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2015,44(4): 297～303.
Subtropical Plant Science
番石榴叶乙醇提取物中熊果酸富集的初步研究
陈 淳，刘黎卿，陈 菲，林志楷，李惠华，刘鸿洲
(福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006)

摘 要：对番石榴 Psidium guajava 叶乙醇提取物中熊果酸富集工艺的除杂和酸碱富集主要环节进行优化试验。
结果表明，最佳富集工艺为：以料液比为 1∶50 的水和石油醚除去杂质；酸碱富集过程中富集条件以 10% NaOH
碱化提取液 pH=14，再以 5% H2SO4酸化调节 pH=3，用 1 倍样品溶液体积的 pH=3 酸性水溶液稀释。终产品中
熊果酸的纯度和回收率分别为 17.74%和 85.12%。
关键词：番石榴叶；熊果酸；正交试验；富集工艺
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2015.04.007
中图分类号：Q946 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2015)04-0297-07

Enrichment Technology of Ursolic Acid in Ethanol Extract from
Psidium guajava Leaves
CHEN Chun, LIU Li-qing, CHEN Fei, LIN Zhi-kai, LI Hui-hua, LIU Hong-zhou
(Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant, Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen
361006, Fujian China)

Abstract: The enrichment technologies of ursolic acid in ethanol extract from Psidium guajava
leaves were carried out. The results showed that the impurities were separated better with the
solid-liquid ratio of 1∶50 of water and 1∶50 of petroleum ether. The conditions of accumulating
ursolic acid with acid and alkali were followed as: the solution was treated with 10% NaOH to pH=14,
then with 5% H2SO4 to pH=3, diluted with aqueous solution with pH=3 as the same volume, the
purity and recovery of ursolic acid in the end product were 17.74% and 85.12% respectively.
Key words: Psidium guajava leaves; ursolic acid; orthogonal experiment; enrichment technology

