全 文 ：植物生态学报 2010, 34 (7): 839–844 doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.009
Chinese Journal of Plant Ecology http://www.plant-ecology.com
——————————————————
收稿日期Received: 2009-09-02 接受日期Accepted: 2010-05-26
* 同等贡献 Contributed equally to this study
** 通讯作者Author for correspondence (E-mail: hqma@cau.edu.cn)
文冠果一、二年生植株根系内生菌的分离、鉴定和
固氮活性
张 烨1* 廖 怡1* 陈尚武2 马会勤1**
1中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193; 2中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京 100083
摘 要 该文对文冠果(Xanthoceras sorbifolia)根系内生菌的种类和固氮活性进行了首次报道。试验以田间栽培的文冠果一、
二年生植株为材料, 以Ashby和YMA为培养基, 对根系内生菌进行了分离, 通过对菌落形态的观察, 划线挑取单菌落培养,
并对7个代表性的单菌落进行扩大培养, 提取其DNA, 采用细菌16S rDNA通用引物序列进行PCR扩增, 胶回收、测序后, 进
行Blast比对分析。试验结果表明: YMA培养基上的菌落数量和种类均明显多于Ashby培养基上的菌落。田间一年生文冠果与
田间二年生文冠果的根系内生菌情况存在差异。一年生文冠果的根系内生菌数量与种类略多于二年生文冠果。一年生文冠果
根系中分离得到的主要内生菌为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和产酸克雷伯菌
(Klebsiella oxytoca)等; 田间二年生文冠果根系中分离得到的主要内生菌为假单胞菌属(Pseudomonas)细菌。固氮活性测定结
果表明, 在所分离的7个菌株中, 6个测到了固氮酶活性, 其中鉴定为产酸克雷伯菌的菌株固氮酶活性显著高于其他菌株 ,
达到9.688 nmol·mg–1·h–1, 为文冠果固氮菌肥的菌种的筛选奠定了基础。
关键词 内生菌, 鉴定, 分离, 文冠果
Isolation, preliminary identification and nitrogen-fixation activity of endophytes from roots of
one- and two-year-old Xanthoceras sorbifolia plants
ZHANG Ye1*, LIAO Yi1*, CHEN Shang-Wu2, and MA Hui-Qin1**
1College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; and 2College of Food Science and Nutritional Engineering,
China Agricultural University, Beijing 100083, China
Abstract
Aims Endophytes are found in the root systems of various plants and play beneficial roles in root growth and
function maintenance, especially when plants are under biotic or abiotic stress. Xanthoceras sorbifolia is a unique
woody plant that grows in the northern part of China and is resistant to cold and drought and highly tolerant to
poor soil. Moreover, it is considered a promising candidate for bio-diesel and bio-lubricant production. Our objec-
tive was to investigate endophytes in the roots of X. sorbifolia. Results will help in the selection and development
of bacterial fertilizer to improve the growth and yield of X. sorbifolia, which grows in marginal lands.
Methods We examined root systems of field-grown one- and two-year-old plants. After surface sterilization,
endophytes were isolated with yeast-malt extract agar (YMA) and Ashby media respectively. Seven representative
single colonies were selected according to their macro-morphology. After DNA extraction and purification, 16S
rDNA PCRs were carried out with the universal bacterial primers. The PCR products were separated with elec-
trophoresis, collected and purified. The 16S rDNA sequence similarity search of different bacteria was performed
by Blast on NCBI against GenBank, and a similarity of 97% was set as the criterion for identity. Nitrogenase ac-
tivity of the selected strains was assayed with ethylene production by GC.
Important findings The number and type of colonies on YMA medium were significantly more than those on
Ashby medium, as YMA medium contains a small amount of nitrogen and is more suitable for bacteria growth.
