全 文 ：收稿日期:2012-10-12; 修订日期:2013-03-11
基金项目:国家自然科学基金青年项目(No． 81001666) ;
上海市教育委员会科研创新项目(No． 13YZ048) ;
上海高校选拔培养优秀青年教师基金资助项目 (No．
SZY07029)
作者简介:王原来(1991-) ，女(汉族) ，湖南岳阳人，现任上海中医药大学
穆拉德中心硕士研究生，学士学位，主要从事抗肿瘤中药的机制研究工
作．
* 通讯作者简介:章丹丹(1980-) ，女(汉族) ，浙江上虞人，现任上海中医
药大学穆拉德中心副研究员，博士学位，主要从事肿瘤相关性炎症的机制
及中药干预研究工作．
黑种草子抑制乳腺癌细胞增殖
的组分筛选及机制分析
王原来1，杨晓露1，卞 卡2，章丹丹1*
(1．上海中医药大学 穆拉德中药现代化研究中心，上海 201203;
2．美国乔治华盛顿大学 生物化学与分子生物学系，华盛顿 20052)
摘要:目的 结合体外筛选确定黑种草子抑制小鼠乳腺癌 4T1 细胞增殖的有效组分并进行初步的机制分析。方法 通过
有机溶剂萃取和大孔树脂富集获得黑种草子各提取物，结合体外 MTT 法筛选黑种草子的各提取物中对 4T1 细胞具增殖
抑制作用的有效组分;集落形成法考察有效组分对细胞集落形成的影响;Western Blot法考察黑种草子有效组分干预前后
4T1 细胞中 p － JAK2 的蛋白表达。结果 黑种草子总黄酮(相对含量为 60． 19%)抑制 4T1 细胞增殖的 IC50 为最低，同时
呈剂量依赖性抑制 4T1 细胞的集落形成，并下调细胞中 p － JAK2 的蛋白表达。结论 黑种草子总黄酮是黑种草子抑制乳
腺癌 4T1 细胞增殖和集落形成的有效组分，部分是通过抑制 JAK /STAT信号转导通路中关键蛋白的磷酸化而发挥抗增殖
效果的。
关键词:黑种草子; 有效组分; 乳腺癌; 抑制增殖; JAK2 / STAT3 信号通路
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 06． 004
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2013)06-1289-03
Study on the active constituents and anti － proliferation mechanisms of Nigellae Semen
WANG Yuan-lai1，YANG Xiao-lu1，BIAN Ka2，ZHANG Dan-dan1*
(1． Murad Research Institute for Modernized Chinese Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medi-
cine，Shanghai 201203，PR China;2． Department of Biochemistry and Molecular Biology，George Washington U-
niversity，Washington，DC 20052，USA)
Abstract:Objective To study the active constituents and anti － proliferation mechanism of Nigellae Semen．Methods Ethanol，
light petroleum，ethyl acetate，n － butanol and water extraction，different fractions from ethyl acetate and n － butanol were separated
by using organic solution and macroporous resin． MTT assay for breast cancer cells proliferation capability． Colony formation assay
in three － dimensional culture for cells colony formation calculation ． Western blot for protein expression． Results Compared with