番石榴 Psidium guajava，又名鸡矢果、百子树、芭乐、红心果、喇叭果等，为桃金娘科番石榴属
植物，是常绿小乔木或灌木。番石榴是一种适应性很强的热带果树，原产墨西哥、巴西等热带地区，
约 17 世纪末传入我国，现在台湾、广东、广西、福建、江西等省(区)均有栽培，有的地方已逸为野生
果树。番石榴叶具有明显的降血糖、抗病毒及抗菌等活性。近年来，国内外对番石榴叶的药理作用研
究逐渐深入[1]。
目前，关于番石榴叶有效成分研究大多集中于黄酮类物质，对番石榴叶熊果酸的提取富集研究较
少。熊果酸是一种三萜类化合物，广泛存在于天然植物中，被证明有望成为低毒、有效的新型天然抗
癌药物[2—3]，其药理、病理及分子机制的研究已受到重视[4]。
关于熊果酸的提取富集有较多研究，如枇杷Eriobotrya japonica叶、白花泡桐Paulownia fortunei叶、
苦丁茶Ilex latifolia、山楂Crataegus pinnatifida等[5—9]。但未见从番石榴叶中提纯熊果酸的报道。从其他
植物中分离熊果酸的工艺主要有三种：一是将乙醇提取液减压浓缩后用有机溶剂萃取，如氯仿、二氯
甲烷、丙酮、苯等[8]，该工艺成本高，污染严重；二是将提取液减压浓缩，用硅胶柱或交联葡聚糖凝胶
柱分离富集[10]，该工艺柱填料成本高，工艺过程复杂，并且常用有毒有机溶剂作洗脱剂，污染环境；
第三种是采用酸碱沉降法，沉淀法可以得到纯度较高的熊果酸，相对于前两种方法，环境污染较轻[11]。
收稿日期：2015-11-13
基金项目：厦门市科技计划项目(3502Z20132003)
作者简介：陈淳，本科，助理研究员，从事植物活性成分研究。E-mail: 275586817@qq.com
第 44 卷 ﹒298﹒
本研究选用酸碱沉降法，通过对番石榴叶熊果酸富集过程中碱化、酸化的pH值以及酸性水溶液沉降条
件的探索，掌握提高番石榴叶熊果酸富集的关键参数。
1 材料与方法
1.1 材料
番石榴叶原料(品种为‘珍珠’番石榴)；石油醚、95%乙醇、氢氧化钠、硫酸皆为分析纯，购自中
国医药上海化学试剂公司。
1.2 仪器
DELTA320 pH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]、低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器
厂)、DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏实验设备公司)、HHS-4型恒温水浴锅(上海横平仪器仪表厂)、
PL2002电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]、BS124S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公
司)、SHZ型循环水真空泵(河南省巩义市杜甫仪器厂)、BC-R202B真空旋转蒸发仪(上海贝凯生物化工设
备有限公司)、UV-2501PC分光光度计(日本岛津公司)、Waters2695高效液相色谱仪。
1.3 方法
1.3.1 样品制备 称取番石榴叶原料 500.0 g，用 95%乙醇按照料液比 1∶15 (W/V)、85 ℃水浴回流提取
1 h 后过滤。旋转蒸发除去溶剂，真空干燥箱 40 ℃干燥后过 60 目筛得粉末。
移取25 mL提取液浓缩，干燥，用甲醇溶解并定容，作为测试样品。采用高效液相色谱法测定熊果
酸含量，计算提取熊果酸的得率[10—13]。
熊果酸得率(%) =提取液中熊果酸含量(g)/番石榴叶干重(g)×100%
1.3.2 水溶解除杂
1.3.2.1 水用量选择 称取干燥样品粉末 5 份，每份 1.0 g，分别加水 20、30、40、50、60 mL。超声波
溶解后，以 4000 r·min-1 离心 20 min。去除上清液，真空干燥沉淀，称重。
1.3.2.2 离心时间选择 称取干燥样品粉末5份，每份1.0 g，加水60 mL超声波溶解后，以4000 r·min-1分
别离心10、15、20、25、30 min。去除上清液，真空干燥沉淀并称重。
1.3.3 石油醚溶解除杂
1.3.3.1 样品制备 取 10.0 g 由 1.3.1 制得的样品粉末，加水 500 mL，超声波溶解，以 4000 r·min-1 离心
分离 25 min 后，真空干燥沉淀物，得到干燥样品粉末。
1.3.3.2 石油醚用量选择 称取 1.3.3.1 制得样品粉末 5 份，每份 1.0 g，分别加石油醚 20、40、60、80、
100 mL。超声波溶解后过滤，将所得滤渣真空干燥，称重。
1.3.3.3 石油醚溶解次数选择 准确称取 1.3.3.1 制得的样品粉末 1.0 g，加石油醚 50 mL，超声波溶解后
过滤，滤渣真空干燥，称重。再用石油醚以固液比 1∶50(W/V)溶解 5 次，分别真空干燥滤渣并称重。
每次溶解所得的石油醚溶液在 λ=669 nm 处测定吸光度。
1.3.4 乙醇溶解次数选择
1.3.4.1 样品制备 准确称取干燥的乙醇提取物 5.0 g，加入 250 mL 水，超声波溶解后离心并干燥不溶
物，再以固液比 1∶50(W/V)加石油醚超声波溶解 3 次，过滤后真空干燥得滤渣。
1.3.4.2 乙醇溶解次数选择 称取上述滤渣干燥物 1.0 g，加入 95%乙醇 20 mL，用超声波溶解后离心，
