全 文 ：西北林学院学报 2008 , 23(3):168～ 172
Journa l of No rthwe st Fore st ry Univ ersity
大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮的研究
＊郭　琪 , 　翟梅枝＊ , 　贾彩霞 , 　张新华
(西北农林科技大学林学院 ,陕西 杨陵 712100)
摘　要:以总黄酮回收率为指标 ,研究了大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮的工艺 。结果表明:
LS303型树脂对核桃叶总黄酮有较好的吸附分离性能 ,是分离纯化核桃叶总黄酮的适宜大孔树脂;
分离纯化核桃叶总黄酮的最佳工艺条件为:黄酮量与干树脂量比为 1∶8 ,浓度为 4.67 mg ·mL-1 ,
pH6 , 4BV 的水洗后用 4BV的 70%乙醇洗脱。经 LS303处理后的核桃叶总黄酮回收率在 80%以
上 ,纯度 70%以上 。该工艺简便 ,能有效分离纯化核桃叶黄酮化合物。
关键词:核桃叶;黄酮化合物;大孔吸附树脂;分离
中图分类号:S789.4　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001-7461(2008)03-0168-05
Separation and Purification of F lavonoids f rom Walnut Leaves
with Macroporous Resin
GUO Qi , ZHAI Mei-zhi , JIA Cai-xia , ZHANG Xin-hua
(Col lege o f Forestr y , Northwest A&F Univer sity , Yang ling , Shaanxi 712100 , China)
Abstract:A method for separation and purif ication of f lavonoids f rom w alnut leaves w ith macropo rous resin
w as studied , w ith the recovery rate of f lavonoids as index.The resul ts w ere as flo llow s:among six types
of macroporous resin choosed , resin LS303 was the best one.The optimum process conditions w ere the
loaded amount of f lav onoids vs dry resin:1∶8 , the ex tract solution at a concentrat ion about 4.67 mg ·
mL -1 , pH 6.After eluted w ith 4BV of dist illed w ate r and 4BV of 70% ethanol , the yield of f lavonoids
w as above 80% and product purity w as above 70%.The process is simple , the f lavonoids of w alnut leaves
can be sepa rated and purified effectively .
Key words:walnut leaves;f lavonoids;macropo rous re sin;separation
　　黄酮类化合物是一类具有广泛生物活性的物
质 ,具有抗氧化 、抗肿瘤 、抗病毒 、防治心血管疾病及
增强人体免疫力等多种生物活性[ 1-2] 。核桃(J ug-
lans regia )是核桃属植物中经济价值最高的一种 ,
在我国栽培历史悠久 ,种质资源丰富。核桃叶中含
有酚类 、鞣质类 、黄酮类 、核桃叶醌 、萜类等多种生物
活性成分[ 3] 。核桃叶总黄酮主要含有槲皮素 、山奈
酚 、金丝桃苷等 ,具有抗菌 、杀虫 、抗肿瘤 、清除氧自
由基等生物活性 ,总黄酮含量在 9月份达 10.24%,
是银杏叶总黄酮的近 3 倍[ 4] 。近年的研究表明 ,核
桃叶黄酮在抗氧化 、清除自由基 、抗菌 、杀虫 、除草 、
抗病毒等方面有较高的开发价值[ 5-11] 。对核桃叶总
