全 文 ：第 11卷 第 3期
2 0 0 3年 7月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．11 No．3
July， 2003
高山红景天毛状根培养的研究
徐 洪伟 周 晓馥
(吉林师范大学基因工程研究所 四平 136000)
摘 要 建 立 了高 山红 景 天毛 状 根培 养 系 统 ，研 究表 明红 景 天子 叶、子 叶节 能 被 A4、R1601、ATCC15834感 染产 生
毛状根，PCR检测在 500bp处有 rolC基 因存在。以 1／2M 液体培养基 、散射光 、温度为 20"12左右 、pH值 4．5～4．8
间毛 状根 生 长为 佳 。对 C源 要求 不 高 ，N 源 Nil, ：N0 为 1：1时毛 状根 生 长较 好且 红 景天 甙含 量 增加 。
关键 词 高 山红 景 天 毛状 根 红 景 天 甙 Ri质粒
Research of the hairy—root of Rhodiola sachalinensis A．Bor．XU HongoW ei，
．
ZHOU Xiao—Fu(Institute of Gene Techn—
ology，Jilin Normal University，Siping 136000)，CJEA，2003，11(3)：45～47
Abstract The hairy—root culture system of Rhod iola sachalinensis A．Bor was established in this paper．The results show
that the hairy—ro t can be arisen at cotyledon and cotyledonary node infected by A4，R1601，ATCC15834 agrobacterium
Ri—plasmid．There is about 500bp—rolC gene detected from the hairy-ro t culture by PCR amplifying．The hairy—ro t
grows well at 1／2Mso liquid medium，scatter light，20℃ and pH 4．5～4．8．In the condition of the lower nitrogen sub—
stance．such as NI-I, ：N03一 equal to 1：1，the hairy-ro t grows well and the content of salidrls—ide has been increased．
Key words Rhod iola sachalinensis A．Bor，Hairy-ro t，Salidrls—ide，Ri—plasmid
高 山红景天 (Rhodiola sachalinensis A．Bor)又名 库 页红 景天 ，为景 天科 红景 天 属 (Rhodiola L．)多 年生
双子 叶草本植物 ，系长 白山珍稀 药用植物之 一 ，中医中具有“固本扶正 ”，抗 缺氧 ，抗 寒冷 ，抗 疲劳 ，抗 微波辐射
等显著功能⋯，有“适应原”的作用。由于高山红景天在医药工业方面的开发，野生植物大量被采挖，资源 日
趋枯竭 ，目前 当地政府 已严 禁采挖 。 自 80年代初 我 国已开始红 景天人 工引种 栽培 的研 究 ，由于高 山红景 天
适应高寒、干燥、高海拔的生长环境 ，不耐高温、潮湿气候以及易发病等原因，大面积人工栽培仍未获得成功 ，
因此 建立毛状 根培养系统 ，大量培养 毛状根代替野生 药用红景天具 有重要 意义 。毛状根培养是 近 10年发展
起来的一种新的培养系统 ，自 1977年 Acketmann C． 首先成功地用发根农杆菌转化高等植物以来 ，迄今 已
有 100多种植 物建 立 了培养 系统 。 由于 毛状 根具有生长速 度快 、分 枝多 、弱 向地性 ，处于器官 化水平 ，激素 自
养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物合成能力，因此大量培养毛状根替代野生资源，可促进中
