全 文 ：第 23卷 第 4期
2007年 4月
农 业 工 程 学 报
Transactions of the CSAE
Vol. 23　 No. 4
Apr.　 2007
灰树花液体发酵及多糖提取工艺的优化研究
汪维云 1 , 王继先 2
( 1.安徽农业大学生命科学学院 ,合肥 230036;　 2.安徽农业大学工学院 ,合肥 230036)
摘　要: 为了优化灰树花液体发酵及多糖提取工艺 ,根据试验数据建立了以菌丝生物量为响应值的响应面方程 ,优化发酵工艺为通气量
1. 4∶ 1(V /V )和 pH值 6. 0,应用径向基函数 ( RBF)神经网络的方法 ,对菌丝生物量进行了拟合 ;采用正交试验方法 ,研究了醇析浓度、浸提
次数、浸提温度等因子对多糖提取量的影响 ,结果表明:最佳提取工艺为料液比为 1∶ 20,浸提 3次 ,浸提温度为 60℃ ,醇析浓度为 85% ,并拟
合了多糖提取量响应面方程。
关键词: 灰树花 ; 发酵 ; 提取 ; 优化
中图分类号: TS201. 1　　　　文献标识码: B　　　　文章编号: 1002-6819( 2007) 4-0276-04
汪维云 ,王继先 .灰树花液体发酵及多糖提取工艺的优化研究 [ J].农业工程学报 , 2007, 23( 4): 276- 279.
Wang Weiyun, Wang Jixian. Tech nology op timizat ion for liquid fermentat ion and polys accharid ext raction of Gri f ola f rondosa [ J ] .
Trans actions of th e C SAE, 2007, 23( 4): 276- 279. ( in Chinese w ith Engli sh ab st ract )
收稿日期: 2005-03-29　修订日期: 2007-04-06
作者简介:汪维云 ( 1962- ) ,男 ,安徽无为人 ,博士 ,博士后 ,教授 ,主
要从事生物工程、生物制药与天然药物方面的研究。 合肥　安徽农
业大学生命科学学院 , 230036。 Email: w eiyunw@ 126. com
0　引　言
灰树花 (Gri f ola f rondosa)是一种食、药兼用的珍稀真菌 ,
其口味鲜美 ,营养丰富 ,含有众多活性物质。 灰树花多糖就是最
主要的一类活性成分 ,自 Oh no等 ( 1984)报道了灰树花多糖具有
抗肿瘤活性以来 [1] ,对灰树花多糖的化学结构和药理作用研究
已逐步展开 [2- 8]。 随着森林资源的减少 ,灰树花液体深层发酵就
成为生产灰树花多糖的一条重要途径。近年来 ,灰树花液体深层
发酵工艺和多糖提取等方面的研究异常活跃 ,在灰树花液体发
酵工艺方面进行了培养基组成和培养条件的试验研究 [9- 12] ;在
多糖提取方面有酸法、碱法、盐法 、热水法、酶法和微波辅助法等
提取方法的研究 [12- 17]。 由于发酵过程的非线性、时变性和不确
定性 ,近年来广泛用于各个科研领域的径向基函数神经网络
( Radial Basis Function Neural Netwo rk, RBFNN)具有良好的非
线性品质 ,能够有效地表示出输入与输出间的复杂关系 ,非常适
合用于生物相关过程的建模 [18, 19 ]。 本文在试验的基础上采用
RBF神经网络对影响发酵工艺的重要因子通气量和 p H值进行
优化 ,以期获得最佳的发酵工艺条件 ,提高发酵水平。 以正交试
验和响应面方程法进行灰树花多糖提取工艺的优化试验 ,从而
得到最佳的提取工艺。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
1. 1. 1　试验菌株
灰树花 50246菌株 (Grif ola f rondosa) , 由中国农业科学院
菌种保藏中心提供 ,菌种保存在马铃薯琼脂培养基 ( PDA)上 ,保
藏温度为 4℃。
1. 1. 2　发酵培养基
葡萄糖 20 g /L、豆粉 30 g /L、 KH2 PO4 1. 5 g /L和有机物
7 g /L。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　液体培养方法
试管菌种经过活化 ,接入 300 m L三角瓶 (培养基装量 100
m L)在来复式摇床中培养 ,转速为 180 r /min,培养温度为 25℃ ;
摇瓶培养48 h ,待形成菌丝球并均匀分散在培养液中时转入种子
