全 文 ：·论　著·
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (编号 20432030 , 20872006)
作者简介:刘毅 , 助理研究员;从事药物质量标准研究;E-mail:liu yi@nicpbp.org.cn
通讯作者:张庆英 , 博士 , 副教授 , 硕士导师;Tel:(010) 82801725;E-m ail:qyzhang@h sc.pku.edu.cn
红芪化学成分及其抗氧化活性研究
刘　毅1 , 2 , 张　征1 , 张庆英1 , 蒲小平1 , 赵玉英1 (1 北京大学药学院 , 北京 　100191;
　2 中国药品生物制品检定所)
摘要:　目的 对红芪化学成分及其抗氧化活性进行研究。方法 采用色谱技术对红芪化学成分进行分离 ,
利用理化性质和现代波谱技术确定化合物的结构 , 并应用过氧化氢损伤的 SH-SY5Y细胞与野生型 DJ-1
基因转染的 SH-SY5Y细胞模型对得到的代表性化合物进行抗氧化应激活性研究 。结果 从红芪中分离鉴
定了 6个化合物 , 其结构分别为大豆皂苷 II甲酯 (1), 大豆皂苷 I (2), 芒柄花苷 (3), 柚皮苷 (4), 下
箴桐碱 (5)和色氨酸 (6)。抗氧化活性实验结果表明化合物 3具有较好的抗氧化作用 。结论 化合物 4和
6为首次从该属植物中分离得到 , 化合物 3具有抗氧化应激作用。
关键词:　红芪;化学成分;抗氧化;芒柄花苷;柚皮苷
中图分类号:R284;R285.5　　文献标识码:A 　　文章编号:1002-7777 (2010)06-0543-04
Study on Chemical Constituents and Antioxidative Activity of Radix Hedysari
Liu Yi
1 , 2 , Zhang Zheng1 , Zhang Qingying1 , Pu Xiaoping1 and Zhao Yuying1(1School of Pharmaceutical Sciences ,
Peking University , Beijing 100191;　2National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products)
ABSTRACT:　 Objective To investigate the chemical constituents of Radix Hedy sari and antio xidative
ef fects of the iso lated compounds.MethodsVarious chromatog raphic techniques w ere used fo r the iso lation
and purif icat ion , and spect ral and chemical methods w ere used fo r structural elucidation.The antio xidative
ef fects of the isolated compounds we re valuated by investig ating the ef fects on the oxidative damage in SH-
SY5Y cells and wide-type DJ-1 gene transfected SH-SY5Y cells induced by hydrogen peroxide (H2O2).
Results Six compounds w ere obtained from Radix Hedy sa ri and thei r st ructures w ere identif ied as
soyasaponin II me thyl ester (1), soyasaponin I (2), ononin (3), naringin (4), hypaphorine (5)and
tryptophane (6), respectively.Compound 3 show ed good ef fect on the oxidative damage induced by
hydro gen pero xide (H 2O2).Conclusion Compound 4 and 6 w ere obtained from genus Hedysarum fo r the
first t ime , and compound 3 showed good antio xidative act ivity .