药现代化 发展 。
1 试验材料与方法
发根农杆 菌 的处 理是将 中 国科学 院遗传 与发 育 生物 学研 究 所 提供 的 3种发 根 农杆 菌 R1601、
ATCC15834和 A4接 种在 YEB固体 培 养基 上划 线 培 养 ，于 27℃ 下 活化 3次 ，挑取 平 板 上 单 菌落 ，接 种 在
25mL YEB液 体培养基 ，于 27℃ 、4000r／min黑 暗下震 荡培养 ，继 代 3次后 农杆 菌 OD㈣ 为 0．2～0．3时用 于
感染外植体。植物供试材料取 自长白山海拔高度 1700～2500m高山红景天种子 ，用 自来水洗净，于 75％酒
精 中浸泡 3min后 ，再用 2g／kg HgC1 消毒 12min接种在无激素的 MS培养基上萌发培养，待 15d无菌苗长出
真叶后，取子叶和子叶节作外植体 ，接种在 MS附加 6一BA的培养基上预培养 2～3d，待边缘略有愈伤现象时
用于浸染。外 植 体 的转 化和 除菌 即将 上 述预 培养 的外植 体 分别 浸 入处 于 对 数期 的农杆 菌 R1601、
ATCC15834、A4菌液中，于黑暗中共培养 2h，取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于 M 培养基上培养 30h
后 ，移 至分别 含有 乙酰丁香酮和烟 草浸 出液 的头孢霉 素 300mg／L 1／2MS培 养基 上 ，于 25℃下 散射 弱光 照培
养 ，并 以未经感染 的高 山红景 天子叶和子 叶节 为对照 。将感 染 后外植 体长 出 的毛状 根 剪下 移至新 的含 抗 生
*吉林省科技厅项 目(20010541)资助
收稿 日期 ：2002—10—30 改回日期 ：2002—11—29
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中 国 生 态 农 业 学 报 第 11卷
素培养基上 ，每 7d转接 1次，直至除菌完成后再移至不含抗生素的 MS0培养基上培养。毛状根优质株系的
筛选 即挑选 M S(1培养基上 的毛状根 ，将分 枝多 的毛状 根 剪下长 3cm 左右 ，移 入 1／2MS0培养 液 中 ，每 50mL
三角烧瓶 中装培养液 35mL接入 1根毛状根 25d后观察其生长状况，并挑选生长旺盛的用于继代培养。
毛状根的 PCR检测以试管苗正常根做阴性对照，Ri质粒为阳性对照。rolC基因的引物序列(宝生物合
成)为 引 物 I 5 一GATATATGCCAAATTTACACTAG一3 ，引 物 Ⅱ 5 一GTTAACAAAGTAGGAAACAGG一3 ，
PCR反应总体 系为 50 L。Taq Mix(购 自宝生物 )25rtL，引物 I 2tzL(20pmo1)；引物 lI 2tzL(20pmo1)；模板 5 L
(1OOng)；去离子无菌水为 16t~L。在 PCR仪(UNOII，Biometra)中进行反应 ，反应程序为 94℃ 、45s，45℃、
30s，72℃ 、45s，共 30个循 环 ，72℃延长 lOmin。毛状根生长 曲线 的测定挑 选生长 旺盛 的株 系 MATCC15834，
接入 1／2M 培养液 中。每 50mL三角烧瓶 中装培养液 35mL接入 毛状 根鲜 物质量 0．390g(干物质量
0．041g)，共 30瓶 ，每 5d测定 1次鲜物质量和干物质量 ，以平均重量为指标绘制生长曲线。鲜物质量系用布
氏漏斗抽 滤至无水滴 下时测定 ，干 物质 量 系 60℃烘 干后 测得 。配置 1／2MS0、 、WSo、GB 、MSo5种培 养液
培养 毛 状 根 ，25d后 称 重 ，测 定 不 同 培 养 液 对 毛 状 根 生 长 的影 响 ，方 法 同上 。 在 散 射 光 1000xl、1200xl、
1400xl、1600xl和 1800xl 5种照度 培养下培养毛状 根 ，25d后称 重 ，测 定 不 同温 度 和强度 光照 对 毛状 根生 长
的影响 ，方 法 同上 。配 置 pH值分 别 为 4．3、4．5、5．0、5．5、6．0、6．5和 7．0等 6种 1／2 MSo 培养 基培 养 毛状
