全 文 ：利用分子标记技术从基因组水平了解病原真菌
变异及其遗传多样性对于防治植物病原真菌有着重
要意义。 随着分子生物学技术的快速发展， 许多分
子标记如 RAPD、 SRAP、 AFLP、 SSR 等已广泛用
于病原菌群体遗传变异与遗传多样性分析。 在此类
标记当中， SSR标记又由于其具有在基因组中分布
广， 侧翼序列相对保守， 多态性好， 标记多呈共现
性， 操作简单， 重复性好等诸多优点而普遍受到欢
迎。 该标记已成为病原菌群体遗传结构、 群体进
化、 遗传多样性， 分子发育等研究的重要工具 [1-3]。
热带作物学报 2014， 35（4）： 758-763
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-10-29 修回日期 2013-12-15
基金项目 国家麻类产业技术体系建设专项资金资助（No. CARS-19）； 农业部热作病虫害疫情监测与防治项目（No. 13RZBC-14）； 中央级公
益性科研院所基本科研业务费专项（No. 2012hzs1J012， 2013hzs1J012）； 中国热带农业科学院环植所自主选题项目（No. 2013hzsJY04）。
作者简介 吴伟怀（1977年—）， 男， 博士， 助理研究员； 研究方向： 植物病理。 *通讯作者（Corresponding author）： 贺春萍（HE Chunping），
E-mail: hechunppp@163.com； 易克贤（YI Kexian）， E-mail: yikexian@126.com。
剑麻茎腐病菌基因组 SSR标记开发
吴伟怀 1， 贺春萍 1*， 严传帝 2， 郑金龙 1， 李 锐 1， 郑肖兰 1， 刘巧莲 3， 易克贤 1*
1
中 国 热 带 农 业 科 学 院 环 境 与 植 物 保 护 研 究 所
农业部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室
海 南 省 热 带 农 业 有 害 生 物 检 测 监 控 重 点 实 验 室
海南海口 571101
2 海南大学环境与植物保护研究所， 海南海口 570228
3 中国热带农业科学院热带生物技术研究所， 海南海口 571101
摘 要 下载 Aspergillus niger ATCC 1015 菌株全基因组序列 ， 利用 GRAMENE 网站提供的 SSR 鉴定工具
SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）， 并按含有 2~10 个碱基重复、 碱基数在 18 bp 以上的 SSR 基
元为标准进行 SSR 鉴定。 结果从 A. niger ATCC 1015 全基因组中， 共发现 4 000 个 2~10 碱基 SSR， 其中含 9 个
碱基重复基元类型最多， 共有 1 433 个， 占所鉴定 SSR 总数的 35.8％。 其次为 6 个碱基重复基元类型， 共有
753 个， 占 SSR 总数的 18.8％； 接着为 3 个碱基重复类型， 共有 547 个， 占 13.6％。 从鉴定出来的 SSR 中， 选
择含有 SSR 的合适区段， 从中设计了 36 对引物， 对剑麻茎腐病菌 17 个菌株的基因组 DNA 进行了 PCR 检测，
发现这些引物都能从剑麻茎腐病菌基因组 DNA 中有效扩增。 由此表明， 黑曲霉 ATCC 1015 菌株基因组 SSR 在
剑麻茎腐病菌基因组中具有通用性。 这为研究剑麻茎腐病菌群体遗传变异、 多样性和进化， 定位和克隆功能基
因等提供了分子标记。
关键词 黑曲霉； 剑麻； SSR 标记
中图分类号 Q78； S432.4 文献标识码 A
Development of Genomic SSR Markers for
Aspergillus niger from Sisal
WU Weihuai1, HE Chunping1*, YAN Chuandi2, ZHENG Jinlong1
LI Rui1, ZHENG Xiaolan1, LIU Qiaolian3, YI Kexian1*
1 Environment and Plant Protection Institute, CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control of
Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical
Agricultural Pests, Haikou, Hainan 571101, China
2 College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101
Abstract Simple sequence repeat identification tool was used to screen SSRs in complete genome sequence of
Aspergillus niger ATCC 1015. Suitable sequence regions harboring SSR were selected for primers design using
Primer5.0 software, and synthesized primers were used to amplify genomic DNA of selected 17 isolates of A. niger
from sisal. A total of 4 000 SSRs were found in A. niger ATCC 1015. Of the 4 000 SSRs, the most abundant
SSR was the non-nucleotide type, with the SSR numbers being 1 433, followed by the hexa- and tri- nucleotide
ones, being 753 and 547, respectively. A set of 36 SSR markers were developed from the genomic sequence of
the reference isolate A. niger ATCC 1015. These markers were amplified successfully from the genomic DNAs of