罐 (装料量 50 L)中培养 ,培养温度 25℃ ,通气量 1. 4∶ 1( V /V ) ,培
养 36 h ,大量的菌丝球已形成 ,这时通过压力差把种子罐中的菌
液压入发酵罐 (装料量 500 L)中进行培养 ,培养 72 h,并对菌液在
最后一级的培养进行 pH值和通气量对菌丝生物量的影响进行
研究。
1. 2. 2　发酵液中的菌丝生物量测定
取 100 m L发酵液 , 3000 r /min离心 15 min,去除上清液 ,
55℃烘干 ,用分析天平称重 ( g ) ,得菌丝生物量 ( g /100 m L)。
1. 2. 3　多糖含量测定
采用硫酸— 苯酚法 [20]。
1. 2. 4　灰树花多糖提取工艺
液体深层培养灰树花 ,培养结束后收集菌丝体 ,菌丝体经过
滤清洗 ,再经 3000 r /min离心 15 min, 55℃烘干 ,经一系列的单元
操作过程 ,得灰树花多糖。 提取工艺如下:
注: 离心得到的沉淀物再经浸提→离心→上清液 ,并入上个
过程 ,进行同一操作。
1. 2. 5　提取工艺设计
根据查阅资料 ,借鉴他人的试验结果。 选择加 1 mo l /L
NaO H溶液的料液比、浸提次数 (每次浸提 2 h )、浸提温度和醇析
( 24 h )的乙醇的浓度 4项为考察因素 ,各取 3个水平 (见表 1) ,采
用 L9 ( 34 )正交试验 ,以粗多糖提取量为考察指标 ,筛选最佳提取
276
工艺条件 ,每次用 20 g干菌丝体。
表 1　灰树花多糖提取的试验因素水平
Table 1　 Facto rs and levels o f o r thogonal experiment
fo r ex t racting po ly sa ccharide of Gri f ola f rondosa
水平
试 验因 素
A
(料液比 )
B
(乙醇浓度 /% )
C
(浸提次数 )
D
(浸提温度 /℃ )
1 1∶ 15 75 1 25
2 1∶ 20 85 2 60
3 1∶ 25 95 3 80
2　结果与分析
2. 1　发酵工艺优化
2. 1. 1　响应面方程建立
响应面方程 ( Response Surface Methodolog y , RSM )是统计
设计试验技术的合成 ,采用合理的试验设计 ,能以最经济的方
式 ,用很少的试验数量和时间对试验进行全面研究 ,科学地提供
局部与整体的关系 ,从而取得明显的、有目的的结论 ,可用于确
定各因素及其交互作用在发酵过程中对非独立变量的影响 ,精
确地表述因素和响应值之间的关系。按 1. 2. 1的试验方法 ,在最
后一级培养中对 p H值和通气量对菌丝生物量的影响进行研究。
根据试验得到的数据 ,以菌丝生物量作为响应值 ,通气量和 pH
值为自变量 ,建立响应面方程:
y = - 1. 5211+ 0. 5968x 1+ 0. 6175x 2 - 0. 1278x 21 -
0. 0495x 22 ( 1)
式中 　 y—— 菌丝生物量 , g L- 1; x 1—— 通气量 ( V /V );
x 2—— p H值。
经显著性检验 ,最终方程的复相关系数: R = 0. 973,最终方
程的剩余标准差平方和: S = 0. 0165,最终方程的检验统计量:
F = 171. 126 > (F0. 01 = 7. 94)。
得到结论: 以菌丝生物量作为响应值 ( y ) ,通气量 ( x 1 )和 pH
值 ( x 2 )为自变量 ,建立响应面方程拟合较好。
为便于作图 ,特定义 y′= y /y max , y′—— 相对菌丝生物量 ;
ymax—— 最大菌丝生物量 , g L- 1。
按式 ( 1)方程用 M ATLAB语言进行绘图 ,可得到图 1。从图
中可以看出 ,沿 x 1轴 ,响应面逐渐增加 ;沿 x 2轴 ,响应面达到最
大后 ,开始有下降的趋势。根据显著性检验 , 拟合的响应面是可
靠的。从图中看出 ,通气量在 1. 0～ 1. 4: 1( V /V )和 pH值在 5. 5～
6. 0的范围为灰树花较适宜的培养条件。灰树花液体发酵工艺中
通气量对发酵水平影响很大。发酵工艺优化结果在曲面的最高
点 ,即通气量 1. 4∶ 1( V /V )和 p H 6. 0。
2. 1. 2　 RBF神经网络拟合
发酵是灰树花多糖生产过程中最常用、最重要的操作单元。
由于发酵过程本质是非线性的 ,且具有状态变量、时变等特性 ,
当工作点出现移动或出现大量扰动时 ,线性近似模型就不再满