KEYWORDS:　Radix Hedy sari;chemical const ituents;antio xidative activity;ononin;naringin
　　红芪 (Radix Hedysari)为豆科 (Leguminosae)
岩黄芪属 (Hed ysarum Linn.)植物多序岩黄芪
(Hedysarum polybotry s Hand.-Mazz.)的干燥
根 , 为我国收载的著名根类中药材 。在我国西北地
区尤其是甘肃省南部有着悠久的药用栽培历史[ 1-2] ,
但目前有关红芪化学成分和生物活性的研究还不够
深入 , 因此我们对其化学成分及生物活性进行了较
系统研究。本文报道红芪中 6个主要不同结构类型
化合物 , 大豆皂苷 II 甲酯 (1), 大豆皂苷 I (2),
芒柄花苷 (3), 柚皮苷 (4), 下箴桐碱 (5)和色
氨酸 (6)的分离鉴定及抗氧化活性 。化合物 4和
6为首次从该属植物中获得 。采用过氧化氢损伤的
SH-SY5Y细胞与野生型 DJ-1 基因转染的 SH-
SY5Y 细胞模型对得到的皂苷和黄酮类代表性化合
543中国药事 2010年第 24卷第 6期
物进行了抗氧化应激相关活性的研究 , 从中发现了
化合物 3具有较好的抗氧化应激作用。
1　实验部分
1.1　材料与仪器
药材 [采自甘肃省武都 , 原植物由香港浸会大
学中药学院的陈虎彪教授鉴定为豆科岩黄芪属植物
多序 岩黄 芪 (Hedysarum polybotrys Hand.-
Mazz.), 标本存于北京大学药学院植物标本室
(PEM)] 。
熔点用 XT-4A 和 X4 型显微熔点仪测定(温度
计未校正)。核磁共振谱用 Bruker DRX-500 和
VXR-300型核磁共振波谱仪测定 (TM S为内标)。
柱色谱和薄层色谱分离用硅胶 (青岛海洋化工厂),
其他试剂和药品 (北京化工厂 , 分析纯)。
活性筛选用化合物 (从红芪药材中分离获得),
人多巴胺能神经母细胞瘤细胞株 (SH-SY5Y 细胞)
和野生型 DJ-1 基因转染的 SH-SY5Y细胞 (北京
大学药学院分子与细胞药理学系蒲小平教授提供)。
1.2　化学成分的提取分离
红芪药材 6.7kg , 粉碎后用 10倍量的 95%乙
醇渗漉提取 , 药渣继续用 50%乙醇渗漉提取 , 合
并提取液 , 减压浓缩所得浸膏用适量水混悬后 , 依
次用乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇萃取液回收溶
剂后得到的正丁醇萃取物 50.0g 。正丁醇萃取物经
硅胶柱色谱 , 三氯甲烷-甲醇-水为溶剂系统洗脱得
到 A (1.2g)、 B (2.0g)和C (40g)3部分。B部
分经反复 Sephadex LH-20 柱色谱分离得到化合物
3 (20mg)。C 部分 (40g)经大孔树脂 Diaion HP-
20柱色谱 , 水-甲醇 (100 ∶0※0∶100)梯度洗
脱 , 其中甲醇洗脱物 (3.3g)经 Sephadex LH-20
和 RP-C18柱色谱分离得化合物 1 (18mg)和 2
(14mg);70%甲 醇 洗 脱 物 (4.7g) 经 反 复
Sephadex LH-20柱色谱分离得化合物 4 (2.2g);
30%甲醇洗脱物 (0.76g)经 Sephadex LH-20 和
RP-C18柱色谱分离得化合物5 (8mg)和 6 (5mg)。
1.3　抗氧化活性筛选
活性筛选实验采用 SH-SY5Y 细胞与野生型
DJ-1基因转染的 SH-SY5Y细胞 , 使用过氧化氢造
模 , MTT 法考察化合物的抗氧化损伤活性。实验
分为空白对照组 (未加入任何药物)、 模型组 (仅
加入过氧化氢造模)、阳性药组 (200μg · L-1)的
神经生长因子 (NGF)、 化合物低剂量组 (10mg ·
L
-1)以及高剂量组 (20mg ·L-1)。
细胞以 5×105 · mL-1的细胞密度铺入 96 孔
板 , 每组样本设 6个平行孔 , 每孔 200μL , 5%小