A. niger from sisal. Therefore, the markers are useful to analyses genetic mutation, diversity and, evolution of sisal
A. niger, and also useful for gene mapping and cloning in the pathogens.
Key words Aspergillus niger; Sisal; Simple sequence repeat (SSR)
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.024
第 4 期 吴伟怀等： 剑麻茎腐病菌基因组SSR标记开发
1.2 方法
1.2.1 黑曲霉全基因组 SSR 位点筛选 利用
GRAMENE 网站 (http://www.gramene.org/db/markers/
ssrtool)提供的SSR鉴定工具SSRIT（Simple Sequence
Repeat Identification Tool）进行 SSR 鉴定。 SSR 鉴
定标准为含有 2~10 个碱基重复、 碱基数在 18 bp
以上的 SSR 基元， 也即含 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、
9 和 10 核苷酸基元 SSR 的最小重复数分别为 9、
6、 5、 4、 3、 3、 3、 2和 2次。
1.2.2 引物设计 对鉴定出的各 SSR 进行比较，
选取含有碱基数较大的 SSR 的核苷酸序列， 在其
基元上下游合适的位置， 用软件 primer5.0 设计引
物。 引物一般要求 GC 含量 40％~65％， Tm值 55~
65 ℃， 引物序列长 18~25 bp， 且无错配、 不形成
二聚体和发夹结构等 。 设计好的引物最终由
Invitrogen公司合成。
1.2.3 引物的有效性评价 引物的有效性通过对
收集于我国不同剑麻栽培区的 17个菌株进行评价。
标记开发成功的标准即为： 供筛选的引物只要在
17 个剑麻茎腐病菌株中的任一个中扩增出有效条
带即为有效引物， 而在 17 个菌株中扩增出不同
DNA大小片段的则记为多态性标记。
1.2.4 剑麻茎腐病菌株及 DNA提取 各参试菌株
的总 DNA 采用 DNA 提取试剂盒 （E.Z.N.A Fungal
DNA kit， Omega公司， 美国）提取。
1.2.5 PCR扩增及产物检测 PCR反应体系为 20 μL，
含有 20～30 ng DNA 模板， 10 μL 2×Eco Taq PCR
Super Mix， 上下游引物各 0.5 μL（10.0 μmol/L），
ddH2O 补 齐 。 PCR 反 应 在 Mastercycler gradient
Mastercycler PCR 扩增仪上进行 ， 扩增程序为 ：
94 ℃预变性 3 min； 随后 94 ℃变性 30 s， 55～60℃
退火 30 s（根据所用引物的 Tm 值确定退火温度），
72 ℃延伸 30 s， 扩增 35 个循环； 最后 72℃延伸
5 min， 10 ℃保存。 PCR 扩增产物在 2％的琼脂糖
表1 17个供试剑麻茎腐病菌株
Table 1 17 isolates of A. niger from sisal used in this study
菌株 采集地 采集时间/年 菌株 采集地 采集时间/年
CH0002 广西南宁山圩农场博爱分场 2007 CH0023 广东雷州市东方红农场 2007
CH0003 广西南宁山圩农场博爱分场 2007 CH0024 广东雷州市金星农场 2007
CH0006 广西南宁山圩农场博爱分场 2007 CH0026 广东雷州市金星农场 2007
CH0008 广东雷州市幸福农场 2007 CH0027 广东雷州市金星农场 2007
CH0009 广东雷州市东方红农场 2007 CH0028 广东雷州市金星农场 2007
CH0010 广东雷州市东方红农场 2007 CJ-1 海南昌江 2012