足时变的情况 ,因而有很大的局限性 ;另一方面 ,非线性模型的
精确建模非常困难 ,需进行大量的试验 ,成本较高。 RBF神经网
络是一种性能良好的前向网络 ,它具有最佳逼近性能 ,在结构上
图 1　 p H值和通气量响应面
Fig . 1　 Response sur face of air-flow and pH value
具有输出一权值线性关系、训练方法快速易行、不存在局部最优
问题的特点。
本研究输入层采用 2节点 ( 2变量 )即 pH值和通气量 ,隐层
节点数 8,输出层节点数为 1,即网络计算的菌丝生物量。
经过网络训练 ,各参数确定如表 2。
表 2　 RBF训练参数
Table 2　 T rain par ameter s fo r radial ba sis function
迭代
次数
输入
节点数
隐层
节点数
输出
节点数
权重
系数
步长
因子
动态
因子
3000 2 8 1 0. 35 0. 0035 0. 00015
计算结果: 式 ( 1)的相对平均误差为 2. 706% ,说明方程拟合
得很好。 RBF的函数逼近效果与回归法相近 ,其相对平均误差是
2. 720% 。通过试验可知 ,菌丝生物量随着通气量的增加而增加 ;
而 pH值对其的影响作用要小于通气量。
2. 2　提取工艺优化
2. 2. 1　多糖提取工艺
对灰树花菌丝体进行多糖提取工艺的研究 ,结果如表 3所
示。
表 3　以多糖提取量为指标的正交试验分析
Table 3　 Analysis of o r tho gonal experiment
( po ly saccharide ex traction yield a s targ et)
试验号 A B C D 多糖提取量 /g
1 1 1 1 1 0. 795
2 1 2 2 2 1. 416
3 1 3 3 3 1. 839
4 2 1 2 3 1. 397
5 2 2 3 1 1. 796
6 2 3 1 2 0. 978
7 3 1 3 2 1. 684
8 3 2 1 3 1. 011
9 3 3 2 1 1. 473
K 1 4. 050 3. 876 2. 784 4. 064
K 2 4. 171 4. 223 4. 286 4. 078
K 3 4. 168 4. 290 5. 319 4. 247
R 0. 121 0. 414 2. 535 0. 183
277　第 4期 汪维云等 :灰树花液体发酵及多糖提取工艺的优化研究
从表 3中可以看出 , RC > RB > RD > RA ,各因素对多糖提
取量的影响顺序应为: C> B> D> A ,最佳组合为: A2B3C3D3 ,料
液比和浸提温度对多糖提取量影响不大 ,乙醇浓度 85%和 95%
的差异较小 ,考虑成本选用乙醇浓度 85% ,即 C2。 D为提取温度 ,
D2、 D3差异不大 ,考虑能量消耗 ,采用 D2 ,综合各方面因素考虑 ,
故选用 A2B2C3 D2 ,即加入 1 mo l / L NaOH溶液提取的料液比为
1∶ 20,每次浸提 2 h,共浸提 3次 ,浸提的温度为 60℃ ,醇析用乙
醇浓度为 85% ,醇析时间为 24 h。
为了综合考虑各因素对多糖提取量的影响情况 ,用 TSP软
件拟合了回归曲线 ,
Y = - 0. 1980+ 0. 0033x A + 0. 6900xB + 0. 4255x C +
0. 0011xD ( 2)
式中　 Y—— 多糖提取量 , g; xi—— 各试验因素 , i为 A、 B、C、
D。
经显著性检验 ,方程的复相关系数 R = 0. 9827,最终方程的
剩余标准差 S = 0. 0194。最终方程的检验统计量 F = 56. 9284>
(F0. 01 = 5. 42) ,说明方程拟合较好。
从上面拟合的方程来看 , A和 D因素的系数与 B和 C因素的
相比很小 ,说明沿其轴方向移动的响应值变化很小。将 A和 D因
素忽略 ,将其拟合成以下方程:
Y = - 3. 6561+ 8. 6233x B + 0. 7352xC - 4. 6667x 2B -
0. 07825x 2C ( 3)
式中　Y—— 多糖提取量 , g; xB—— 乙醇浓度 ,% ; xC—— 提取
次数。
经显著性检验 ,方程的复相关系数 R = 0. 9910,最终方程的
剩余标准差 S = 0. 0101。最终方程的检验统计量 F = 110. 6102
> (F0. 01 = 8. 41) ,说明方程拟合较好。
按方程 ( 3)进行绘图得图 2,由图 2知 ,多糖提取量在醇析用