牛血清培养 24h , 待细胞贴壁后 , 弃去培养基 , 加
入待筛选化合物和阳性药物 , 使之终浓度分别为
20 、 10mg · L-1以及 200μg ·L-1 。然后在 36.5℃、
5%CO 2 条件下培养 6h 。弃去培养基 , 除未造模
对照组外 , 每孔加入 H2O2 (200μmol · L-1)造模
1h 。然后弃去培养基 , PBS 洗涤 2遍后加入终浓
度为 0.5g ·L-1的 MTT 培养 4h。最后弃去孔内液
体 , 每孔加入 200μL DMSO , 振荡待蓝色颗粒完
全溶解后 , 使用酶标仪在 570nm 波长测量吸光度
值 , 未接受 H 2O 2 处理的空白对照组的吸光度值设
为 100%, 计算细胞存活率。
2　结果与讨论
2.1　结构鉴定
化合物 1:Libermann-Burchard 和 Molish 反
应阳性 , 与大豆皂苷 II 甲酯对照品的 T LC 和
HPLC 色谱行为完全一致 , 故确定化合物 1为大豆
皂苷 II甲酯 。
化合物 2:Libermann-Burchard 和 Molish 反
应阳性 , 与大豆皂苷 I 对照品的 T LC 和 HPLC 色
谱行为完全一致 , 故确定化合物 2为大豆皂苷 I 。
化合物 3:白色粉末 , mp 213-214℃, 1H-
NMR (DMSO-d6 , 500 MHz):δ8.33 (1H , s , H-
2), 8.03 (1H , d , J=9.0Hz , H-5), 7.14 (1H ,
dd , J =2.0 , 9.0Hz , H-6), 7.20 (1H , d , J =
2.0Hz , H-8), 6.96 (2H , d , J =9.0Hz , H-3′,
5′), 7.47 (2H , d , J =9.0Hz , H-2′, 6′), 5.06
(1H , d , J =7.5Hz , g lc H-1), 3.15 (3H , s ,
OCH 3)。 13C-NMR (DMSO-d6 , 125 MHz):δ
154.1 (C-2), 124.3 (C-3), 175.5 (C-4), 127.5
(C-5), 116.2 (C-6), 161.9 (C-7), 103.9 (C-8),
157.5 (C-9), 118.9 (C-10), 123.9 (C-1′),
114.2 (C-3′, 5′), 130.6 (C-2′, 6′), 159.5 (C-
4′), 55.6 (OCH 3), 100.4 (g lc C-1), 73.5 (glc
C-2), 76.7 (g lc C-3), 70.1 (g lc C-4), 77.4 (glc
C-5), 61.1 (glc C-6)。以上数据与文献[ 3] 报道的
芒柄花苷数据一致 , 因此确定化合物 3的结构为芒
柄花苷 , 即 7-羟基-4′-甲氧基异黄酮-7-O-β-D-葡萄
糖苷。
化合物 4:白色粉末 , mp 169-171℃, UV
(λMeOHmax , nm):283.0 (0.735 , 带 II), 329.5
(0.187 , 带 I);加入诊断试剂醋酸钠 , 283.0
(0.719 , 带 II 无变化 , 无游离 7-OH)。1H-NMR
(DMSO-d6 , 300 MHz):δ5.50 (1H , dd , J =
544 中国药事 2010年第 24卷第 6期
12.6 , 3.0Hz , H-2), 3.23 (1H , dd , J =17.1 ,
12.6 Hz , H-3α), 2.79(1H , dd , J=17.1 , 3.0Hz ,
H-3β), 6.14 (1H , d , J =2.4Hz , H-6), 6.16
(1H , d , J =2.4Hz , H-8), 6.89 (2H , d , J =
8.4Hz , H-3′, 5′), 7.39 (2H , d , J=8.4Hz , H-
2′, 6′), 12.07 (5-OH), δ5.16 (1H , d , J =