黄酮的提取工艺已有研究[ 12] ,但利用大孔树脂分离
纯化核桃叶总黄酮的研究未见报道。通过对不同型
号大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮的工艺进行研
究 ,旨在探讨核桃叶黄酮的适宜制备方法 ,为核桃叶
黄酮的规模化生产及核桃叶资源的综合利用提供理
论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
核桃叶采自西北农林科技大学苗圃 ,自然阴干 、
粉碎 , 备用 。D101 、LSA-21 、LSA-40 、XDA-1 型树
脂购于西安蓝晓树脂公司;LS300 、LS303 型树脂购
＊　收稿日期:2007-10-23　修回日期:2007-11-13
　基金项目:国家自然科学基金(30571494);中国博士后基金(2004035689);西北农林科技大学优秀人才专项基金(04ZR005)
　作者简介:郭琪(1982-), 女 , 甘肃天水人 , 硕士研究生 ,主要从事林产资源综合利用研究。＊通讯作者:翟梅枝 , 副教授 , 博士 , 主要从事植物资源利用和植物病害防治研究。 E-mail:plum-zhai@163.com。
于西安蓝深树脂公司;芦丁对照品为中国药品生物
制品检定所生产;所有试剂均为西安化学试剂厂分
析纯;层析玻璃柱( 15×H400 mm)。
仪器包括 UV1810 型紫外 -可见分光光度计
(北京普析通用仪器有限责任公司)、RE-52 型旋转
蒸发仪(上海申生科技有限公司)、SHB-Ⅲ循环水真
空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
1.2　方法
1.2.1　总黄酮含量测定　采用 NaNO 2-A l(NO 3)3
比色法[ 13] 进行测定 , 回归方程:Y =0.133 5 +
0.000 1X , r=0.999 6。
1.2.2　样液制备　取核桃叶粉 1.0 kg ,用 70%乙
醇回流提取 4次 ,趁热抽滤 ,合并滤液 ,回收乙醇至
无醇味 ,并用蒸馏水定容至 5 000 mL。取少量按照
“1.2.1”的方法测定总黄酮浓度。
1.2.3　大孔树脂的预处理　以 95%乙醇浸泡 24 h
后 , 4 倍体积 95%乙醇洗脱 , 控制流速 1 mL ·
min-1 ,再以大量蒸馏水洗至中性 ,备用。
1.2.4　不同型号树脂筛选的研究　(1)静态吸附解
吸实验。称取一定量处理好的各种树脂 ,置于 100
mL 锥形瓶中 ,分别加入总黄酮(4.669 mg ·mL-1)
的上样液 50 mL ,每隔 10 min 振摇 20 s ,持续 2 h ,
静置 24 h后 ,过滤 ,得液体样品 ,按“ 1.2.1”方法测
定吸附后滤液浓度。将滤出的树脂用蒸馏水洗去树
脂表面的上柱液 ,另置 100 mL 锥形瓶中 ,加入 70%
乙醇 20 mL ,每隔 10 min振摇 20 s ,24 h后过滤 ,得
液体样品 ,按照“1.2.1”的方法测定解吸后滤液浓
度。计算各树脂对核桃叶总黄酮的静态饱和吸附
量 、解吸率 。
饱和吸附量(mg · g -1)=(样液浓度-吸附后
滤液浓度)×上样液体积/干树脂量
解吸量(mg · g-1)=解吸后滤液浓度×解吸液
体积/干树脂量
解吸率(%)=解吸量/饱和吸附量×100
(2)动态吸附解吸实验 。称取一定量处理好的
各种树脂 ,湿法装柱 ,吸取已知总黄酮浓度(4.669
mg ·mL-1)的上样液 100 mL ,上样吸附 ,过柱液重
吸附 1次 ,静置 12 h ,蒸馏水洗脱至无色后 ,用 70%
乙醇洗脱 ,将各吸附后残液 、水洗液 、醇洗脱液浓缩
至一定体积 ,按照“1.2.1”的方法测定各部分的总黄
酮含量。计算比吸附量 、比洗脱量 、总黄酮回收率 。
比吸附量(mg · g -1)=(上柱黄酮量-残液中
黄酮量-水洗液中黄酮量)/干树脂量
比洗脱量(mg · g-1)=醇洗脱液中黄酮量/干
树脂量
总黄酮回收率(%)=醇洗脱液中黄酮量/上柱
黄酮量×100
1.2.5　LS303树脂分离纯化核桃叶总黄酮的工艺
优化　(1)上样量的确定。取处理好的树脂 6份(每
份相当于干树脂 3 g),湿法装柱 。分别吸取已知总
黄酮浓度(4.669 mg ·mL-1)的上样液 160 、110 、
80 、65 、50 、40 mL ,上柱吸附完全后 ,用 4 BV(BV
表示柱床体积 , 下同)的蒸馏水洗柱 ,再用 4 BV