The number and species of endophytes in one-year-old X. sorbifolia roots were slightly more than those in
two-year-old plants. This may be because the roots of one-year-old plants were as a whole younger than those of
two-year-old plants and were more suitable for the infection and survival of endophytic bacteria. The main bacte-
ria species isolated from the roots of one-year-old plants were Pantoea agglomerans, Agrobacterium tumefaciens
840 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 839–844
www.plant-ecology.com
and Klebsiella oxytoca, while those from two-year-old plants were of the Pseudomonas genus. Six of seven strains
demonstrated nitrogenase activity, including the activity of 9.688 nmol·mg–1·h–1 in K. oxytoca, which is sig-
nificantly higher than other strains. This report on endophytes of X. sorbifolia roots provides the basis for bacteria
fertilizer strain selection.
Key words endophytes, identification, isolation, Xanthoceras sorbifolia
文冠果(Xanthoceras sorbifolia)为无患子科文冠
果属落叶灌木或小乔木, 别名木瓜、文官果和崖木
瓜等, 是我国西北地区特有的一种优良木本油料树
种(臧国忠等, 2008)。文冠果耐干旱、贫瘠、抗风沙,
在石质山地、黄土丘陵、石灰性冲积土壤和固定或
半固定的沙区均能生长, 甚至在裸露的岩石缝隙中
也能生长发育、开花结果(薛培生等, 2007)。成龄文
冠果根系发达, 既扎得深, 又分布广; 根的皮层占
91%, 肉质状的组织能充分吸收和贮存水分。文冠
果是防风固沙、荒漠化治理和小流域生态恢复的优
良树种(薛培生等, 2007)。
内生菌(endophyte)指其在生活史的某一阶段或
全部生活在宿主组织中, 不引起宿主植物明显的病
害症状, 与宿主建立互惠共生关系的一类微生物
(Kloepper & Beauchamp, 1992)。在不同的植物体内
都存在大量的内生菌, 主要包括内生真菌和内生细
菌两大类, 它们能够定殖在植物细胞间隙或细胞
内, 其中有固氮作用的全部为细菌。近年来, 在医
学、农业和生物学中对内生菌的研究和应用逐渐成
为新的热点, 并取得了许多进展, 许多内生菌已作
为生物防治剂、固氮菌剂和植物促生制剂, 广泛应
用于实验室、温室和大田。禾本科农作物如水稻
(Oryza sativa)、甘蔗(Saccharum sinense)和玉米(Zea
mays)上的内生细菌具有很强的固氮能力(邹文欣和
谭仁祥 , 1999)。感染内生细菌的红花车轴草
(Trifolium pratense)也具有抑制玉米生长的他感作
用(Sturz & Christie, 1996)。从文冠果的近缘植物,
同为无患子科、生长于我国南方的龙眼(Dimocarpus
longan)果实内曾分离到肠杆菌属(Enterobacter)、果
胶杆菌属(Pectobacterium)、克鲁沃菌属(Kluyvera)
和沙门氏杆菌属(Salmonella)等内生菌(朱育菁等,
2008)。
文冠果作为极具潜力的生物质能源植物, 其栽
培受到越来越多的重视, 但对它的各种研究还比较
少, 对其内生菌的研究还未见报道。由于我国粮食
安全的需要和有限耕地面积的限制, 文冠果的栽培
绝大多数位于农林生产的边缘地带。依靠和改善文
冠果自身对氮素等矿质营养的吸收, 对减少肥料的