CH0014 广东雷州市东方红农场 2007 CJ-7-1 海南昌江 2012
CH0017 广东雷州市东方红农场 2007 SX-1 广西南宁山圩农场博爱分场 2007
CH0021 广东雷州市东方红农场 2007
目前的研究结果表明， 从原核生物到人类基因组均
含有丰富而高度多态性的 SSR[4]。 近年来， 随着生
物基因组的大规模测序的开展， GenBank 中已存贮
了大量不同生物类型的基因组 DNA 序列 ， 这为
SSR标记开发提供了丰富的 DNA序列来源。
黑曲霉是一种广泛分布于世界各地的粮食、 植
物性产品和土壤中的曲霉属真菌， 是一类重要的致
病真菌， 同时也是重要的发酵工业菌种。 目前该菌
已有产酶菌株 CBS 513.88 和产柠檬酸菌株 ATCC
1015 等 2 个工业菌株分别获得了全基因组序列，
前者于 2007 年完成测序 [5]， 而后者于 2011 年完成
测序[6]。 比较而言， 后者基因组序列更加完善[6]。
由黑曲霉菌（Aspergillus niger Van. Teigh）引起
的茎腐病是剑麻最严重的病害之一 [7-9]。 上世纪 80
年代， 该病曾在我国粤西地区造成了严重的经济损
失[10]。 近年来， 该病在我国剑麻主产区呈现愈来愈
加重之势。 为此， 本研究拟利用 ATCC 1015 全基
因组序列， 首先对其进行全基因组 SSR 搜索， 寻
找并开发合适的 SSR 标记， 并用于剑麻茎腐病菌
基因组 DNA 扩增， 以期为该病原菌群体进化和遗
传多样性分析， 致病相关基因等的精细定位研究等
提供理想的分析工具。
1 材料与方法
1.1 材料
从 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)网站下
载 A. niger ATCC 1015 菌株全基因组序列（ACJE
00000000）。
1.1.1 供试菌株 用于本研究的 17个剑麻茎腐病
菌株其具体信息详见表 1。
759- -
第 35 卷热 带 作 物 学 报
引物 测序支架 扩增位置 SSR 基元 引物序列(5′-3′)
退火温
度/℃
预期片
段/bp
等位基
因数
AN1 ACJE01000002.1 1461500-1461996 (tgc)13(tgt)32 F:TTGTTATCATTCTCATCATCATCATR:CATTCGGACACTATGATACACC 56 497 1
AN1-1 ACJE01000002.1 1520595-1520987 (atgg)10 F:AGTTATGTAGTAGGCAAAAGAGGACR:GGAGAAGAGGAGCAGAGGAG 56 393 3
AN2 ACJE01000004.1 3251217-3251617 (tag)23 F:ATGCTGGCTTGGCTTCTTCTR:TATCCCCAGAACAGAACAGAAC 56 401 3
AN2-1 ACJE01000004.1 27964-28318 (ttg)22 F:CTAAAGGAAGAGTCCCCGTGGTR:AGACCCTTGGCGATTGATGTA 56 356 1
AN2-2 ACJE01000004.1 2040560-2040917 (cta)21 F:ATTCCTTTTCTCCCTTTCTATTCTR:ATTGCTTGGGCGTGACAGTA 56 358 1
AN3 ACJE01000006.1 146748-147071 (ca)24 F:ACCATCGGACGACATCCTACGR:GAACAGGTGTCTCCACGATTGA 56 345 1
AN3-1 ACJE01000006.1 196228- 196581 (ga)23 F:CAATAGCCACAGTGTCTACCCGR:TCACCACCGACTTATCGTATGC 56 354 1
AN4 ACJE01000008.1 357842-358117 (ac)19(ct)11 F:CGGATTCTTCTCGGAACTTGCR:TACTTGTAACACTTAGGAGCAGCAT 56 378 1