乙醇浓度为 85% ,提取次数为 3次时最优。就影响多糖提取量的
两个因素乙醇浓度与提取次数的结果与正交试验结果相同。
图 2　多糖提取量响应面
Fig. 2　 Response surface of po ly saccharide ex t raction yeild
2. 2. 2　重复性验证试验
根据以上试验结果 ,选用加入 1 mo l / L NaOH溶液提取的料
液比为 1∶ 20,每次浸提 2 h,共浸提 3次 ,浸提的温度为 60℃ ,醇
析用乙醇浓度为 85% ,醇析时间为 24 h。 进行验证性试验。 3组
平行验证试验结果相近 (分别为: 1. 742、 1. 791、 1. 770 g ) ,差异性
较小 ,说明重复性强 ,提取工艺稳定较好。
3　结　论
1)响应面方程作图知 ,随着通气量的增加 ,菌丝生物量逐渐
增加 ;而随着 p H值的增加 ,菌丝生物量达到最大后 ,开始有下降
的趋势。 优化的发酵工艺是通气量 1. 4∶ 1( V /V )和 pH 6. 0。
2) 通过径向基函数神经网络 ( RBF神经网络 )的研究 ,对发
酵工艺进行优化 ,得到了较好的效果。人工神经网络的发展和应
用于发酵过程的优化 ,为发酵过程状态估计技术提供了一种新
途径。
3) 通过对影响多糖提取的诸因子进行的正交试验 ,结果表
明: 醇析浓度和提取次数对多糖提取量影响较大 ,确定了多糖提
取的工艺参数: 加入 20倍菌丝体体积的 1 mo l / L NaOH,每次提
取 2 h,共 3次 ,浸提温度 60℃ , 85%的乙醇醇析 24 h。
[参　考　文　献 ]
[1 ]　 Ohno N, Suzuk e I, Oikaw a S, et al. Anti tumor activi ty and
s tructural characterization of Glucans ext racted f rom cultured f rui t
bodies of Gri f ola f rondosa [ J ] . Ch em Pharm Bul, 1984, 32 ( 3) :
1142- 1151.
[2 ]　 Su zuki T, Ohno N, Saito K, et al. Activation of th e complemen t
sys tem by ( 1, 3 )-beta-D-Glucans having di fferen t deg rees of
branching and di fferen t ul t ra st ructures [ J ] . J Pharmacobiodyn,
1992, 15: 277- 282.
[3 ]　 Nanba H. An titumo r activity of oral administered “ D-Fraction”
f rom mai take mush room (Gr i f ola f rondosa ) [ J ]. J Nat Med,
1993, 1( 4): 10- 15.
[4 ]　 Adachi Y, Okazaki M , Ohno N, et al. Enh ancemen t of cytokine
production by macrophages s timulated w i th ( 1, 3 ) -β-D-Glucan,
Gri folan ( GRN) , is olated f rom Gri fola f rondosa [ J ] . Biol Pharm
Bull , 1994, 17( 12): 1554- 1560.
[5 ]　 Okazaki M , Ad achi Y, Ohno N, et al. St ructure-activi ty
relationship of ( 1, 3 )-β-D-Glucans in the ind uction of cytokine
production form macrophages in vi tro [ J ]. Biol Ph arm Bul l, 1995,
18( 10): 1320- 1327.
[6 ]　 Kubo K, Nanba H. Anti-hyperliposis ef fect of Mai take f rui t
body ( Gri f ola f rondosa ) [ J] . Biol Ph arm Bull , 1997, 20( 7): 781-
785.