投入, 降低生产成本, 提高文冠果的产量, 建设环
境友好型的生物质产业基地, 都具有重要的意义。
本试验旨在通过对文冠果根系内生菌(尤其是固氮
菌)的分离与鉴定, 比较田间文冠果一、二年生植株
根系内生菌在数量与种类上的不同, 并测定代表性
内生菌的固氮活性, 为文冠果的优质丰产栽培和文
冠果根系内生菌的应用提供一些理论基础。
1 材料和方法
1.1 材料
供试植物: 田间文冠果一、二年生植株(野生
种)。分别于2007年和2008年春季育苗, 定植于中国
农业大学科学园(北京), 常规管理。
1.2 培养基
YMA固体培养基(少氮) (Vincent, 1970): K2HP-
O4 0.2 g, MgSO4 0.2 g, Mannitol 10.0 g, Yeast extract
0.3 g, NaCl 0.05 g, Agar 15 g, 蒸馏水定容至1 L。
Ashby固体培养基(无氮) (李倍金等 , 2008):
KH2PO4 0.2 g, CaCO3 5 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, Man-
nitol 10 g, NaCl 0.2 g, Agar 15 g, CaSO4·2H2O 0.1 g,
蒸馏水定容至1 L。
1.3 内生菌的分离
分别挖取田间文冠果一、二年生植株各15棵,
随机分为5组, 每组3棵。用清水洗去泥土, 照相。
剪取根系, 在超净工作台中先用1% NaClO溶液灭
菌1 min, 再用70%乙醇灭菌30 s。无菌水冲洗4次,
第4次时, 用移液器吸取150 μL冲洗过根系的无菌
水, 分别涂于YMA和Ashby培养基平板上, 经25 ℃
培养3天后, 若无微生物长出, 表明表面灭菌彻底。
在研钵中用灭过菌的剪刀将根系剪成小段, 加入少
许无菌石英砂, 进行研磨。悬浮液放入2.0 mL离心
管中进行低速离心(750 r·min–1, 8 min, HERMLE Z
233 MK-2离心机, Germany)。取上清液100 μL涂于
YMA和Ashby培养基平板上, 共40个平板, 25 ℃培
张烨等: 文冠果一、二年生植株根系内生菌的分离、鉴定和固氮活性 841
doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.009
养3天, 观察。
1.4 内生菌的筛选与DNA的提取
根据分离平板上菌落的大小、形态和颜色分为
4组, 然后各组分别挑取代表性的菌落进行划线分
离培养, 共取36个代表性单菌落。其中田间一年生
材料在YMA和Ashby培养基上培养的单菌落各10
个, 田间二年生材料在YMA培养基上培养的单菌
落10个, 在Ashby培养基上培养的单菌落6个。25 ℃
培养3天后, 观察, 再从划线培养的平板上挑选出7
株单菌落, 分别接种到12 mL YMA液体培养基中,
28 ℃摇床过夜培养, 用于DNA的提取。
每个菌株分别取2 mL过夜培养菌液提取DNA,
方法根据Posno等(1991)的略有改进。DNA用琼脂糖
电泳观察, 用紫外分光光度法对DNA浓度和纯度进
行检测, 并调整DNA浓度为1 mg·mL–1。
1.5 16S rDNA的PCR扩增与产物测序
PCR引物 (Medlin et al., 1988): 16S-RNA-s:
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′, 16S-RNA-a: 3′-
TACCTTGTTACGACTT-5′。在25 μL的PCR反应体
系中, 10 × Taq DNA buffer 2.5 μL, dNTP 2 μL, 引物
2.5 μL, 模板DNA 1 μL, Taq DNA聚合酶0.3 μL,
ddH2O 14.2 μL。PCR反应条件: 95 ℃预变性3 min,
95 ℃变性30 s, 43 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 38个
循环。72 ℃最后延伸10 min, 4 ℃停止反应。用1%
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 培清JS-680c凝胶图
象分析仪(上海培清科技有限公司)照相记录。
将PCR产物用多功能DNA纯化回收试剂盒
(Biomed Co., Ltd., 北京)回收目标DNA片段, 送三
博远志(北京)公司进行DNA测序。对16S rDNA测序