70%的乙醇洗脱 ,将醇洗脱液浓缩至一定体积 ,测定
黄酮含量和回收率 。
(2)上样液浓度的确定。取处理好的树脂 5份
(每份相当于干树脂 3 g),湿法装柱;再取上样液 80
mL 5份 , 1 份浓缩至 40 mL , 3 份分别加水稀释 1
倍 、2倍 、3 倍 , 1份不处理 。上柱吸附完全后 ,用 4
BV的蒸馏水洗柱 ,再用4BV 70%的乙醇洗脱 ,将醇
洗脱液浓缩至一定体积 ,测定黄酮含量和回收率 。
(3)上柱液 pH 的确定。取处理好的树脂 7份
(每份相当于干树脂 3 g),湿法装柱 。取上柱液 80
mL , 用 1 mo l · L-1 的 HCl 或 1 mo l · L-1 的
NaOH ,分别调 pH 值为 2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 ,上柱吸附
完全后 ,用 4BV的蒸馏水洗柱 ,再用 4BV 70%的乙
醇洗脱 ,将醇洗脱液浓缩至一定体积 ,测定黄酮含量
和回收率。
(4)乙醇浓度对总黄酮回收率及纯度的影响。
取处理好的树脂 5份(每份相当于干树脂3 g),湿法
装柱。取 80 mL 上样液 ,上柱吸附完全 ,用 4 BV蒸
馏水洗柱后 ,再分别用 10%、30%、50%、70%、90%
乙醇洗脱 ,每种醇洗脱液收集 4BV ,浓缩后 ,测定黄
酮含量和回收率。
(5)水洗体积对总黄酮收率及纯度的影响。取
处理好的树脂4份(每份相当于干树脂 3 g),湿法装
柱 。取 80 mL 上样液吸附完全后 ,分别用 2 、4 、6 、8
BV的蒸馏水洗脱 ,再用4BV 70%的乙醇洗脱 ,将水
洗液 、醇洗液浓缩到一定体积 ,测定各部分的黄酮含
量 。将各醇洗脱液减压蒸发 ,浓缩干燥得固体样品 ,
称重 ,计算总黄酮纯度 。纯度(%)=醇洗脱液中总
黄酮含量/干物质重×100
(6)洗脱终点的确定。取处理好的树脂适量(每
份相当于干树脂 3 g),湿法装柱 ,80 mL 上样液吸附
完全后 ,用 4 BV 蒸馏水洗柱 ,再用 70%的乙醇洗
脱 ,按柱床体积收集 ,共收集 8 个体积 ,测定每个收
集体积的黄酮含量和回收率 。
2　结果与分析
2.1　6种树脂的静态-动态吸附解吸结果
大孔树脂对有效成分的吸附具有可逆性。在静
态和动态吸附解吸实验中 ,由于树脂的极性 、孔径 、
169第 3 期 郭　琪等　大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮的研究
比表面积不同 ,对黄酮吸附强弱不同 ,解吸难易也不
同。由表 1 、表 2可知 , L303型树脂在静态吸附量 、
解吸率 、动态比吸附量 、比洗脱量 、总黄酮回收率均
优于其他类型的树脂 。静态饱和吸附量仅次于
LSA21 型 , 但其解吸率较 LSA21 型树脂高 10.
88%。L303型树脂动态解吸时 ,70%乙醇洗脱的总
黄酮量最高 ,为 399.16 mg ,比 XDA-1 型树脂的洗
脱量(248.26 mg)高 150.90 mg ,故选用 L303型树
脂作为分离纯化核桃叶总黄酮的适宜树脂。
表 1　6种树脂静态吸附解吸测定结果(n=3)
T able 1　Th e static adsorpt ion and desorption capacity wi th
six types of m acroret icular resins(n=3)
树脂型号 饱和吸附量/(mg· g -1)
解吸量
/(m g· g-1)
解吸率
/%
黄酮回收率
/ %
LS300 201.19 112.37 55.85 14.44
D101 211.47 112.96 53.42 14.52
LS303 232.76 134.36 57.73 17.27
LSA40 216.60 99.01 45.71 12.72
LSA21 241.54 113.17 46.85 14.54
XDA-1 152.80 65.48 42.85 8.41
表 2　6种树脂动态吸附解吸测定结果(n=3)
Tab le 2　T he dynamic ad sorption and deso rp tion capacity w ith
six types of m acroret icular resins(n=3)
树脂型号 比吸附量/(mg· g -1)
70%乙醇洗脱
黄酮量/mg
比洗脱量
/(mg· g -1)
黄酮回收率
/ %