根，25d后称重，测定不同 pH值对毛状根生长的影响，方法同上。以 MATCC15834株系培养在 1／2M 液
体培养基 中附加 蔗糖 、果糖 和葡 萄糖 ，浓度 分别 为 0．1lmol／L、0．13mol／L、0．15mol／L、0．17mo1／L、0．19mol／L
和 0．21mo1／L，25d后称重 ，测定 C源对毛状根 生长的影 响 ，方法 同上 。
以 MATCC15834株 系 培养 在 1／2M 液 体培 养 基 中，总 N浓 度 分别 为 20retool／L、40mmo1]L、50mmol／L、
60mmol／L、70mmol／L和 80mmol／L，25d后称重 ，测 定 N源对毛状根 生长的影 响 ，方法 同上。
2 结果与分析
毛状根 的诱导 和产生 。子 叶和子叶节经 3种发根农杆菌感染 15d后 陆续有 毛状根长 出 ，并具 白色根毛 ，
表 1 乙酰丁香酮与烟草浸出液对出根率的影响 向上 、贴 壁 向上 或 沿 培 养 基 平 长 ，失 去 向 地
Tab．1 The effect of acetylsyringone and tobacco extraction
culture on the rate of hairy roots growth
菌 种 出根 数／条 Amount of hairy roots growth
Species 对 照 乙酰丁 香酮 烟 草浸 出液
*出根数 为 3O个 外植体 出根数 的总 和 。
性 。未经感染 的子 叶 和子 叶节 几乎 不 出根 ，
偶有 1、2个 小 根并 向下长 入 培 养 基 中 ，3种
农 杆 菌 以 ATCC15834感 染 效 率 最 高 ，感 染
15d后 出根 状 况 见 表 1。在 1／2M 培 养 液
中培养 25d后测 量各 瓶 中毛 状根 生长 状 况 ，
以 MATCC15834株 系 生 长 最 佳 ，以后 的测
量讨论均 以其为标准 。
毛状 根 的 PCR检测表 明 ，发 根农 杆菌 浸
染 高山红景天 叶片后 ，Ri质粒 的 T—DNA上 rolC基 因也 随之整合 进去 ，以 rolC基 因为 杂交探 针进 行 PCR反
应检测浸染产生的毛状根中 rolC基因结果表明，在 500bp的区带处有 rolC基 因存在，证明毛状根为发根农
杆 菌浸染所产 生 。生长速率测 定表 明 ，毛状根生长量 随时间快速增 长 ，28d时达到最大 ，之后毛状 根的生长
量随时 间延长而下 降(见
图 1)。
外界 条件 对 毛状 根 生
长 的 影 响试 验 结 果 表 明 ，
不 同培养 液对 毛状 根生 长
的影 响 以 1／2M 培 养 液
为最 佳 (见 图 2)。不 同温
度 和强度 光照 对 毛 状 根生
长 的 影 响 以 20℃ 、1000xl
条 件 下 生 长 表 现 最 佳 (见
图 3)。不 同 pH 值 对 毛状
根 生长 的影 响 以液体 培 养
10 20 30 40
时间／d
图 1 毛状 根 生长 曲线
Fig．1 The growth curve of hairy ro ts
岫I
1／2MSo Bs Wso GBs Mso
培养基
图 2 不 同培 养液 对 毛状 根生 长量 的 影响
Fig．2 The effect of different cultures in
the growth degree of hairy ro ts
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第 3期 徐洪伟等 ：高 山红景天毛状根培养的研究 47
基 pH 值 为 4．5～5．0时 生
长表现最佳(见图 4)。N源
对 毛 状 根 生 长 的 影 响 以
NH 和 NO 一为 N 源 ，当总
N浓度 为 80retool／L生 长量
达到最 高且 生 长最 佳 (见 图
5)。分别 以蔗糖、果糖和葡
萄糖 为 C 源对 毛状 根生 长
研究表 明 ，不 同 C源 对 毛状
根生 长影 响 较小 ，当 蔗糖 浓
度 为 0．17tool／L 时 生 长 量
达到最高 (见 图 6)。
蛔{
删
1000 1200 1400 1600 1800
光照 强度／xl
图 3 不 同光照 强度 对 毛状 根 生长 的影 响