结果在NCBI数据库上进行Blast比对, 分析序列相
似性, 设定相似性阈值为97%, 即认定在所比对的
范围内, 相似性在97%以上则认定为同一种菌。根
据Blast分析结果, 初步鉴定所分离的文冠果根系内
生菌的种类。
1.6 内生菌固氮活性的测定
内生菌固氮活性的测定采用乙炔还原法(孙建
光等, 2009)。在15 mm × 150 mm 螺口试管中加入5
mL改良固氮培养基制成斜面, 分别接种分离得到
的文冠果根系内生菌, 28 ℃培养72 h 后换橡胶塞,
注入乙炔气体使终浓度为10%, 继续培养72 h, 取
100 μL反应气体, 用气相色谱仪测定乙烯生成量。
计算菌株固氮酶活性, 固氮酶活性(nmol·mg–1·h–1) =
C2H4 (nmol)／[菌体蛋白量(mg) × 反应时间(h)], 其
中C2H4 (nmol) = C2H4体积(μL) × 273 × P/[22.4 ×
(273 + t) × 760] (孙建光等, 2009), P为气压(mm汞
柱), t为反应温度(℃)。不接种的空白斜面为阴性对
照 , 固氮类芽孢杆菌 (Paenibacillus azotofixans)
ATCC35681和圆褐固氮菌 (Azotobocter chroococ-
cum) ACCC11103为阳性对照, 每个菌株测3次重复,
取平均值为最终的测定结果。
2 结果和分析
2.1 内生菌的分离
本研究分别采用了YMA和Ashby两种培养基
对文冠果幼苗的根系内生菌进行培养, 经25 ℃培
养3天后, 涂布冲洗根系的无菌水的培养基没有长
出菌落或只有极个别单菌落, 证明表面灭菌彻底。
而从根系内生菌的提取涂板结果可以明显看出, 无
论是从数量还是种类上, YMA培养基上生长的菌落
明显多于Ashby培养基。以一年生文冠果根系的内
生菌悬浮液100 μL涂板, 在YMA培养基上的菌落
数大约为150个/皿, 根据菌落的外观形态可以分成
4组, 在Ashby培养基上的菌落数大约为130个/皿,
根据菌落的外观形态可以分成3组; 以二年生文冠
果的根系内生菌悬浮液100 μL涂板, 在YMA培养
基上的菌落数大约为120个/皿, 根据菌落的外观形
态可以分成4组, 在Ashby培养基上的菌落数大约为
100个/皿, 根据菌落的外观形态可以分成3组。不同
培养基上菌落数量和种类的差别, 很可能是因为
YMA培养基中含有少量的氮源, 更适宜细菌的生
长繁殖, 而Ashby为无氮培养基, 限制了很多没有
自身固氮作用的微生物的生长。同时, 根据培养的
结果还可以看出, 一年生文冠果根系的内生菌数量
和种类均多于二年生文冠果。
为了对分离出的文冠果内生菌进行分子鉴定,
根据代表性原则, 我们挑选培养皿上的菌落划线,
进行纯化分离, 从一年生文冠果根系材料中挑选出
5个菌株, 从二年生文冠果根系材料中挑选出2个菌
株, 作进一步的分子鉴定(表1)。
2.2 文冠果根系内生菌DNA的提取
本试验内生菌DNA的提取根据Posno等(1991)
的方法改进而得。取2 mL过夜培养的菌液离心收集
菌体(12 000 r·min–1, 2 min, HERMLE Z 233 MK-2,
Germany)后, 用TE buffer重新悬浮、洗涤。裂解液
842 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 839–844
www.plant-ecology.com
表1 文冠果内生菌菌株编号
Table 1 The serial number of endophyte strains isolated from
the root of Xanthoceras sorbifolia
菌株编号
Strain number
苗龄
Seedling age
培养基
Culture medium
1 (Xs1Y-1) 一年生 One-year-old YMA
2 (Xs1Y-2) 一年生 One-year-old YMA
3 (Xs1Y-3) 一年生 One-year-old YMA
4 (Xs1A-1) 一年生 One-year-old Ashby
5 (Xs1A-2) 一年生 One-year-old Ashby
6 (Xs2Y-1) 二年生 Two-year-old YMA
7 (Xs2A-1) 二年生 Two-year-old Ashby
图1 根系内生菌DNA的提取。
Fig. 1 Genomic DNA extraction from different strains of iso-
lated root endophytes.
