全 文 ：第 12卷 第 3期
2 0 0 4年 7月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco-Agriculture
V01．12 No．3
July， 2004
黑曲霉固体发酵生产纤维素酶培养基构成优化研究
靖德兵 李培军 孙铁珩 许思明 姚晓福
(中国科学院沈阳应用生态研究所 沈阳 110016)(抚顺市林业种苗站 抚顺 113006)
摘 要 研究结果表明应用双温度培养法进行黑曲霉固体发酵生产纤维素酶时，在自然补给氧气、培养基 pH值约
6．5并保持环境湿度约60％条件下，葡萄糖对滤纸酶活力有促进作用；葡萄糖、麸皮、(N}I4) SO4、水分适宜作为固
体培养基基本成分；表面活性剂吐温80对纤维素酶活力促进效果并不明显。
关键词 黑曲霉 固体发酵 滤纸酶 羧 甲基纤维素酶 棉花酶 葡萄糖苷酶
Study on the optimization of solid fermentation for the production of celulase from Aslmgilus niger．JING De-Bing，
LI Pei—Jun，SUN Tie-Heng，XU Si—Ming(Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang
110016)，YAOXiao-Fu(ForestrySeedling Station，FushunCity，Fushun 113006)，CJEA，2004，12(3)：172～174
Abstract The experiment shows that in celulase production from Aslergillus niger by solid fermentation with two-tern—
peratures culturing method，the dextrose ca』1 improve the activity of the filter paper lyase with natural aeration，natural
substrate pH(about 6．5)and an environmental humidity of 60％．Furthermore，the dextrose，wheat bran，(NH,)2SO4
and water&re proper ingredients of solid substrate while the performance of Tween80 is poor at improving the enzyme ac—
tivity in solid substrate．
Key wolds Aspergillus niger，Solid ferm entation，Filter paper lyase，CMCase，Cotton lyase，p—glumsidase
复合纤维素酶多由木霉菌和曲霉菌产生，黑曲霉不产生毒素，现已被许多国家批准作为食品用酶制剂生
产菌，国外已实现黑曲霉酶制剂商品的工业化生产【1]。利用黑曲霉生产复合纤维素酶要求培养基含不同原
料来诱导酶的产生，以提供必需的N、C源等营养条件。但若其成分过多且用料复杂，不仅增加成本、降低单
位酶活力，还增加其工业化生产复杂程度，使纤维素酶在纤维素资源转化及畜牧业中的应用受限制 』。我国
相关研究起步较晚，且投资有限因而适宜开发基于固体发酵的酶制剂工业化生产体系。本研究选择成本低、
来源丰富的原料，通过均匀实验精选产酶固体培养基各种成分，为其工业化生产提供理论依据。
1 试验材料与方法
供试菌株为黑曲霉(Aspergilus niger)“A2．26”菌株(由中国科学院沈阳应用生态研究所提供)，将该黑
曲霉接入装有 PDA培养基(马铃薯 20％，葡萄糖 2％，琼脂 2％)的试管中，于 30℃静置 3～5d进行斜面培
养，之后将斜面培养基上孢子用无菌水淋洗制成悬浮液，并接入装有IOOmLPDY培养基(马铃薯20％，葡萄
表1 均匀实验因素水平设计 糖 2％，酵母膏 1％)的摇瓶中，于 28℃、
Tab．1 Design of factors and levels of uniform experiment 120 150r／min~荡培养 2～3d。产酶固
水 平 酵母膏／g葡萄糖／g 玉米秸／g 水分／mE 吐温80／g 麸皮／g(NH,)2SO4／g
Level Yeast Dextrose Cornstalk Water Tween 80 W heat