Fig．3 The effect of different intensities
of ilumination in hairy rOOtS growth
； 匡
i
，
口 鲜 ! 牙质量
- ．i
；
_ ．i _． ．i -
一 千 质量
I；
■． 一．；
20 30 40 50 60 70 80
N源浓度／mmol·L
图 5 不 同 N源对 毛状 根 生长 的 影响
Fig．5 The efect of different nitrogen sources
in the growth of hairy roots
删
l 口 ： a鲜物质量 ●干；匿
；
；
·．i
；
；
-． 1．； _．
4 3 4，5 5 0 5．5 6 0 6 5 7．0
pH值
图 4 不 同 pH 值对 毛 状根 生 长的 影 响
Fig．4 The effect of different pH values in
the growth of hairy roots
0 11 0 I3 0 I 5 0 I7 0 l9 0
．2
C源浓度hnol·L‘。
图 6 不 同 C源 对 毛状 根生 长 的影 响
Fig．6 The effect of different carbanyl sources in
the growth of hairy rots
3 小 结 与讨 论
在高 山红景天 毛状根诱导过程 中 以 Ri质粒 ATCC15834浸染力 最强 ，当添加 乙酰丁香 酮和 烟草 浸 出液
时毛状根诱导率提高，出根数增加 ，生长较好 ，子叶较子叶节易被感染。由于 Ri质粒的浸染 T—DNA片段整
合到植物体中，rolC基因也整合进去，因此诱导产生的毛状根中含有 rolC基因，经 PCR反应检测在 500bp的
区带处有 rolC基因存在。由于毛状根是单细胞克隆产生 ，不同来源的毛状根经过筛选得到生长快、次生代
谢物生长稳定 的毛状 根 株 系 。研究 表 明 MATCC15834株 系较 好 ，毛状 根 培 养过 程 中以散 射 光 、温度 为
20℃左右 、pH4．5～4．8间为佳 。但 当 pH值 由 3．0升至 4．5时培养液 中红景天甙却猛增至 70．1lg／kg，这与
Sanez-Carbonel L．A．等 ¨研 究 结 果 相一 致。c源 对 毛状 根 生 长影 响 较 小，蔗糖 浓 度 为 30g／kg、N 源
NH ：NO 一为1：1、总 N浓度为 80mmol／L时对毛状根生长最佳 。光强以 800～1000xl有利于毛状根生
长 ，光照增强时其生长虽减弱，但干物质量却略有增加。当加入 0．15mg／kg的 NAA时促进毛状根生长。研
究表 明 ，在红景天毛状根培 养过程 中给予 一定低温 (14℃左右 )的处理 红景天甙含量 有所提高 ，毛状根生长也
有利 ，这可能与红景 天在 恶劣环境 中生 长有关 。
参 考 文 献
1 吴维春等．长 白山珍贵药用植物高山红景天 长春：吉林科学技术出版社，1987
2 韩爱明，许建峰，方晓丹等．影响高山红景天细胞悬浮培养中细胞生长和红景天甙积累的几个因素．植物生理学通讯 ，1997，1(33)：33
3 王关林 ，方宏筠主编．植物基因工程原理与技术[M]．北京 ：科学出版社 ，1998．237～238
4 Sanez-Carbonell L．A．，M aldonado-Mendoza O ，Moreno-Valenzula R．，et a1．Efleet of medium pH on the release of secondary metabolitum ．
eatham thus roseus，and tagetes patula cultured in vitro．Appl Biochem Bioteehnol，1993，38：257～ 267
5 Aekermann C．Pflanzen aus agmbacterium rhizogenes-tu—moren au Nicotiana tabacum．Plant Science Letters．1977，8：23～28
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