[7 ]　劳华均 ,闵三弟 ,藏珍娣 ,等 . 灰树花多糖的抗肿瘤作用及对巨噬细
胞、自然杀伤细胞的影响 [ J ]. 上海农业学报 , 1997, 13( 1): 25- 30.
[8 ]　孙　震 ,陈石良 ,谷文英 ,等 . 灰树花多糖体内抗肿瘤作用的实验研
究 [ J] . 药物生物技术 , 2001, 8( 5): 279- 283.
[ 9]　汪维云 ,吴守一 ,朱金华 . 灰树花液体深层培养工艺研究 [ J ]. 生物
工程学报 , 1999, 15( 3): 378- 382.
[10 ] 裘娟萍 ,孙培龙 ,朱家荣 ,等 . 灰树花深层发酵培养基的研究 [ J] . 微
生物学通报 , 2000, 27( 4): 275- 278.
[11 ] 李滢冰 ,冯梦醒 ,徐继祖 . 海藻糖在灰树花深层发酵中的积累及多
糖的提取 [ J] . 食品与发酵工业 , 2000, 26( 2): 11- 15.
[12 ] 杜　巍 ,华泽钊 . 灰树花的深层培养工艺及其影响因素的研究 [ J] .
农业工程学报 , 2004, 20( 2): 231- 234.
[13 ] 唐小俊 ,张名位 ,池建伟 ,等 . 灰树花多糖提取工艺优化及多糖冲剂
的研制 [ J] . 食用菌 , 2006, ( 6) : 58- 60.
[14 ] 崔凤杰 ,许泓瑜 ,舒　畅 ,等 . 响应曲面法优化灰树花水溶性多糖提
取工艺的研究 [ J]. 食品科学 , 2006, 27( 4): 142- 147.
278 农业工程学报 2007年　
[15 ] 史美丽 ,宋爱荣 ,吕海涛 ,等 . 灰树花发酵液提取多糖的比较研究
[ J] . 中国食用菌 , 2003, 22( 3): 45- 46.
[16 ] 王卫国 ,赵永亮 ,包东武 . 灰树花多糖的提取及纯化技术初探 [ J] .
郑州工程学院学报 , 2002, 23( 4): 60- 63.
[17 ] 陈石良 ,孙　震 ,谷文英 ,等 . 灰树花深层发酵菌丝体多糖的酶法提
取及其抗肿瘤作用 [ J ]. 无锡轻工大学学报 , 2000, 19 ( 4): 336-
340.
[18 ] 蔡宇杰 ,诸葛斌 ,张锡红 ,等 . 遗传算法与神经网络耦联法优化生淀
粉酶发酵培养基 [ J]. 无锡轻工大学学报 , 2001, 20( 4): 421- 423.
[ 19 ] 李　冰 ,郭祀远 ,李　琳 ,等 . 人工神经网络在食品工业中的应用
[ J] . 食品科学 , 2003, 24( 6): 161- 164.
[20 ] 张惟杰 . 糖复合物生化研究技术 [M ] . 杭州: 浙江大学出版社 ,
1994: 8- 104.
Technology optimization for l iquid fermentation and polysaccharid
extraction of Grifola frondosa
Wang Weiyun
1
, Wang Jixian
2
( 1. School of L ife Science , Anhui A gricultural University , Hefei 230036, China;
2. School of Technology , Anhui A gricultural University , Hefei 230036, China)
Abstract: In o rder to optimize technolog y fo r liquid fermenta tion and polysaccha ride ex trac tion of Gri f ola f rondosa , according to
expe rimental data the response surface model using biomass of mycelia a s r esponse value was established and th e fermentation
technolog y was optimized as follow s: air-flow 1. 4∶ 1( V /V ) , p H 6. 0. The biomass of mycelia w as fitted by Radial Ba sis Function
( RBF) . The factor s affecting polysaccha rid ex traction such as concentra tion o f alcoho l for depo sitio n, ex t ration times, tempe ratur e
w ere investiga ted by using o rthogonal expe riment. The r esults indicated that the optimized tech no lo gy w as that the r atio of ma terial
to wa ter 1∶ 20, ex tra ction times three, ex traction tempera ture 60℃ , concentration o f a lcoho l for depositio n 85% , and the response
surface model wa s made out.
Key words: Gri f ola f rondosa; fe rmentation; ex tr action; optimiza tion
279　第 4期 汪维云等 :灰树花液体发酵及多糖提取工艺的优化研究