extract bran
0．0 0．0 0 36．4 0．00
0．3 0．4 4 40．0 0．01
0．6 0．8 8 44．4 0．02
0．9 1．2 12 50．0 0．03
1．2 1．6 16 57．1 0．04
0．2
0．4
0．6
0．8
1．0
体培养基成分配比采用均匀设计 U， (5 )
(7因素，每因素 5水平，共 15个处理)，
pH值约 6．5(见表 1和表 2)。将上述培
养基高压灭菌后以 2mL摇瓶培养基／固
体培养基处理的量接种，再置于双温度培
养(前 30h恒温 30℃，后续 72h恒 温
23℃ 2 )、自然补给()2并保持环境湿度
* 国家计委西部开发高新技术产业化项 目(计高技 2001 1867)和中国科学院知识创新重要方向性项 目(KZCX-SW-416、S(、XzY0108)及
沈阳环境工程重点实验室基金共同资助
**系作者在中国科学院研究生院学习期间完成
收稿 日期：2003—09—30 改回日期：2003—10—31
第 3期 靖德兵等：黑曲霉固体发酵生产纤维素酶培养基构成优化研究 173
约 60％的条件下进行黑曲霉产酶固体发酵。取发酵成熟曲2g加 20mL蒸馏水，于 40℃、130～150r／rain振
荡浸提 1h后，再用滤纸过滤，于 3000r／min离心 15min即制得粗酶液，置 4℃保存备用。
纤维素酶活力测定时先制作标准葡萄糖曲线 ]，再用 DNS法测定各项酶活力 ]。棉花酶活力即于
50℃、pH值 4．8、恒温 24h反应条件下，以每24h催化脱脂棉水解形成 lmg葡萄糖的酶量为 1个单位(即U=
lmg葡萄糖／d)。滤纸酶活力即于50℃、pH值 4．8、恒温 1h反应条件下，以每 1h催化 Wl~trnan 1号滤纸水解形
成 lmg葡萄糖的酶量为1个单位(即U=lmg葡萄糖／h，下同)。羧甲基纤维素酶活力即于50℃、pH值 4．8、恒
温30min反应条件下，以每 lh催化CMC-Na水解形成lmg葡萄糖的酶量为1个单位(U)。 葡萄糖苷酶活力即于
50"C、pH值4．8、恒温301Tlin反应条件下，以每 1h催化水杨素水解形成 lmg葡萄糖的酶量为 1个单位(U)。
表2 黑曲霉固体发酵产酶均匀实验
Tab．2 Uniform experiment of celulase production by solid fermentation from Aspergillus niger
*单位发酵干曲酶活力 ，Fl司。
2 结果与分析
2．1 酶活力测定与数据标准化处理
酶活力测定见表 2。对表2数据进行标准化处理，并利用 sPSS中 Regression过程进行回归分析，得出
各酶活力回归方程，滤纸酶(F)为：
F =12．084—6．651lz1—3．313x1lz2—1．682x1lz4—2．159x2lz7—8．757x3+6．890x3 + (1)
5。619x4 一1．836x4．27十1．392x5．276—3．385x6 (R =0．998，0．000)
羧甲基纤维素酶(C)为：
C=101．189—34．861lz1+40．780x1 +31．570x1 lz 3—14．424x1 s一44．637x 3一 (2)
32．044x3lz4+6．265x4—13．428x s (R =0．997，0．ooo)
棉花酶(L)为：
L =25．337—4．987x1+17．710x1 一8．176x2+3．350x2lz3—18．568x3+7．231x3 + (3)
6．670x3lzs+3．698x4—8．500x6+12．710x7 (R =0．998，0．ooo)
口一葡萄糖苷酶(G)为：
G =54．656+18．742x1 一6．153x2lz4—43．873x3+12．789x4 +31．451x5 一 (4)
37．912x6—39．467x6lz7+8．869x7 (R =0．997，0．000)
羧甲基纤维素酶、棉花酶和 一葡萄糖苷酶为纤维素酶主要成分，滤纸酶活力则体现三者间协同作用。因
此要求单一酶活力高且各酶活力之和最大，有利于纤维素降解。鉴于各酶活力平均值相差较大，因此将各酶
活力均值的倒数作为权重，纤维素酶总活力(E)可表达为：
174 中 国 生 态 农 业 学 报 第 l2卷
E =F／24．32+C／126．41+L／60．17+G／124．20=2．1586—0．6321x1+0．7678x1 ～0．1362z z，+ (5)
0．2491xlz3—0．0692x1z4—0．1141x1z5—0．1359x2+0．0557x2z3—0．0495x2z4—