7.5Hz , g lc H-1), 5.34(1H , brd , rha H-1)。13 C-
NMR(DMSO-d6 , 75 MHz):δ78.6 (C-2), 42.1
(C-3), 197.2 (C-4), 162.9 (C-5), 96.3 (C-6),
164.9 (C-7), 95.1 (C-8), 162.8 (C-9), 103.3
(C-10), 128.6 (C-1), 128.5 (C-2), 115.2 (C-
3), 157.8 (C-4), 115.2 (C-5 ), 128.5 (C-6),
97.4 (g lc C-1), 77.1 (glc C-2), 76.9 (g lc C-3),
69.5 (g lc C-4), 76.0 (glc C-5), 60.4 (g lc C-6),
100.4 (rha C-1), 70.4 (rha C-2), 70.4 (rha C-
3), 71.8 (rha C-4), 68.3 (rha C-5), 18.0 (rha
C-6)。以上数据与文献[ 4] 报道的柚皮苷数据一致 ,
因此确定化合物 4的结构为柚皮苷 , 即 5 , 7 , 4-三
羟基-二氢黄酮-7-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1※2)-β-D-
吡喃葡萄糖苷。
化合物 5:白色结 晶 , mp 280-283℃, 1H-
NMR (MeOH-d4 , 300MHz):δ7.17 (1H , s , H-
2), 7.62 (1H , dd , J=0.9 , 6.9Hz , H-4), 7.07
(2H , m , H-5 , 6), 7.33 (1H , dd , J =1.2 ,
6.6Hz , H-7), 3.41 (2H , brd , J =12.0Hz , H-
10), 3.88 (1H , t , J=7.8Hz , H-11), 3.30 (9H ,
s , 3 ×CH 3)。13 C-NMR (MeOH-d4 , 75MHz):δ
125.1 (C-2), 109.0 (C-3), 120.0 (C-4), 119.0
(C-5), 112.6 (C-6), 122.4 (C-7), 138.1 (C-8),
128.3 (C-9), 24.7 (C-10), 80.6 (C-11), 171.7
(C-12), 52.7 (3×CH3)。以上数据与文献[ 6] 报道
的下箴桐碱数据基本一致 , 且与下箴桐碱对照品进
行 T LC对照 , 二者色谱行为一致 , 因此确定化合
物 5的结构为下箴桐碱 , 即 N , N , N-三甲基-色氨
酸内铵盐 。
化合物 6:淡黄色粉末 , 1H-NM R (DMSO-d6 ,
300MHz):δ10.90 (1H , s , NH), 7.19 (1H , d ,
J=2.4Hz , H-2), 7.05 (1H , t , J =6.9Hz , H-
7), 7.55 (1H , d , J=7.5Hz , H-5), 6.96 (1H ,
t , J=6.9Hz , H-6), 7.33 (1H , d , J=8.1Hz , H-
8), 3.40 (1H , ove rlapped , H-α), 3.30 (1H ,
overlapped , H-β), 2.94 (1H , dd , J =15.0 ,
9.0Hz , H-β)。13 C-NMR (DMSO-d6 , 75MHz):
δ124.0 (C-2), 109.7 (C-3), 127.3 (C-4), 118.4
(C-5), 118.3 (C-6), 120.9 (C-7), 111.3 (C-8),
136.3 (C-9), 54.8 (C-α), 27.2 (C-β), 169.8
(COOH)。以上数据与文献[ 5] 报道的色氨酸数据一
致 , 因此确定化合物 6的结构为色氨酸。
2.2　抗氧化活性筛选实验结果
化合物 1 ～ 3的活性筛选实验结果见表 1。