other constituents，total falvones of Nigellae Semen(TFNS)exhibited the strongest suppressing effect on cell proliferation． TFNS
showed dose － dependent inhibitory effect on colony formation． The protein expression of p － JAK2 was inhibited by TFNS，too．
Conclusion These results suggest that TFNS may provide potential anti － proliferation and inhibitory effect of colony formation
through inhibiting JAK2 protein phosphorylation on JAK /STAT signal pathway activation．
Key words:Nigellae Semen; Active constituents; Breast cancer; Molecular mechanism of anti － proliferation; JAK /
STAT signal pathway
黑种草子(Nigellae Semen)为瘤果黑种草(Nigella glandulif-
era Freyn et Sint．)的干燥成熟种子，为维吾尔族药食同源的习用
药。其性味甘、辛，温，有补肾健脑、通经、通乳、利尿之功效［1］，
现代药理研究发现其具有抗肿瘤［2，3］、镇咳［4］、镇痛［5］、抗炎［6］、
抗氧化［7，8］、抗血小板聚集［9］、抗菌［10］等功效，但其抗肿瘤的物
质基础和机制研究尚未系统和深入的研究。本研究结合体外筛
选和极性分离方法，追踪确定黑种草子对乳腺癌细胞株具有抑制
效果的活性组分，并对其进行初步的机制分析。
1 材料
1． 1 不同层次提取物的制备 黑种草子购于新疆乌鲁木齐二道
桥市场，由上海市食品药品检验所鉴定为黑种草子(报告书编
号:20080350)。称取黑种草子药材，粉碎，用 75%乙醇 80℃加热
回流 2 h，重复 3 次，得醇提物。经石油醚脱脂后，醇提物加水溶
解，乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次分别萃取，分别获得石油醚、乙
酸乙酯、正丁醇和萃后水组分。取乙酸乙酯和正丁醇组分，用 D
－101 树脂柱吸附，用水冲柱，继而以 10%、30%、50%、70%的乙
醇 －水溶液依次洗脱，得 0% ～ 70%乙醇洗脱液。以芦丁为标准
品，三氯化铝为显色剂，测定 70% 醇溶液洗脱液的总黄酮
(TFNS)含量为 60． 19%。
1． 2 细胞 小鼠乳腺癌 4T1 细胞，购自中国科学院细胞库。
1． 3 试剂 大孔吸附树脂 D101 购自上海文旻生化技术有限公
司;噻唑蓝(MTT)、琼脂购自 sigma公司;胎牛血清 (FBS) ，RPMI
－1640 培养基干粉购于 Gibco公司;抗体 p － JAK2、GAPDH 购买
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 6 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 6 期
自 Cell signal Technology公司;ECL检测试剂，购自 GE公司;蛋白
含量测定试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司;其他试剂为国
产分析纯。
1． 4 仪器 HEPA CLASS100 型 CO2 培养箱，Thermo 公司;Spec-
traMAX 190 型酶标仪，Molecular Devices 公司;5810 R 高速冷冻
离心机，Eppendorf公司;Delta series 型生物安全柜，Labconco 公
司，IX 71 倒置相差显微镜，Olympus公司;单向蛋白电泳设备，Bio
－ rad公司;sMPIC2600C自动 X线胶片洗片机，上海申贝公司。
2 方法
2． 1 MTT法测定细胞增殖能力 取处于对数生长期的 4T1 细
胞，细胞密度为 1 × 105 个 /ml，于 96 孔培养板中每孔加入 100 μl