0．0888x2z7-1．3750x3+0．4035x3 一0．2535x3z4+0．1109x3 5+0．111lx4+0．3340x4 一
0．0755x4z7+ 0．1470x5 + 0．0572x5z6—0．5847x6—0．3178x6z7+0．2826x7
式(1)～(5)中，z。=(酵母膏 一0．6)／0．439155，z：=(葡萄糖 一0．8)／0．58554，z =(玉米秸 一8)／
5．85540，z =(水 一45．58)／7．592967，z5=(吐温 80—0．02)／0．014639，z =(麸皮 一8)／2．92770，z =
l(NH4 2SO4—0．6]／0．292770。
2．2 方程求解
鉴于滤纸酶活力的协同作用代表性，对纤维素酶总活力和滤纸酶活力进行约束规划求解，其值极大时培
养基各成分取值见表 3。由表3可知用上述培养基进行黑曲霉固体发酵产酶时，酵母膏对滤纸酶和纤维素
表3 纤维素酶活力值极大时培养基各成分对应水平 酶总活力无促进作用 ]，可能
Tab．3 Coresponding levels of substrate ingredients While celulase activities reach m3ximum
成 分 酵母膏 葡萄糖 玉米秸 水分／mL 吐温80／g 麸皮／g (N )2804／g预期极值
Constituents Yeast Dextrose Co mstalk W ater Tween 80 W heat Maximum
extract bran
下 限 0 0 0 36．4 0 4 0．2
上 限 1．2 1．6 16 57．1 0．04 12 1．0
纤维素酶 0．0 0．0 0 57．1 0．00 4 1．0 11．6
滤 纸 酶 0．0 1．6 0 57．1 0 00 4 0．2 83．7
是 因 培 养 基 中 麸 皮 和
(NH4 2SO4可满足黑曲霉固
体发酵产酶时对 N源的需求
所致_2 j，故无需 外加酵母
膏。葡萄糖往往被认为对纤
维素酶合成具有抑制和阻遏
效应[7]，本研究表明葡萄糖对
滤纸酶有促进作用，说明固体发酵初期葡萄糖对黑曲霉菌株生长有促进作用，是黑曲霉理想的产酶 C源之
一
8]
，可作为固体培养基必需成分。玉米秸秆粉未体现出对纤维素酶的诱导作用，可能是因麸皮中已含足够
纤维素的缘故所致。表面活性剂吐温 80的作用是改变细胞质膜透性或选择性，加速酶的释放，从而促进酶
活力的提高[6]，但另有研究认为其对酶活力有抑制作用[5]。固体发酵最大特点是培养基中无游离水，故难以
体现出表面活性剂吐温80对酶活力的促进效果。培养基中若水分不足则易干燥且难于利用；水分过多则培
养基结块，()2浓度低且发酵不彻底。相关报道表明黑曲霉培养基适宜含水量差异较大 J，这里加水量为实
验条件的高阶边缘值，说明黑曲霉产酶对水分需求量较大。黑曲霉纤维素酶活性还受麸皮和(m )：SO4的
影响 3 J，本研究麸皮和(m ) SO4对总酶活力表现出明显促进作用。
3 小 结
应用双温度培养法(前 30h恒温 30℃，后续 72h恒温 23℃)在自然补给 ()2、培养基 pH值约 6．5并保持
环境湿度约60％条件下进行黑曲霉固体发酵生产纤维素酶，培养基优化结果为培养基中葡萄糖对滤纸酶活
力有促进作用；表面活性剂吐温80对酶活力促进效果不明显，而葡萄糖、麸皮、(NI-I,)：SO4和水分适宜作为
黑曲霉固体培养基基本成分。
参 考 文 献
1 李廷生，赵 江，王平诸．果胶酶与纤维素酶复合制剂的研制．郑州工程学院学报，2000，21(4)：38-40
2 王水顺，袁 彩，陈静蓉等．黑曲霉 SL2—111复合酶固体发酵工艺研究．工业微生物，2001，31(4)：26-30
3 邬敏辰，李江华，邬显章．黑曲霉纤维素酶特性的研究．山西食品工业，1997(4)：1-4
4 邬敏辰，李江华．里氏木霉固体发酵生产纤维素酶的研究．江苏食品与发酵，1998(2)：2～6
5 胡智猛．木霉纤维素酶产生条件的研究．西昌农业科技，1998(1)：10～12
6 E1一Hawary F．I．，Mostafa Y．S．，Laszlo E．Celulase production and conversion of rice straw to lactic acid by simultaneous saccharifieation and
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