表 1　化合物 1 ～ 3的抗氧化活性实验结果
实验样品 剂量
细胞存活率(%)
正常的
SH-SY5Y
转染的
SH-SY5Y#
空白组 - 100 100
模型组(H 2O 2) 200μm ol· L-1 76 81
阳 性 对 照 组
(NGF)
200μg· L-1 81 -
1　低剂量组 10mg· L-1 76 75
　高剂量组 20mg· L-1 79 73
2　低剂量组 10mg· L-1 73 79
　高剂量组 20mg· L-1 72 89
3　低剂量组 10mg· L-1 80 85
　高剂量组 20mg· L-1 　　83＊ 　　91＊＊
　注:＊P<0.05 , ＊＊P<0.01;#即用野生型 DJ-1基因转染的 SH-
SY5Y 细胞。
　　由实验结果可以看出 , H2O 2 导致细胞氧化应
激损伤 , 细胞存活率下降 。20mg ·L-1的化合物 3 ,
可提高 H 2O 2 损伤的 SH-SY5Y 细胞的存活率 , 与
模型组比较 P<0.05;在野生型 DJ-1基因转染的
SH-SY5Y细胞氧化应激模型中 , 化合物 3 也可提
高细胞存活率 , P <0.01。实验初步表明化合物 3
在 20mg · L-1浓度时 , 可以对抗 H2O 2 致氧化应激
模型 , 对细胞有较好的保护作用 , 其抗氧化损伤活性
的作用机制和药效学等还有待进一步的深入研究。
DJ-1基因的突变与帕金森病有关。野生型 DJ-
1基因具有清除活性氧 、 对抗氧化损伤 、 抑制细胞
氧化应激的作用[ 7] 。野生型 DJ-1的过表达可以显
著降低过氧化氢导致的细胞死亡 。本研究同时使用
未转染和野生型 DJ-1基因转染的 SH-SY5Y细胞 ,
比较了化合物在 2 种细胞氧化应激模型中的作用 ,
发现 20mg ·L-1时化合物 3 具有抗氧化应激作用。
与未转染 SH-SY5Y细胞氧化应激模型相比 , 在野
生型 DJ-1基因转染的模型中 20mg ·L-1时化合物 3
对细胞的保护作用更强 (91%比 83%, P <0.01
比 P<0.05)。这反映了化合物 3 对抗氧化应激的
作用机制有可能并不是直接对抗氧化应激损伤 , 而
是与野生型 DJ-1有协同作用 。其详细机制还有待
于进一步研究。
(下转第 549页)
545中国药事 2010年第 24卷第 6期
表 5　4 批鹿瓜多肽注射剂降压物质检查结果 mmHg
样品编号 厂家 批号 检查
dS1 dT 1 dT 2 ds2
　 复查
dS1 d T1 d T2 ds2
1 E 050718 33 8 4 47 　 　 　 　 　 符合规定
2 　 070328 45 14 8 41 　 　 　 　 　 符合规定
3 　 050309 45 7 15 50 　 　 　 　 　 符合规定
4 F 20060915 41 29 31 49 　 42 26 32 43 符合规定
表 6　6 批骨瓜提取物注射液降压物质检查结果 mmHg
样品编号 厂家 批号 规格(mL∶m g)
检查
dS1 dT 1 dT 2 d s2
　 复查
dS1 d T1 dT 2 ds2
1 G 20070209 5∶25 32 69 69 36 　 37 78 92 42 不符合规定
2 　 20070525 2∶10 32 54 50 28 　 35 60 59 39 不符合规定
3 H 070104 10∶50 33 3 7 38 　 　 　 　 　 符合规定
4 　 060302 5∶25 30 13 13 32 　 　 　 　 　 符合规定
5 　 060101 5∶25 37 15 11 40 　 　 　 　 　 符合规定
6 　 060303 10∶50 38 7 8 33 　 　 　 　 　 符合规定
3　讨论
多组分生化药大多来自动物脏器的提取物 , 来
源复杂 , 存在组分不明 、 结构不清或有可能因脏器
离体后组织出现自溶现象混入组胺 、类组胺样具有
降压作用的活性物质 , 从而影响药物的治疗和产生
意外不良反应。因此 , 在多组分生化药注射剂质量标