LS300 87.02 314.92 81.91 67.45
D101 95.10 349.63 91.93 74.88
LS303 107.10 399.16 103.85 85.49
LSA40 92.50 326.74 85.18 69.98
LSA21 98.48 366.79 95.47 78.56
XDA-1 69.90 248.26 64.07 53.17
2.2　LS303型树脂吸附分离核桃叶总酮的工艺优化
2.2.1　上样量对总黄酮收率的影响　表 3表明 ,当
树脂量一定时 ,增加上柱量 ,由于吸附不完全 ,过柱
液和水洗液造成黄酮流失 ,总黄酮回收率明显降低 ,
同时还会导致吸附选择性变差;若上柱量过少 ,即吸
附剂用量过多 ,虽总黄酮回收率较高 ,但成本增高 ,
且一次处理的黄酮量大大降低 ,造成浪费。所以 ,吸
附剂用量与树脂量要有合理的比例关系 。当上柱量
与干树脂之比为 1∶8 时 ,总黄酮回收率可达 80%
以上 ,综合以上因素 ,选用上柱量与干树脂之比 1∶
8为宜。
2.2.2　上样液浓度对黄酮收率的影响　图 1表明 ,
在上样液总黄酮固定的情况下 ,当上样液的浓度增
大时 ,黄酮回收率不断增大 ,但当相同体积的上样液
浓缩至一半体积上样时 ,因浓度过大 ,发生絮凝和沉
淀 ,回收率下降;而上样液浓度偏低时 ,耗时增加 ,工
效降低;所以 ,本研究不考察其他因素 ,选择制备好
的上样液(浓度 4.669 mg ·mL-1)直接上样 ,不必
稀释。
表 3　上样量对 LS303 大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮的影响
Table 3　Ef fect of loaded am ount on the pu rif icat ion of
walnu t leaf flavonoids by using LS303 resin
上柱黄酮量
/mg
上柱量与干
树脂之比
70%乙醇洗脱
黄酮量/mg
总黄酮收率
/ %
747.04 1∶4 545.85 73.07
513.59 1∶6 386.32 75.22
373.52 1∶8 300.21 80.37
303.49 1∶10 250.81 82.64
233.45 1∶12 200.75 85.99
186.76 1∶16 161.37 86.40
图 1　上柱液浓度对核桃叶总黄酮回收率的影响
Fig.1　Ef fect of sample con cen t rat ion on the recovery rate of
f lavonoids of w alnut leaf
2.2.3　上柱液 pH 对黄酮收率的影响　上样液酸
碱度对树脂吸附有一定影响 ,故将上样液 pH 调成
7种不同的溶液。实验中发现 ,不同 pH 的上样液
其澄清度差异较大 。当上样液 pH 小于 5 时 ,上样
液有不同程度的沉淀 ,不利吸附;当 pH =2时 ,产生
大量沉淀 ,堵塞树脂柱 , 使得黄酮的回收率大大降
低;当 pH≥6时 ,溶液澄清透明 ,上柱效果较好 。
由图 2知 ,随着 pH 值的升高 ,总黄酮回收率增
大 ,在 pH =6时 ,回收率达到最大 ,为 83.77%,之
后随着 pH 的升高 ,总黄酮回收率下降。这是因为
在弱酸条件下 ,黄酮类化合物以游离的分子形式存
在 ,故易于被吸附;但酸性较强时 ,黄酮分子易形成
“佯盐” ;偏碱时 ,黄酮分子上酚羟基的氢解离形成酸
根离子 ,黄酮类化合物形成离子结构 ,被树脂吸附的
能力减弱[ 14] 。故确定上样液适宜 pH 为 6 。
170 西北林学院学报 23 卷　
图 2　上柱液 pH 对叶总黄酮回收率的影响
Fig.2　Ef fect of sample pH value on th e recovery rate of f lavonoids
2.2.4　乙醇浓度对总黄酮收率的影响　从图 3 可
看出 ,随着乙醇体积分数的增加 ,核桃叶黄酮的回收
率增加 ,当乙醇浓度为 70%时 ,核桃叶黄酮回收率
的变化趋于平缓 ,说明核桃叶黄酮已经基本上被解
吸下来 ,为节约成本 ,减少醇挥发带来的损失 ,宜选
择浓度为 70%的乙醇对树脂进行洗脱 。
图 3　乙醇浓度对黄酮回收率的影响
Fig.3　Effect of ethanol concent ration on th e recovery rate
of f lavon oid s
2.2.5　水洗体积对总黄酮收率和纯度的影响　从