细胞悬液，置于 5% CO2，37℃的细胞培养箱中培养 24 h。细胞
分为正常对照组(完全培养液，加 0． 1%的 DMSO) ;黑种草子各
提取物给药组，以 200，100，50μg·ml －1剂量处理;阳性对照姜黄
素组，以 100，10，1 μmol /L 剂量处理。各组细胞培养 24 h，加入
MTT溶液 20 μl，继续于细胞培养箱中孵育 4 h，弃上清，加入 150
μl DMSO，振荡溶解结晶，10 min 后于酶标仪检测 490 nm 吸光
值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率:抑制率(%)=(正常
对照组 OD值 －给药组 OD值)/正常对照组 OD值 × 100%。
2． 2 细胞集落形成实验 琼脂层与血清、培养液按比例配制吸
取 100 μl铺于 96 孔板，形成底层琼脂。取处于对数生长期的
4T1 细胞，调整细胞密度为 1000 个 /孔，与琼脂糖、血清、培养
液按比例配制，吸取 100 μl 于凝固的琼脂层之上，形成上层
琼脂，细胞分为正常对照组(完全培养液，加 0． 1% 的 DM-
SO) ;黑种草子总黄酮给药组 25，50 μg·ml － 1;阳性对照组
(姜黄素，60，40，20 μmol /L;紫杉醇，60，40，20 μmol /L) ;每
组设 6 个平行对照。培养 10 ～ 28 d，更新黑种草子总黄酮各
处理组药液，对照组更新同体积的无血清培养液加 0． 1%
DMSO。倒置相差显微镜下观察细胞集落形成情况，使用
UTHSCSA Image Tool software进行数据采集，以单位面积中集
落面积(mm2)计算细胞集落平均形成率。
2． 3 Western blot 法检测总黄酮对 p － JAK2 蛋白表达的影响
RAW 264． 7 细胞培养于 30 mm 细胞培养皿中，TFNS 采用 25，50
μg·ml －1剂量处理 24 h，用冰 PBS洗涤，加入蛋白酶抑制剂和磷
酸酶抑制剂后收集细胞，超声破碎，离心 (12 000 r /min，15 min，4
℃) ，取蛋白上清液进行蛋白含量测定。每孔加入 25 μg的蛋白
上样，在 SDS － PAGE凝胶中电泳，蛋白转移到 PVDF膜上，脱脂
牛奶或 BSA封闭，分别用一抗 p － JAK2(1∶ 1 000)、GAPDH(1∶
2 000)孵育过夜，洗膜，二抗孵育，洗膜，显影。
2． 4 统计学方法 实验数据用 珋x ± s 表示，组间差异显著性检验
采用 t检验。
3 结果
3． 1 黑种草子各层次提取物对 4T1 乳腺癌细胞株增殖能力的影
响 由表 1 可见，与其它提取物比较，黑种草子的总黄酮 TFNS(即
乙酸乙酯提取物的 70%洗脱组分)对 4T1 细胞增殖的抑制效果
最强，其呈剂量依赖性抑制 4T1 细胞增殖，其 IC50 为 24． 18
μg·ml －1，而姜黄素 IC50为 16． 43 μmol /L。
3． 2 黑种草子总黄酮对细胞集落形成的影响 如图 1 所示，黑种
草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制 4T1 细胞集落形成(P ＜
0． 01) ，阳性对照药物姜黄素和紫杉醇也呈抑制效果(P ＜ 0． 01) ，
但在相同剂量的抑制效果不及黑种草子总黄酮。
3． 3 黑种草子总黄酮对 p － JAK2 蛋白表达的影响 如图 2 所示，
在乳腺癌细胞 4T1 中 JAK2 蛋白高度磷酸化。黑种草子总黄酮
在 50 μg·ml －1剂量能显著抑制 JAK2 蛋白的磷酸化水平(P ＜
0． 01)。
表 1 黑种草子各层次提取物对 4T1 乳腺癌细胞株增殖能力的影响(珋x ± s)
样品
剂量 /
μg·ml －1
抑制率
(%)
IC50 /
μg·ml －1
醇提取物 200 0 ± 0． 02 －
100 0 ± 0． 14
50 0 ± 0． 02
石油醚提取物 200 42． 67 ± 0． 03 －
100 0 ± 0． 08
50 0 ± 0． 10
乙酸乙酯提取物 200 41． 64 ± 0． 06 －
100 26． 57 ± 0． 09
50 0 ± 0． 10
正丁醇提取物 200 5． 18 ± 0． 05 －
100 0 ± 0． 03
50 0 ± 0． 07
水提取物 200 11． 47 ± 0． 11 －
100 0 ± 0． 03