图2 文冠果根系内生菌16S rDNA通用引物PCR产物的电
泳结果。泳道1–7分别为: Xs1Y-1、Xs1Y-2、Xs1Y-3、Xs1A-1、
Xs1A-2、Xs2Y-1和Xs2Y-2。
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products
of root endophytes of Xanthoceras sorbifolia with universal
bacterial primers. Lane 1–7 were strains of Xs1Y-1, Xs1Y-2,
Xs1Y-3, Xs1A-1, Xs1A-2, Xs2Y-1, and Xs2Y-2, respectively.
为12% v·v–1 PEG-20 000, 10 mmol·L–1 Tris-HCl (pH
8.0), 0.01 mol·L–1 EDTA, 在37 ℃水浴下破壁2 h,
再加入50 μg·mL–1 RNase A 10 μL, 去除RNA。之后
用酚 :氯仿 :异戊醇 (25:24:1)抽提后 , 异丙醇沉淀
DNA, 用70%乙醇洗涤沉淀并晾干后, 加入20 μL
ddH2O溶解。DNA提取的电泳结果如图1, DNA具有
较好的完整性, 达到PCR分析的质量和浓度要求。
2.3 根系内生菌16S rDNA通用引物的PCR扩增与
测序比对
采用细菌16S rDNA通用引物序列分别对DNA
样品进行PCR扩增, 都获得了一条大约为1 500 bp
的PCR产物 , 为编码 16S-RNA的DNA序列片段
(图2)。
通过对文冠果根系内生菌的PCR扩增产物进行
测序和Blast比对分析, 以序列匹配度97%为最低指
标, 按照匹配度最高的原则, 初步鉴定所得各菌株
所在的属和对应的种。在田间一年生文冠果的根系
内生菌株的序列比对中, 得分高排列靠前的属为成
团肠杆菌(E. agglomerans)、根癌土壤杆菌(Agrobact-
erium tumefaciens)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)
和产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)等, 而在田间二
年生文冠果的根系内生菌株的序列比对中, 则主要
是一些假单胞菌属(Pseudomonas)排位比较靠前(表
2)。分别从YMA和Ashby培养基上分离的代表性菌
株中各包括了一株根癌土壤杆菌, 两者序列比对的
结果, 相似性超过99%, 在平板上接种及显微观察
的结果也表明两者的菌落和细菌形态一致。
2.4 文冠果根系内生菌的固氮活性
文冠果根系内生菌固氮酶活性的测定结果如
表3, 从中可以看出6个菌株的固氮酶活性都较低,
其中16S rDNA片段的测序初步判定为产黄假单胞
菌(P. synxantha)的菌株6固氮酶活性为0。在7个菌株
中分子鉴定初步判断为产酸克雷伯菌菌株的固氮
活性显著高于其他菌株, 达到9.688 nmol·mg–1·h–1,
作为优选菌株进入下一阶段的文冠果根系回接试
验, 评价其作为菌肥的潜力。
3 讨论
目前, 在各种农作物及果树等经济植物中发现
的内生细菌已超过120种(隶属于54个属)。这些内生
细菌大多为土壤微生物, 其中假单胞菌属、芽胞杆
菌属(Bacillius)、肠杆菌属以及土壤杆菌属最为常见
(姜怡等, 2005)。本研究从文冠果根系中分离得到的
细菌通过16S rDNA通用序列比对, 初步判定为假
单胞菌属和土壤杆菌属, 同时还可能有成团泛菌和
产酸克雷伯菌等。
一般认为, 植物内生菌作为植物微生态系统中
的天然组成部分, 可以通过自身的代谢产物或借助
张烨等: 文冠果一、二年生植株根系内生菌的分离、鉴定和固氮活性 843
doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.009
表2 文冠果根系内生菌16S rDNA通用引物PCR扩增序列的Blast比对分析
Table 2 The blast results of the 16S rDNA sequence amplified with universal bacterial primers of endophytes from Xanthoceras sor-
bifolia roots
表3 文冠果根系内生菌代表性菌株的固氮酶活性
Table 3 Nitrogenase activity of the selected strains of
endophytes from Xanthoceras sorbifolia roots
菌株编号
Strain number
固氮酶活
Nitrogenase acticity
(nmol·mg–1·h–1)
标准误
Standard error
Xs1Y-1 0.370 0.118
Xs1Y-2 0.237 0.009
Xs1Y-3 0.484 0.068
Xs1A-1 9.688 1.315
Xs1A-2 0.622 0.060
Xs2Y-1 0.000 0.000