收取滤液，重复 5 次。将滤液分别减压浓缩后真空干燥，采用 HPLC 法测定熊果酸含量，确定合适的
溶解次数。
1.3.5 酸碱沉降法富集熊果酸的单因素及正交试验[11]
1.3.5.1 碱化 pH 选择 准确称取 1.3.4.1 滤渣干燥物 10.0 g，加入 95%乙醇 200 mL，用超声波溶解后离
心，取上清液，重复 3 次。合并上清液，以 10% NaOH 调节溶液 pH 值分别为 9、10、11、12、13、14，
50 ℃水浴加热 10 min，离心除去不溶物。上清液先用 5% H2SO4 酸化至 pH 为 3，再用等体积的酸性水
溶液(pH=3)稀释，50 ℃水浴加热 20 min，静置后离心，所得沉淀经水洗、真空干燥得到熊果酸粗产品。
第 4 期 陈淳,等：番石榴叶乙醇提取物熊果酸富集的初步研究 ﹒299﹒
用 HPLC 法测定熊果酸含量，计算产品的纯度和回收率。
1.3.5.2 酸化 pH 选择 称取 1.3.4.1 滤渣干燥物 10.0 g，加入 95%乙醇 200 mL，用超声波溶解后离心，
取上清液，重复 3 次。合并上清液，以 10% NaOH 调节溶液 pH 值为 14，50 ℃水浴加热 10 min，离心
除去不溶物。上清液用 5% H2SO4 分别调节 pH 值为 1、2、3、4、5、6，再用等体积相同 pH 酸性水溶
液稀释，50 ℃水浴加热 20 min，静置后离心，所得沉淀经水洗、真空干燥得到熊果酸粗产品。测熊果
酸含量，计算其纯度和回收率。
1.3.5.3 水稀释倍数选择 称取 1.3.4.1 滤渣干燥物 10.0 g，加入 95%乙醇 200 mL，用超声波溶解后离心，
取上清液，重复 3 次。合并上清液，以 10% NaOH 调节溶液 pH 值为 14，50 ℃水浴加热 10 min 后离心
除去不溶物。上清液用 5% H2SO4 调节 pH 值为 3，再分别用 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 倍溶液体积的相
同 pH 酸性水溶液稀释，使熊果酸析出并沉降，50 ℃水浴加热 20 min，静置后离心，所得沉淀经水洗、
真空干燥得到熊果酸粗产品。测熊果酸含量，计算其纯度和回收率。
1.3.5.4 正交试验 称取 1.3.4.1 滤渣干燥物 10.0 g，
加入 95%乙醇 200 mL，用超声波溶解后离心，取
上清液，重复 3 次，合并上清液。将上清液根据单
因素实验结果，选择碱化 pH、酸化 pH、水稀释倍
数 3 个因素进行正交设计，选用 L9(34)正交表，因
素水平见表 1。
表 1 正交设计因素水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 碱化 pH 值(A) 酸化 pH 值(B) 水稀释倍数(C)
1 12 2 0.5
2 13 3 1.0
3 14 4 1.5
1.3.6 提取物中熊果酸含量检测[14—15] 色谱条件：色谱柱(Diamonsil C18，250 mm× 4.6 mm，5 μm)；
流动相由甲醇(标记为 A)和水-冰乙酸-三乙胺(10∶0.03∶0.06，V/V)(标记为 B)两相组成，A∶B 为
83∶17(V/V)；流速 1.0 mL·min-1；检测波长 203 nm；柱温 30 ℃；进样体积 20 μL。
对照品溶液制备：称取熊果酸标准品 10 mg，置于 10 mL 容量瓶，加甲醇定容，浓度 1 mg·mL-1。
精密吸取上述溶液 1 mL，置于 10 mL 容量瓶，加甲醇定容，制得终浓度为 0.1 mg·mL-1 熊果酸对照品
溶液。
标准曲线绘制：吸取熊果酸标准品(50、100、200、300、400 μg·mL-1)，在上述色谱条件下测定峰
高(A)，以峰高为纵坐标，以对照品的量为横坐标，分别绘制标准曲线。
样品制备：将待测样用 95%乙醇溶解，在常温 4000 r·min-1 离心 10 min，上清转移至 50 mL 蒸馏瓶
中，40 ℃水浴旋干，甲醇溶解并定容，摇匀，HPLC 上样前用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得样品待测
溶液。
熊果酸计算方法：Y= (V × X) / G × 10-3
式中：Y-熊果酸含量(mg·g-1)；V-定容体积(mL)；X-熊果酸质量浓度(μg·mL-1)；G-番石榴叶提取物
干重(g)。
2 结果与分析
2.1 水溶解除杂
2.1.1 水用量 由图 1 可以看出，当加水量少于 50 mL 时，样品重量即水不溶物的重量随用水量增加下
降较快，而当加水量超过 50 mL 后，样品重量无明显变化。因此，对于 1.0 g 样品，加水量少于 50 mL
不足以溶解掉其中的水溶性杂质，而水用量过多也会加大工作量。故为了尽可能多的去除掉样品中的
杂质，最终选择水溶解除杂的料液比为 1∶50。
2.1.2 离心时间 离心时间的长短直接影响着分离效果的好坏。离心时间太短，上清液与沉淀不能很好
地分离，造成沉淀的损失；离心时间过长，易造成浪费。图 1 显示，以 4000 r·min-1 离心 10 min，上清
液与不溶物基本没有分离；15 min 时分离效果较差，上清液中仍有少量不溶物；20 min 以后完全分离，
水不溶物重量基本保持稳定。
第 44 卷 ﹒300﹒
0.70
0.71
0.72
0.73
0.74
0.75
20 30 40 50 60
用水量/mL•g-1
水
不
溶
物
重
量
/g

