧芽萌发;当 6-BA 浓度位 2.0 , 6
-BA/NAA比例为 4或 6.7时 ,侧芽诱导率分别为
33.8%和 37.8%;当 6-BA 浓度为 1.0 , 6-BA/
NAA比例为 10 时 ,侧芽诱导率依次为 53.6%和
72.2%。由此可见 ,选用MS+NAA 0.1mg/L+6-
BA 1.0mg/L培养条件对于环草石斛初代培养中侧
芽的萌发为最好。
表 2　不同取材部位对环草石斛侧芽萌发的影响
Tab.2　Effect of different explants on germination
of side-buds of Dendrobium loddigesii
取材部位 外植体数
萌发
侧芽数
出芽率
/ %
茎尖 30 27 90
茎中上部(含第二个节) 40 26 65
茎正中部(含第四个节) 40 20 50
茎中下部 30 1 3.3
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　贵州师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　第22卷　
2.2　不同取材部位对环草石斛侧芽萌发的影响
见表 2。
由表 2可看出:取材的位置不同对环草石斛出
芽也有一定的影响 ,本实验研究了茎基部 、茎中部
及茎尖的出芽情况 ,从表 1中可看出 ,茎尖部位明
显要高于其它部位 ,茎中部次之 ,而茎基部几乎不
能萌发 。这表明细胞的分生能力越强它的分化能
力也越强 。
2.3　不同激素浓度对环草石斛增殖的影响
为了提高繁殖系数 ,需将侧芽长出的无菌苗转
入继代增殖培养基中 。与诱导培养基相比 ,继代培
养基中 6-BA/NAA比例较高(表 3)。将无菌苗接
种于继代增殖培养基中 , 10d左右芽体开始萌动;
20d左右 ,出现不定芽 ,形成丛生苗。由表 3可看
出 ,当 6-BA浓度为 3.0 ,且 6-BA/NAA比例为 30
时 ,比较有利于诱导形成丛生芽 ,并将繁殖系数提
高到 6.2。因此 ,选择 MS+NAA 0.1mg/L+6-BA
3.0mg/L培养基进行增殖 ,能在短期内为生产提供
大量试管苗。
表 3　不同激素浓度对环草石斛增殖的影响
Tab.3　Effect of plant hormone concentration
on propagation of Dendrobium loddigesii
植物激素/(mg/ L)
6-BA NAA 6-BA/NAA
外植
体数
不定
芽数
增值
倍数
1.0 0.4 2.5 50 192 3.84
1.0 0.3 3.3 50 225 1.57
2.0 0.3 6.7 50 204 1.05
3.0 0.1 30 50 310 6.20
表 4　不同激素浓度对环草石斛试管苗生根的影响
Tab.4　Effect of plant hormone concentration on root
induction of Dendrobium loddigesii
NAA
/(mg/ L)
试管
苗数
平均
生根数
根的平均
长度/ cm
生根率
/ %
0.1 98 1.4 1.25 38
0.3 101 2.3 1.85 62
0.5 100 2.5 2.14 57
0.7 108 3.8 4.60 85
2.4　不同激素浓度对环草石斛试管苗生根的影响
由于低浓度无机盐对根的生长有利 ,试验选用
1/2MS 培养基为基本培养基 ,将长至 0.2 ～ 0.5左
右的丛生芽分割并转入 1/2MS培养基中 ,并附加 4
种不同浓度NAA(表 4)。表 5结果表明 ,环草石斛
在4种培养基中培养 ,一周左右均开始长出白色的
根 ,但 3周后 ,根的长度和数量均出现较大差异 。
当NAA浓度为 0.7时 ,平均生根数和根的平均长
度均为最大 ,分别为3.8条和 4.60cm 。由表 4可看
出:选择 1/2MS+NAA 0.7mg/L 培养基进行壮苗生
根为最好 。
2.5　不同部位茎段外植体苗生长发育比较
见表 5。
表 5　不同部位茎段外植体苗生长发育比较
Tab.5　Comparison of different stem explants shoot about
growth and development of Dendrobium loddigesii
部位 分段后萌动时间/ d
潜伏芽数
/个
可分段
时间/ d
每季度平均
分株数/株
基部 第 15 3-5 第 60 24
中部 第 30 2-4 第 85 10
顶部 — — 第 50 4
　　植株主干生长到 4节以上 ,茎粗 3cm就可以分
段进行增殖;顶部的茎尖不分枝 ,继续生长 ,继代培
养中其基部可有分枝。由表 5可看出:外植体苗分
段增殖时基部茎段的增殖系数比上部茎段大 ,生长
速度快。继代增殖苗段比野生植株增殖快 。
2.6　试管苗的炼苗移栽
表 6　不同移栽基质对环草石斛试管苗成活的影响
Tab.6　Effect of different media on survival
rate of Dendrobium loddigesii