Xs2A-1 0.591 0.038
信号传导作用对宿主产生影响, 可促进宿主植物对
环境的适应 , 加强生态系统的平衡 (石晶盈等 ,
2006)。冯永君(2001)的研究表明水稻的内生成团泛
菌能发挥固氮作用。本研究从文冠果的根系分离得
到的内生菌均是在无氮或少氮培养基上培养得到
的, 很有可能与固氮作用有关, 因此我们又进一步
进行了固氮酶活性的测定。结果表明, 在分离的7
个菌株中, 除一个菌株的固氮酶活性为0, 一个菌
株的固氮酶活性较高 , 超过了圆褐固氮菌菌株
ACCC11103外, 其他5个菌株都有较低的固氮酶活
性。孙建光等(2009)的研究结果表明, 接种具有固氮
活性的菌株的实际效果与固氮酶活性并不直接相
关, 还和菌株的适应能力有很大的关系。因此, 进
一步的回接试验对从中筛选优良菌株具有显著的
意义。
本研究中, 从田间一年生与二年生文冠果的根
系分离到的内生菌存在明显差异, 无论是数量还是
种类, 一年生文冠果根系的内生菌均多于二年生文
冠果。这可能是因为一年生文冠果的根系相对幼嫩,
更利于内生菌的侵染与生存。此外, 文冠果根系中
分离得到的内生菌种类, 与近缘植物龙眼果实中的
内生菌也有很大不同(朱育菁等, 2008)。在分离到的
内生菌中, 外观白色半透明且黏稠的菌落占所有菌
落的一半以上。根据Blast的比对结果和菌落外观推
断, 很可能是根癌土壤杆菌。在培养基上还观察到
一些类似噬菌斑的形态, 造成这些现象的原因需要
进一步探究。内生菌具有多种生物学功能, 能产生
多种生物活性物质, 特别是在寻找新的抗菌、抗癌、
抗植物病虫害物质等方面, 植物内生菌提供了一种
新的生物资源(付洁等, 2006)。对文冠果内生菌的种
类及利用价值进行深入探索, 对提高文冠果作为生
物质材料和绿化树种的栽培水平和栽培效率都具
有重要的意义。
致谢 国家高技术研究发展计划(863) (2008AA-
10Z310)支持项目。
参考文献
Feng YJ (冯永君) (2001). Mechanisms of Infection and Colo-
nization of the Dominant Endophyte Pantoea agglomerans
ys19 on Host Rice Plant (水稻内生优势成团泛菌YS19对
宿主侵染和定殖机制的研究). PhD dissertation, Chinese
Academy of Agricultural Science, Beijing. (in Chinese
with English abstract)
Fu J (付洁), Hou J (侯军), Xie FQ (谢芳芹), Ji YK (纪永康)
(2006). Review of advances research on pesticide activity
of plant endophytes．Shaanxi Journal of Agricultural
Sciences (陕西农业科学), (3), 66–68. (in Chinese)
Jiang Y (姜怡), Yang Y (杨颖), Chen HH (陈华红), Li WJ (李
文均), Xu LH (徐丽华), Liu ZH (刘志恒) (2005)．The
resource of plant endophytes. Microbiology (微生物学通
报), 32(6), 146–147. (in Chinese)
Kloepper JW, Beauchamp CJ (1992). A review of issues
菌株编号 Strain number 可能的属 Possible genus 可能的种 Possible species 相似性 Similarity E-Value
1 (Xs1Y-1) 肠杆菌属 Enterobacter 成团肠杆菌 E. agglomerans 97% 0.0
2 (Xs1Y-2) 土壤杆菌属 Agrobacterium 根癌土壤杆菌 A. tumefaciens 98% 0.0
3 (Xs1Y-3) 泛菌属 Pantoea 成团泛菌 P. agglomerans 98% 0.0
4 (Xs1A-1) 克雷伯氏菌属 Klebsiella 产酸克雷伯菌 K. oxytoca 97% 0.0
5 (Xs1A-2) 土壤杆菌属 Agrobacterium 根癌土壤杆菌 A. tumefaciens 97% 0.0
6 (Xs2Y-1) 假单胞菌属 Pseudomonas 产黄假单胞菌 P. synxantha 97% 0.0
7 (Xs2A-1) 假单胞菌属 Pseudomonas 98% 0.0
844 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 839–844
www.plant-ecology.com
related to measuring colonization of plant roots by bacte-
ria. Canadian Journal of Microbiology, 38, 1219–1231.