0.60
0.65
0.70
0.75
10 15 20 25 30
离心时间/min
水
不
溶
物
重
量
/g

图 1 用水量和离心时间对水不溶物的影响
Fig. 1 The effects of water dosage and centrifugation time on water-insoluble
2.2 石油醚溶解除杂
2.2.1 石油醚用量 熊果酸不溶于石油醚，因此用石油醚可以除去脂溶性或低极性的杂质，如脂溶性色
素等[16]。由图 2 可以看出，溶解样品时随着石油醚体积数的增加，过滤后所得样品的重量在不断减小，
说明其溶出物在不断增加。当石油醚体积达到 100 mL 时，不溶物重量变化已不明显，可能大部分杂质
已经被溶解。为提高除杂质的效果，减少石油醚使用量，本实验尝试用石油醚多次溶解除杂，以达到尽可
能多的去除其他物质的效果。综合考虑，最后确定石油醚除杂的每次加入量为 50 mL，即料液比 1∶50。
2.2.2 石油醚除杂次数 经过多次溶解后发现，石油醚溶解液一直保持着绿色，从开始的黑绿色变为浅
绿色，后面几次溶解液的颜色则基本不变。说明石油醚很难将样品中的色素完全去除。
由图 2 还可看出，石油醚溶解 3 次，溶解液的吸光度明显下降，第二次和第三次分别下降了 39.93%
和 59.39%。第四次和第五次溶解，溶解液的颜色基本没有变化，吸光度基本不变。同样，溶解前三次，
样品的重量和颜色的变化较后两次明显。因此，最终确定石油醚溶解除杂的次数为 3 次。
0.60
0.65
0.70
0.75
20 40 60 80 100
石油醚用量/mL•g-1
不
溶
物
重
量
/g

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
第一次 第二次 第三次 第四次 第五次 第六次
次数
吸
光
度
0.60
0.62
0.64
0.66
0.68
0.70
不
溶
物
重
量
/g
吸光度
石油醚不溶物重量（g）

吸光度
不溶物重量
图 2 石油醚用量和溶解次数对石油醚不溶物的影响
Fig. 2 The effects of dosage of petroleum ether and times of dissolution on petroleum ether-insolution

2.3 乙醇溶解次数
0
10
20
30
40
50
60
70
1 2 3 4 5 6
溶解次数
熊
果
酸
溶
解
量
/%按 1.3.4.2 的方法确定 95%乙醇溶解次数，结果如
图 3。乙醇溶解前 3 次时，熊果酸的溶解量明显增加，
但当乙醇溶解次数继续增加，熊果酸的溶解量增加不明
显。因此，确定用 95%乙醇溶解，按料液比 1∶20 溶解
3 次，此时所得溶解物中回收率为 95.3%。
2.4 酸碱沉降法富集熊果酸的单因素及正交试验
2.4.1 碱化 pH 对于酸性、碱性或两性有机化合物，常
通过加入酸、碱调节溶液 pH 值，以改变分子的存在状
图 3 乙醇溶解次数对熊果酸溶出量的影响
Fig. 3 The effect of dissolution times on dissolution
quantity of ursolic acid
第 4 期 陈淳,等：番石榴叶乙醇提取物熊果酸富集的初步研究 ﹒301﹒
态(游离型或解离型)，从而改变溶解度来实现分离。
由图 4可知，当碱化 pH=14时，熊果酸粗提物的纯度达最大，为 169.9 mg·g-1，熊果酸回收率为 82.76%。
综合考虑碱化 pH 对产品纯度和回收率的影响，选定碱化 pH 值为 14。
2.4.2 酸化 pH 经过一系列酸化实验证明，酸化 pH 值对熊果酸的纯度和回收率有较大的影响，结果见
图 4。在酸化过程中，当 pH 值从 1 升高至 3 时，纯度从 139.6 mg·g-1 升至 172.7 mg·g-1，产品的回收率
从 65.64%升至 83.37%。其中 pH=3 时，产品的纯度和回收率均达最大值。故最终选择酸化 pH 值为 3，
并加入相同 pH 值的酸性水溶液进行稀释。
2.4.3 水稀释倍数 由图 4 可知，酸性水溶液稀释过程中，用水量是影响产品纯度和回收率的重要因素。
以 1.0 倍体积的酸性水溶液稀释，产品纯度较高，为 172.7 mg·g-1，且回收率达 83.37%。当酸性水溶液
大于 1.0 倍体积后，产品的纯度迅速下降，回收率也只缓慢增加到 91.69%。这表明，增大酸性水溶液
的体积，有利于熊果酸充分沉淀，同时也造成其他水不溶物的过多析出，降低产品纯度。因此，选择
加酸性水溶液稀释的量为 1.0 倍样品体积。
120
130
140
150
160
170
180
9 10 11 12 13 14
碱化pH值
熊
果
酸
含
量
/m
g•
g-1
65
70
75
80
85
熊
果
酸
回
收
率
/%
熊果酸含量（mg/g）
熊果酸回收率
120
130
140
150
160
170
180
1 2 3 4 5 6
酸化pH值
熊
果
酸
含
量
/m
g•
g-
1
65
70
75
80
85
熊
果
酸
回
收
率
/%
120
130
140
150
160
170
180
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
稀释倍数
熊
果
酸
含
量
/m
g•
g-
1
65
70
75
80
85
90
95
熊
果
酸
回
收
率
/%