AN4-1 ACJE01000008.1 236135- 236450 (ct)27 F:CGACACTTTTCTTTTGTTTTATTTTR:GGCTCCATCTGCTGAACTAAT 56 316 1
AN5 ACJE01000010.1 2974443-2974980 (ggctct)46 F:TGGTGCTGGCGGCTCTACTR:GTCACAGGGGGTGGTGGAGG 56 538 7
AN5-1 ACJE01000010.1 595391- 595715 (act)22 F:GCAAGGCAAGGGGAAAAGAAR:ATTATTAGAGGCATTGATTCCCCA 56 325 2
凝胶上进行电泳， 紫外灯下检测和照相。
1.2.6 克隆与测序 回收 PCR 产物并与 pEASYTM
Cloning Vector 连接， 转化大肠杆菌感受态细胞，
经蓝白斑筛选后， 选取阳性克隆子送 Invitrogen 公
司测序。 获得的序列经人工去除载体序列后， 利用
多序列比对软件工具 (http://multalin.toulouse.inra.fr/
multalin/)， 将所获得的序列与参考菌株 A. niger
ATCC 1015 对应序列进行比对。
2 结果与分析
2.1 黑曲霉菌基因组 SSR查询分析
利用 SSRIT 软件对 A. niger ATCC 1015 菌株
全基因组进行 SSR 搜索， 结果共发现 4 000 个 SSR
（表 2）。 在这 4 000 个 SSR 中， 其中 9 个碱基重复
基元类型最多， 共有 1 433 个， 占所鉴定 SSR 总数
的 35.8％； 其次为 6 个碱基重复基元类型， 共有
753个， 占 SSR 总数的 18.8％； 接着为 3 个碱基重
复类型， 共有 547个， 占 13.6％。 而数量较少的则
为 7与 8碱基类型， 二者分别为 85与 68个； 接着
为 5、 2、 4 碱基基元类型 ， 分别为 194、 282 及
286个（表 2）。
2.2 SSR 筛选与引物设计
由于 SSR 多态性密切相关其基元重复数 [11]， 而
且重复数越高， 其变异概率越大 [12-13]。 为此， 通过
对已鉴定的 4 000 个 SSR 进一步进行比较分析， 从
中筛选出碱基基元数与重复数乘积数较大的SSR
(重复类型的总核苷酸数较大的 SSR)， 并在其上下
游设计引物。 最终， 从筛选出来的 SSR 中共设计
了 36 对 SSR 引物， 36 对 SSR 引物分布于 24 个测
序支架中的 17个(表 3)。
表2 A. niger ATCC 1015基因组SSR频率统计
Table 2 Frequency of identified genomic SSR
from A. niger ATCC 1015
基序碱基数 不同基元类型个数 最小重复数 出现频率/％
2 282 9 7.1
3 547 6 13.6
4 286 5 7.2
5 194 4 4.9
6 753 3 18.8
7 85 3 2.1
8 68 3 1.7
9 1 433 2 35.8
10 352 2 8.8
总数 4 000 - 100
表3 36对引物相关信息
Table 3 36 SSR primer pair sequences, SSR motifs, expected amplicon length and annealing temperature
760- -
第 4 期 吴伟怀等： 剑麻茎腐病菌基因组SSR标记开发
引物 测序支架 扩增位置 SSR 基元 引物序列(5′-3′)
退火温
度/℃
预期片
段/bp
等位基
因数
AN5-1 ACJE01000010.1 595391- 595715 (act)22 F:GCAAGGCAAGGGGAAAAGAAR:ATTATTAGAGGCATTGATTCCCCA 56 325 2
AN5-2 ACJE01000010.1 1514081- 1514460 (aag)18 F:CCTGAAACCTCCCTAAACCCTR:AGCGTTTATCGGTCCTTCTACTA 56 379 2