准中检查降压物质是确保临床安全用药的重要措施。
鹿瓜多肽注射剂和骨瓜提取物注射液分别从梅
花鹿骨和甜瓜籽 、 猪骨和甜瓜籽提取精制后制成 ,
药物成分复杂 , 原标准中均有降压物质检查
项[ 9-11] , 但未设剂量限值 , 说明该类品种质量标准
不完善 , 本研究根据 《中国药典》 2005年版一部
附录[ 8] 确定了临床用药剂量作为降压物质的检查限
值 , 对原有标准进行了补充修改。
脑苷肌肽注射液和曲克芦丁脑蛋白水解物注射
液本研究虽未发现有降压反应 , 但在我国 , GMP
尚处于初级阶段 , 药品质量尚处于中低水平 , 在药
品生产过程中由于可变因素多而不可避免地产生影
响安全性 、有效性的质量问题 , 此类产品增订降压
物质检查项对其药品的质量控制是必要的。
从降压物质检查实验结果可见脾多肽注射液在
静脉注射时有明显的降压作用 , 本研究按 《中国药
典》 2005年版一部附录确定的降压物质的检查限
值 1∶20 稀释液 0.2mL ·kg-1是临床人用量的 1/
17 。对照 “注射剂安全性检查法应用指导原则” 的
要求 , 这一限值明显偏低 , 因此 , 更合理的降压物
质的检查限值的设定 , 值得进一步探讨。
参考文献:
[ 1] 肖先存 , 吴美丽 , 杨翠琳.脑苷肌肽注射液致过敏反应 3例
[ J] .药物不良反应杂志 , 2004 , (3):184-185.
[ 2] 赵晋.鹿瓜多肽过敏反应 15例文献分析 [ J] .中国中医药
信息杂志 , 2009 , 16 (2):111-112.
[ 3] 国家药品监督管理局药品标准 [ S] .WS-10001- (HD-
0874)-2002-2005.
[ 4] 国家药品监督管理局药品标准 [ S] .WS-10001- (HD-
1488)-2003-2005.
[ 5] 国家药品监督管理局药品标准 [ S] .WS-10001- (HD-
1531)-2004-2005.
[ 6] 中国药典 [ S] .二部 , 2005:附录Ⅺ G.
[ 7] 中国药典 [ S] .二部 , 2010:附录ⅪⅩM.
[ 8] 中国药典 [ S] .一部 , 2005:附录Ⅹ Ⅷ B.
[ 9] 国家药品监督管理局药品标准 [ S] .WS1-XG-002-2002.
[ 10] 国家药品监督管理局药品标准 [ S] .YBH 13342005.
[ 11] 国家药品监督管理局药品标准 [ S] .YBH 31832005
(上接第 545页)
参考文献:
[ 1] 中国药典 [ S] .一部 , 2005:104-104.
[ 2] 中国科学院中国植物志编辑委员会编.中国植物志 [ M] .
第四十二卷(第二分册).北京:科学出版社 , 1998:177-177.
[ 3] Liu Y , Zhao Y Y , Tu G Z , et al.Flavonoids f rom the root s
of Hedysarum gmelinii [ J] . Biochem Syst Ecol , 2005 ,
(33):809-812.
[ 4] 雷海民 , 孙文基 , 林文翰.化洲橘红的化学成分研究 [ J] .
西北药学杂志 , 2000, 15 (5):203-204.
[ 5] 海力茜 , 梁鸿 , 赵玉英 , 等.多序岩黄芪化学成分研究
[ J] .中国中药杂志 , 2004 , 29 (5):432-434.
[ 6] 梁鸿 , 赵玉英 , 崔艳君 , 等.北柴胡中黄酮类化合物的分离
鉴定 [ J] .北京医科大学学报 , 2000 , 32 (3):223-225.
[ 7] Zhou W , Freed C R.DJ-1 Up-regulates Glctathione S ynthe-
sis during Oxidat ive St ress and Inhibit s A53T α-Synuclein
T oxicity [ J] . J Biol C hem , 2005 , 280 (52):43150-43158.
549中国药事 2010年第 24卷第 6期