50 0 ± 0． 11
乙酸乙酯水组分 200 27． 03 ± 0． 08 －
100 0 ± 0． 11
50 0 ± 0． 06
乙酸乙酯 10%醇组分 200 0 ± 0． 07 －
100 0 ± 0． 16
50 0 ± 0． 12
乙酸乙酯 30%醇组分 200 0 ± 0． 08 －
100 0 ± 0． 05
50 0 ± 0． 13
乙酸乙酯 50%醇组分 200 47． 56 ± 0． 02 －
100 0 ± 0． 06
50 0 ± 0． 03
乙酸乙酯 70%醇组分(TFNS) 200 84． 83 ± 0． 01 23． 43
100 83． 80 ± 0． 00
50 62． 08 ± 0． 01
正丁醇水组分 200 17． 49 ± 0． 06 －
100 11． 38 ± 0． 10
50 0 ± 0． 06
正丁醇 10%醇组分 200 9． 18 ± 0． 02 －
100 4． 43 ± 0． 05
50 2． 70 ± 0． 06
正丁醇 30%醇组分 200 0 ± 0． 06 －
100 0 ± 0． 07
50 0 ± 0． 08
正丁醇 50%醇组分 200 0 ± 0． 05 －
100 0 ± 0． 05
50 0 ± 0． 03
正丁醇 70%醇组分 200 74． 62 ± 0． 00 108． 75
100 37． 38 ± 0． 03
50 28． 37 ± 0． 07
姜黄素 － － 16． 43 μmol /L
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 6
C:空白对照组;25，50 分别为
黑种草子总黄酮 25，50 μg·ml －1剂量处理组;20，40，60 分别指
姜黄素或紫杉醇 20，40，60 μmol /L剂量处理组;
与空白对照组比较，＊＊P ＜ 0． 01
图 1 黑种草子总黄酮对 4T1 小鼠乳腺癌细胞集落形成的影响
C:空白对照组;25，50 分别为
黑种草子总黄酮 25，50 μg·ml －1剂量处理组;20，40，60 分别指
姜黄素或紫杉醇 20，40，60 μmol /L剂量处理组;
与空白对照组比较，＊＊P ＜ 0． 01
图 2 黑种草子总黄酮对乳腺癌细胞中 JAK2 蛋白磷酸化的影响
4 讨论
《中华本草》记载黑种草子主治月经不调、闭经、乳少、水肿、
尿路结石、头晕耳鸣、须发早白、咳喘、疥疮、白癜风。临床用于耳
鸣健忘，闭经少乳和尿路结石。国外研究集中于其近源属种家黑
种草 Nigella sativa Linn．和黑种草 Nigella damascena L．的挥发油
及活性单体在抗肿瘤［11，12］中的开发应用。而新疆的特有种属瘤
果黑种草现研究集中于镇咳、生发乌发等功效，目前开发有斯亚
旦生发酊［13］等产品。但在抗肿瘤领域尚未深入研究，值得进一
步推进。
本研究通过体外筛选黑种草子的各层次提取物对乳腺癌细
胞株 4T1 的增殖抑制效果，确定了黑种草子总黄酮为抑制 4T1 细
胞增殖的活性组分;且能抑制模拟立体生长状态下的细胞集落形
成，提示其不仅作用于肿瘤细胞本身，还能对肿瘤微环境产生影
响。
Janus 蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosine kinase，JAK)和
转录活化蛋白 (signal transducer and activator of transcription，
STAT)在正常乳腺发育和乳腺癌发生中均起着重要作用。细胞
膜上的细胞因子受体与相应的配体结合后，使胞质内 JAK 相互
磷酸化，JAK 的下游信号是 STAT家族，活化后的 STAT形成二聚
体，转位至胞核，完成从胞质到核内的信号转导。而 JAK2 /
STAT5 该途径的激活与乳腺癌肿瘤的发生转移有着密切联
系［14］。黑种草子总黄酮能抑制 JAK2 的磷酸化水平，抑制其通路
的持续活化。
综上所述，黑种草子总黄酮为抑制乳腺癌细胞株 4T1 增殖和
集落形成的有效组分，部分机制是通过抑制 JAK /STAT信号转导
通路中的关键蛋白 JAK2 的磷酸活化水平。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL． 24 NO． 6 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 6 期