AN6 ACJE01000012.1 130010-130451 (gga)5(ggt)7 F:AAGAACGAGACGAAGCAGACAAAR:TTTCCATCCTTTCCCTCCTGT 56 442 2
AN6-1 ACJE01000012.1 670799- 671159 (tag)19 F:ACCTCGCTAAATACTAACTCAACCTR:TGGTAGTATCCACAACACATCTGC 56 361 1
AN7 ACJE01000014.1 610363-610857 (ac)8(ct)22 F:ATTGAAAACATCCAAACGCACCR:ACGGTTTTCTCCTGCTGTTGG 56 495 1
AN7-1 ACJE01000014.1 339827- 340131 (agt)12 F:TATGGTGGTAAATAAACGGTAGTGAR:TTCATTCCGCCGCTCTACTAC 56 305 1
AN8-1 ACJE01000016.1 308770- 309116 (tga)17 F:GCTGCTGGAGGTGTGAACTGTR:CCAAGAACAACAGCACCACC 56 347 2
AN10 ACJE01000020.1 620239-620620 (tgagcc)10 F:CCTTCCTTTGAGCCTCCGTGR:GAGTTGGTATTGCCTCTTCTGC 56 363 2
AN10-1 ACJE01000020.1 1068559- 1068829 (tg)26 F:ATTTGAATAGGTCCTCCACGR:AGCGTCTAAAAGAGGAATCTAAAA 56 271 6
AN13 ACJE01000001.1 366683-367113 (cta)25 F:TTTATCTGACAAAAGTGTATGTATGAGR:CAATAGTCTGCTCACCAACTCCTT 56 431 1
AN14 ACJE01000003.1 58706-59007 (tg)44 F:ATTTGCCACCCAAGAGGAGAR:GTTTGGATGGTCCGTGGTTT 56 303 3
AN14-1 ACJE01000003.1 360060- 360376 (tag)35 F:CACGCTCAATGTCCCTCTCGR:TTTTCCTTGTAAGCGATGTTGC 56 317 3
AN14-2 ACJE01000003.1 284851-285183 (gggat)11 F:AACGAAAGTGCCAGGGTGAGR:CCAGAACTGCCTTTTCCTCG 56 333 2
AN15 ACJE01000005.1 779712-780166 (gta)58 F;TGCGAAAGCGGGACATCTGR:CGCCTTTACAACTTCCAGATG 56 455 2
AN15-1 ACJE01000005.1 1207218-1207560 (ca)8(ct)28 F:ACTGGATGGGGACTGTGCTACR:AGGGGTGAAGATGTTCGCTC 56 343 5
AN15-2 ACJE01000005.1 947774-948149 (gta)27 F:ACGAAGTTCTGCTACTCATCTGGR:GCACCTCCCCATCTTACACTC 56 376 1
AN17 ACJE01000009.1 1724807-1725155 (tag)51 F:TATTGTTTATGAGTCAAGTATGCR:ATAGTTAGTAGGAGCCTTGGAT 56 349 3
AN17-1 ACJE01000009.1 453640-453926 (ttc)19 F:CACGCACAGACAGTGATGATTATR:CTGTGGTTGCGGATGAAGTT 56 287 2
AN17-2 ACJE01000009.1 2066253-2066551 (tcc)38 F:GATGCGGTATTTGGGGTGTGR:CTTGGGTGTGTATGTCTCCGC 56 299 2
AN19 ACJE01000013.1 577204-577527 (cat)19 F:GTGGTAAGGTGTTCAAAGAGCAR:ATACAGTGCTTCTGAAAAGTAAAAT 56 324 1