2.4.4 正交试验 酸碱沉降富集熊果酸的正交试验结果见表 2。由分析结果可知，影响酸碱沉降富集番
石榴叶熊果酸的主次因素依次为酸化 pH 值 > 碱化 pH 值 > 水稀释倍数；酸碱沉降富集的最佳方案
A3B2C2，即以 10% NaOH 调节溶液 pH 值为 14，50 ℃水浴加热 10 min，上清液用 5% H2SO4 调节 pH
值为 3，再用 1.0 倍溶液体积 pH=3 的酸性水溶液稀释，使熊果酸析出沉降。
表 2 正交试验方案及结果
Table 2 Program and results of orthogonal test
因素 序号 碱化 pH 值(A) 酸化 pH 值(B) 水稀释倍数(C) 熊果酸/% 回收率/%
1 12 2 0.5 15.36 83.6
2 12 3 1.0 17.21 83.1
3 12 4 1.5 15.04 85.3
4 13 2 1.0 15.33 85.6
5 13 3 1.5 16.98 83.4
6 13 4 0.5 16.53 83.5
7 14 2 1.5 16.37 81.6
8 14 3 0.5 17.23 82.8
9 14 4 1.0 16.89 79.4
K1 15.87 15.687 16.373
K2 16.28 17.140 16.477
K3 16.83 16.153 16.130
熊果
酸
极差 0.960 1.453 0.836
K1 84.000 83.600 83.300
K2 84.167 83.100 84.800
K3 83.367 84.633 83.433
回收
率
极差 0.800 1.733 1.500
图 4 碱化 pH 值、酸化 pH 值和稀释倍数对熊果酸纯度和回收率的影响
Fig. 4 Effects of pH of alkalization, acidification and dilution ratio on purity and recovery of ursolic acid
第 44 卷 ﹒302﹒
2.4.5 验证试验 取番石榴叶乙醇提取物粉末 6 份各 10.0 g，按照优选的提取工艺进行试验。通过本方
法的富集熊果酸纯度从 1.77%提高到 17.74%，RSD 为 1.35%，说明正交试验确定的提取工艺稳定可行。
2.5 酸碱富集前后的 HPLC 图谱分析
检测样品酸碱富集前后的 HPLC 谱如图 5。结果显示，经过试验工艺条件的优化，富集物中熊果
酸纯度得到大幅度提高，乙醇提取物中一些杂质可通过本工艺去除。但富集后粗产品仍有与熊果酸性
质相近的其他物质峰，需要进一步采用分离效率高的大孔吸附树脂法去除(图 5：B)。


A
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
A
U

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00

图 5 富集前(A)和富集后(B)样品 HPLC 图谱
B 时间/min
时间/min
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00
0.90
0.80
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
A
U

Fig. 5 The HPLC maps of before (A) and after (B) enrichment
3 讨论
熊果酸的富集工艺主要有有机溶剂萃取、硅胶柱或交联葡聚糖凝胶柱分离富集、酸碱沉降法。前
两种方法工艺成本高，污染严重。谢艳[17]在研究白花蛇舌草Hedyotis diffusa熊果酸提取工艺中利用氯仿
作为萃取剂，该方法会导致样品有大量氯仿残留，给进一步加工成药品带来安全性问题；且氯仿的大
量使用会造成环境污染。本研究采用酸碱沉淀法能很好地解决上述问题。张明[18]在提取纯化苦丁茶熊
果酸时，选用200～300目硅胶装柱，洗脱剂为氯仿-甲醇体系，这种富集工艺需经过填料-硅胶活化-上
样-预先洗脱去杂质-洗脱-干燥等过程，工艺复杂，上样和洗脱所需时间过长，成本高。相比较而言，
本研究采用的方法工艺简单，生产周期短。
酸碱沉淀法富集熊果酸的工艺中最常见的问题是溶液体积过大，故本研究采取乙醇多次溶解法，
即用95%乙醇按料液比1∶20溶解3次，这样能更充分地溶解出熊果酸，减少乙醇用量，为后续处理减
少工作量。
在使用石油醚去除杂质、脱色的实验过程中，即使在石油醚中溶解 6 次，溶解液仍有颜色，说明
第 4 期 陈淳,等：番石榴叶乙醇提取物熊果酸富集的初步研究 ﹒303﹒
杂质没有完全除尽。如用更多的石油醚除杂质，将增加成本，加重环境污染，故除杂质方法有待进一
步研究优化。
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