移栽基质 移栽试管苗数/株
成活试管
苗数/株
成活率
/ %
蛭石 30 6 20
泥土 30 0 0
杉木屑 30 28.5 95
蛭石∶泥土=1∶1 30 2 6.7
蛭石∶杉木屑=1∶1 30 15 50
蛭石∶杉木屑∶泥土=1∶1∶1 30 4 13.3
　　试管苗移栽初期 ,由于它是从无菌 、异氧 、温度
和光照恒定 、湿度饱和的环境向有菌 、自氧及不稳
定的环境过渡。因此 ,就必须有一个炼苗的过程 。
在 1/2MS+NAA 0.7mg/L 培养基上生长的无菌苗 ,
当其根长至 2 ～ 3cm 时 ,就可移入温室中先接受漫
射光炼苗 3 ～ 5d ,然后打开瓶盖炼苗 3 ～ 5d ,使根系
发达 、粗壮 ,以增强幼苗对环境的适应力。把上述
材料的培养基洗净 ,将再生植株移植于已灭菌的不
同基质中 。栽植时先在盆的底层填上一层直径约
为 1cm 的碳酸盐小石子 4cm ,再填入不同的基质
(厚度为 8cm),以利渗水透气 。栽植结束后 ,再在
上面铺盖 1cm 厚的苔藓 。小苗移栽后应浇透水 ,并
放在通风且阴湿的地方 ,一周内不应浇水以防太湿
而烂根。干燥季节可适当喷雾保持叶片和基质表
面湿润。以后随着植株的生长可逐渐加大淋水量
和光照强度并定期施肥 。表 6 显示了环草石斛试
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　第 4 期　　　　　　　卢文芸 ,张宇斌 , 唐金刚 ,等:环草石斛(D.loddigesii Rolfe.)快速繁殖研究　　　　　　　　　　
管苗在6种移栽基质中培养 1个月后的成活率(已
重复 3次的平均值)。结果表明碳酸盐小石子∶杉木
屑=1∶2 ,上面铺盖 1cm 厚的苔藓为最适移栽基质 ,
幼苗的成活率达 95%;碳酸盐小石子∶蛭石∶杉木屑
=1∶1∶1 ,上面铺盖 1cm厚苔藓的移栽基质次之 ,幼苗
的成活率达50%。
3　结论与讨论
3.1　结论
环草石斛对生态环境要求严格 ,自然繁殖困
难 ,成活率低且速度慢。因此 ,组织培养是扩大环
草石斛商业化生产的有效途径。本试验以环草石
斛茎段作为外植体进行组织培养 ,以 MS 培养基为
基本培养基 ,通过形成丛生芽的形式快速繁殖试管
苗 ,改变了过去通过原球茎诱导途径进行繁殖的方
式 ,简化了操作步骤 ,减少了变异。
自然条件下的环草石斛生长极其缓慢 ,且易受
季节限制 ,大多在春夏季节生长 ,在秋冬季节几乎
没有变化。用带侧芽的茎段作为外植体进行诱导
芽只需要 30d ,将所得的无菌苗接在增殖培养基
上 ,15d后芽的基部开始长出丛生芽。待丛生芽长
至0.5 ～ 1.0cm左右时将其切下转入另一种培养基
中(增殖或壮苗)。待试管苗长至 2 ～ 3cm左右时转
入生根培养基中 , 30d 后根的长度可达 2 ～ 4cm 以
上。这时需将试管苗移入温室中炼苗 10d 左右 。
之后 ,再将试管苗移栽到不同的基质上生长 30d 。
最后移栽到自然环境下 ,用遮阳网遮阴 ,移栽后浇
透水 ,并用 0.1%多菌灵喷洒植株 ,平均每周 2次 ,
以后逐渐延长时间喷洒。适时浇水 ,每月用1 000
倍的 MS 稀释喷施。只要认真施肥 ,适量遮阴 ,控
制过量雨水 ,选择好适宜石斛生长的温度和光照等
环境条件 ,进行科学的管理 ,便能获得稳产高产。
3.2　工厂化生产讨论
环草石斛从接种在生根培养基上到完成炼苗
一共需要 40d。假设一个组培工厂一年生产 50万
株组培苗 ,则需要 9个周期 ,每个周期生产 5.6万
株苗 。根据试验结果 ,环草石斛在从增殖 、生根到
移栽的整个过程中的成活率为 70%×85%×95%
=53.6%,繁殖系数为 6 ,则每个周期需要 2.05万
个丛生芽(1.75万个用于增殖并生根 ,另 0.3万个
用于下次增殖),一年共需要接种 74.41万个芽 。
按250 个工作日计算 , 每天需接种 0.30万个芽 。
每人每天可以接种 1 000个左右的芽 ,则需要接种
工人 3名 ,超净工作台3台 。按每一个培养瓶 7个
芽。每一个周期一共需要培养约 2 929瓶 ,一年一
共需要培养 26 357瓶左右 。若用培养架(长 120cm
×宽 45cm×高 40cm),每个架有 4层 ,每层放置 90
瓶 ,则培养室的面积需要 30m2 , 接种室的面积为
25m2 ,准备室的面积为 25m2 ,炼苗的面积为 150m2 。
这些条件对于一个商业化生产的工厂来上来说都
是可以满足的 。因此 ,我们认为以环草石斛的茎段
作为外植体 ,通过侧芽诱导形成丛生芽的形式 ,具
有操作简单 、繁殖系数高等特点 ,为进一步提供可
脱瓶移栽的种苗 ,实现工厂化快速繁殖提供条件;
为该植物商业化生产奠定了基础;同时还对贵州喀
斯特石山地区的生态重建 、环境改善 、经济发展以
及环草石斛这一濒危资源的保护都是有重要意义
的。
致谢:黔西南州林科所邓朝义 、卢永成 、邓忠治 、杨永生
等老师为本项研究鉴定和提供材料。
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