AN20 ACJEO1000015.1 678890-679331 (tac)40 F:GCCTCCCTATGAGCCTATGAAR:AACTGGACTGTGCCTGAACG 56 442 4
AN20-1 ACJE01000015.1 260108-260438 (ttg)16 F:TTTGAATGATTTGAAAAGACGAGAR:GGTGACCAGTGAAAGAGGGC 56 331 1
AN21 ACJE01000017.1 354619-355157 (gta)28 F:GCACAATCCATAGAATCCGTTR:TGGTTCATTCCCGATGGCTA 56 539 1
AN21-1 ACJE01000017.1 218717-219050 (acat)23 F:CGCTTGATACAAAACAAAGGAAAR:CTACCACACCTTTAGGCAATCAAT 56 334 1
AN23 ACJE01000021.1 762990-763446 (caa)64 F:CTACAGAACCACCACCACCACR:CTGCGGTCCCAGATAGAAATG 56 457 8
AN23-1 ACJE01000021.1 452557-452913 (ac)19(ct)19 F:CGCTTTTCATTACCTGATTATTTCR:TTCAGGACTCAGACACCAAAT 56 357 1
续表3 36对引物相关信息
Table 3 36 SSR primer pair sequences, SSR motifs, expected amplicon length and annealing temperature (Continued)
761- -
第 35 卷热 带 作 物 学 报
2.3 引物有效性检测
为了检测已设计的 36 对 SSR 引物在剑麻茎腐
病菌中的存在情况。 分别对 17 个剑麻茎腐病菌
DNA 进行了 PCR 扩增。 结果表明， 所设计的 36
对引物均能在剑麻茎腐病菌基因组 DNA 中有效扩
增(图 1)。 其中具有多态性的 19 对引物均能扩增出
2 个及以上的等位基因， 占总引物数的 52.7％。 如
引物 AN5-1扩增的条带中既有大小的差异， 也有存
在与缺失（有或无条带）的多态(图 1-B)； 引物 An8-1
扩增出来的条带中存在明显的大小差异（图 1-C）；
而引物 AN21-1 在 17 个供试菌株中均能扩增出唯
一条带(图 1-F)； 由引物 An14-1 及引物 An17-1 等
扩增出来的条带中存在明显的条带大小差异多态性
（1-D， 1-E）。 故基于 A. niger ATCC 1015 菌株序
列所开发剑麻茎腐病菌同源 SSR标记是可行的。
2.4 茎腐病菌 SSR的 PCR产物序列分析
为了进一步验证所开发的 SSR 标记的真实性，
选取 An5-1 引物并对 CH0002、 CH0008、 CH0009
菌株 DNA 进行扩增， 进而对其扩增产物进行克隆
与测序。 将获得的序列与 A. niger ATCC 1015 菌
株对应序列进行比对。 序列分析结果表明， 与参考
菌株 A. niger ATCC 1015 中(act)22 基元相比， 在
CH0002、 CH0008、 CH0009 菌株中则均缺失了一
个(act)10基元（图 2）。 由此表明， 该处 SSR 的位点
泳道1： DNA marker， 泳道2～18依次为菌株CH0002、 CH0003、 CH0006、 CH0008、 CH0009、 CH0010、
CH0014、 CH0017、 CH0021、 CH0023、 CH0024、 CH0026、 CH0027、 CH0028、 CJ-1、 CJ-7-1、 SX-1。
Lane 1: DNA marker, Line 2～18: CH0002、 CH0003、 CH0006、 CH0008、 CH0009、 CH0010、 CH0014、
CH0017、 CH0021、 CH0023、 CH0024、 CH0026、 CH0027、 CH0028、 CJ-1、 CJ-7-1、 SX-1.