表 4可以看出 ,随着用水量的增加 ,水洗脱黄酮量增
大 ,总黄酮回收率下降 ,但纯度提高 ,为了减少洗脱
用水 ,缩短洗脱时间 ,结合总黄酮收率和纯度 ,确定
以 4倍柱体积的水洗脱较好 。
表 4　不同水洗体积对总黄酮收率和纯度的影响
T able 4　Effect of volume of w ater on the pu ri ficat ion of w alnut leaves f lavonoids by usin g LS303 resion
水洗脱体/ BV 水洗黄酮量/mg 洗脱液中总黄酮/m g 总黄酮收率/ % 干物质/mg 总黄酮纯度/ %
2 21.03 306.55 82.07 483.00 63.47
4 30.51 302.21 80.91 457.40 66.08
6 33.98 300.54 80.46 449.40 66.88
8 37.58 295.54 79.12 438.10 67.46
2.2.6　洗脱终点的确定　从图 4可以看出 ,当洗脱
液用量为 4 BV 时 ,总黄酮回收率达到 84.37%,基
本上将总黄酮大部分洗净 。若增加洗脱剂用量 ,不
仅增加生产成本 , 同时脂溶性杂质增多 ,故洗脱 4
BV 确定为洗脱终点。
图 4　各洗脱体积黄酮回收率
Fig.4　Recovery of each elut ion volume
2.3　LS303型大孔树脂重复使用次数的确定
按照以上条件筛选所得结果 ,重复使用树脂 10
次 ,测定每次使用的总黄酮收率和纯度 。由表 5可
看出 ,大孔树脂连续使用 6次时 ,总黄酮的回收率和
纯度分别为 84.75%和 71.17%,使用第 7次时 ,总
黄酮的回收率仍在 80%以上 ,但纯度为 68.75%,低
于 70%。使用 10次时 ,总黄酮的回收率在 80%左
右 ,纯度在 68%以上。由此可见 ,在筛选所得条件
下 ,LS303型大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮具有
较好的重复使用性能。但使用 6 次后 ,由于分离过
程中 ,残留在树脂上的杂质逐渐增多 ,使其吸附能力
减弱 ,核桃叶总黄酮的回收率和纯度均有所下降 ,从
总黄酮的回收率(>80%)和纯度(>70%)两方面考
虑 ,LS303型大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮时以
重复使用 6次为宜 ,此后树脂需要进行再生处理后
使用。
171第 3 期 郭　琪等　大孔树脂分离纯化核桃叶总黄酮的研究
表 5　LS303 大孔树脂重复使用时的黄酮回收率和纯度
T able 5　Tim es of recycling u se of LS303 resin
使用次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
黄酮回收率/% 84.37 86.62 84.66 87.34 86.09 84.75 82.69 79.57 80.28 79.12
纯度/ % 70.98 70.10 70.59 71.77 70.19 71.17 68.75 68.52 68.29 68.47
3　结论与讨论
大孔吸附树脂类型多样 ,不同类型的树脂含水
量差异较大 ,在进行吸附解吸实验时 ,以树脂干重计
客观的反映了树脂吸附能力的强弱 。
LS303型大孔树脂对核桃叶总黄酮具有良好的
吸附和解吸性能 ,用其纯化核桃叶黄酮是可行的。
在静态吸附解吸实验中 , 6种树脂解吸后所得
解吸液的黄酮回收率均远小于动态吸附解吸中的黄
酮回收率 ,这是因为动态解吸是个流动的过程 ,不断
有新的洗脱剂加入 ,不断有黄酮类洗脱下来 ,动态吸
附解吸更接近于生产实践 ,加之静态吸附解吸作为
筛选树脂的一个指标 ,只考察了一定量解吸液解吸
的结果。
LS303型大孔树脂分离核桃叶黄酮的最佳条件
是:上样液总黄酮含量与干树脂之比 1∶8 ,上样液
浓度为 4.67 mg ·mL-1左右 , pH 为 6 ,依次用 4 倍
体积蒸馏水 、4倍体积 70%乙醇洗脱 ,总黄酮收率为
84%以上 ,纯度 70%以上 。该工艺具有收率高 、成
本低 、操作简便 、溶剂安全 、树脂可多次重复使用等
优点 ,适宜在大规模生产中选用。
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172 西北林学院学报 23 卷