Li BJ (李倍金), Luo M (罗明), Zhou J (周俊), Kong DJ (孔德
江), Zhang TM (张铁明) (2008). Isolation of endophytic
diazotrophic bacteria from several gramineae grasses and
determination of their nitrogenase activity. Acta Pratacul-
turae Sinica (草业学报), 17(5), 37–42. (in Chinese with
English abstract)
Medlin L, Elwood HJ, Stickel S, Sogin ML (1988). The char-
acterization of enzymatically amplified eukaryotic
16S-like rRNA-coding regions. Gene, 71, 491–499.
Posno M, Leer RJ, van Luijk N, van Giezen MJ, Heuvelmans
PT, Lokman BC, Pouwels PH (1991). Incompatibility of
Lactobacillus vectors with replicons derived from small
cryptic Lactobacillus plasmids and segregational instabil-
ity of the introduced vectors. Applied And Environmental
Microbiology, 57, 1822–1828.
Sturz AV, Christie BR (1996). Endophytic bacteria of red clo-
ver as agents of allelopathic clover-maize syndromes. Soil
Biology and Biochemistry, 28, 583–588.
Shi JY (石晶盈), Chen WX (陈维信), Liu AY (刘爱媛)
(2006). Advances in the study of endophytes and their ef-
fects on control of plant diseases. Acta Ecologica Sinica
(生态学报), 26, 2395–2401. (in Chinese with English ab-
stract)
Sun JG (孙建光), Zhang YC (张燕春), Xu J (徐晶), Hu HY
(胡海燕) (2009). Isolation and biological characteristic
investigation on efficient nitrogen-fixing bacilli. Scientia
Agricultura Sinica (中国农业科学), 42, 2043–2051. (in
Chinese with English abstract)
Vincent JM (1970). A Manual for the Practical Study of
Root-Nodule Bacteria. IBP Handbook 15. Oxford Black-
well, Oxford, UK.
Xue PS (薛培生), Shen GN (沈广宁), Zhao F (赵峰), Sun Y
(孙岩), Yang XH (杨兴华) (2007). The cultivation and
development of Xanthoceras sorbifolia. Deciduous
Fruits (落叶果树), 4, 19–22. (in Chinese)
Zang GZ (臧国忠), Chen SW (陈尚武), Zhang W (张文), Ma
HQ (马会勤) (2008). Synchronical somatic embryogene-
sis and plant regeneration of Xanthoceras sorbifolia.
Journal of Northwest Forestry University (西北林学院学
报), 23(5), 91–94. (in Chinese with English abstract)
Zhu YJ (朱育菁), Wang QH (王秋红), Chen L (陈璐), Lan JL
(蓝江林), Lin KM (林抗美), Liu B (刘波) (2008). Isola-
tion and fatty-acid identification of endophytes in longan
fruits. Subtropical Plant Science (亚热带植物科学 ),
37(4), 22–25. (in Chinese with English abstract)
Zou WX (邹文欣), Tan RX (谭仁祥) (1999). The biodiversity
of plant endophytic bacteria and their secondary metabo-
lites with their potential application. In: Li CS (李承森)
ed. The Proceedings of Plant Science (植物科学进展),
Vol. 2. Higher Education Press, Beijing. 183–190. (in
Chinese)
责任编委: 高玉葆 实习编辑: 黄祥忠