图1 不同引物对在17个剑麻茎腐病菌株的通用性检测
Fig. 1 Tranferability test of genomic SSR primer in 17 Aspergillus niger isolates from sisal
A： 引物AN1-1扩增 B： 引物An5-1扩展
C： 引物An8-1扩增 D： 引物An14-1扩增
E： 引物An17-1扩增 F： 引物An21-1扩增
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
黑框表示SSR基元
The black box represent SSR motif
图2 序列比对分析
Fig. 2 Sequenc alignment
1015
CH0002
CH0008
CH0009
Consensus
1015
CH0002
CH0008
CH0009
Consensus
1015
CH0002
CH0008
CH0009
Consensus
762- -
第 4 期
是真实存在的。 除此之外， 3 个菌株其序列在 SSR
基元区中还存在 6个核苷酸变异， 这就表明， 剑麻
茎腐病病原菌与 A. niger ATCC 1015 菌株间存在
一定的差异 。 另一方面 ， 就 CH0002、 CH0008、
CH0009 菌株序列而言， 在该处 SSR 位点没有差
异， 但在其侧翼序列存在一个(GCT)3 的差异。 尽
管如此， 茎腐病菌与 A. niger ATCC 1015 序列仍
然拥有非常高的同源性。 由此表明， 根据其开发的
SSR在剑麻茎腐病菌中具有真实性和通用性。
3 讨论
随着生物技术的不断发展， 尤其是高通量测序
技术的出现， 越来越多的生物基因组被破译。 如何
充分利用这些基因组的序列信息是后基因组时代的
重要课题。 而从这些已知基因组中查询核苷酸序列
已成为快速、 有效开发 SSR 标记的途径。 目前，
已有 2个黑曲霉菌株进行了全基因组测序， 这为从
黑曲霉基因组中开发剑麻茎腐病 SSR 标记提供了
可能。 本研究利用黑曲霉 ATCC 1015 菌株基因组
为参考序列 ， 从中共鉴定到 4 000 个 2~10 碱基
SSR， 进而选择重复次数比较多的 36 个位点设计
引物， 通过 17个剑麻茎腐病菌基因组 DNA检测发
现， 36 对引物均能从供试菌株中有效扩增。 其中
19 对引物具有多态性， 占总引物数的 52.7％。 由
此， 一方面说明利用该基因组来开发剑麻茎腐病菌
基因组 SSR 具有可行性， 另一方面也说明该方法
具有高效性。 进一步的测序验证了参考菌株序列与
剑麻茎腐病菌具有高度的同源性。 这为将来开发更
多具有多态性的 SSR分子标记提供了可能。
在本研究所鉴定出的 SSR 中， 其中含 9 个碱
基重复基元类型最多， 共有 1 433个， 占所鉴定 SSR
总数的 35.8％。 其次为 6个碱基重复基元类型， 共
有 753 个， 占 SSR 总数的 18.8％； 接着为 3 个碱
基重复类型， 共有 547 个， 占 13.6％。 比较而言，
在稻瘟病菌基因组中最丰富的是单碱基基元重复类
型， 其次为三碱基基元重复类型， 以及五碱基重复
核苷酸基元类型， 数量最少的则是二核苷酸碱基类
型[14]。 在粗糙脉孢菌基因组中， 其中数量最多的是
三碱基 SSR， 数量达到 4 729 个， 其次为六碱基
SSR (2 940个）和单碱基SSR（2 489 个）； 而数量最
少的是二碱基 SSR[15]。 然而， 在构巢曲霉菌基因组
中， 最丰富的类型为五核苷酸基元类型， 其次为六
碱基以及三碱基类型， 而最少的类型则是二核苷酸
重复类型 [16]。 与之相似的， 本研究中发现二碱基
SSR也是属于比较少的。 由此表明， 不同病原菌基
因组中 SSR 类型存在明显差异， 但也可能与鉴定
SSR时所设定的标准不同有一定的关系[17]。
迄今为止， 虽然已在稻瘟病菌、 粗糙脉孢菌、
构巢曲霉菌以及禾谷镰刀菌等多种病原菌中开发出
了 SSR 标记[14-15，17]， 但是据笔者所了解， 对剑麻茎
腐病菌进行 SSR 标记开发， 尚属首次。 这为研究
剑麻茎腐病菌遗传变异、 遗传多样性、 进化以及功
能基因的定位和克隆等提供了有效的分子标记。
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责任编辑： 沈德发
吴伟怀等： 剑麻茎腐病菌基因组SSR标记开发 763- -