全 文 ：白阿魏侧耳及其近缘种的线粒体 SSU rDNA5′端序列分析
盛伟 , 潘传奇　(安徽科技学院生命科学学院 ,安徽凤阳 233100)
摘要　以白阿魏侧耳(Pleurotus.nebrodensis)及其近缘种刺芹侧耳(Pleurotus.eryngii)、阿魏侧耳(Pleurotus.ferulae)为供试材料 ,利用差速
离心法和改良的CTAB法提取供试菌株线粒体总DNA ,并以此为模板 ,MS1和MS2为引物特异性扩增出供试菌株线粒体 SSU rDNA 5′端
的DNA片段 ,并对 PCR产物纯化后进行序列测定。所测序列经比对后用BioEdit 6.0.5和MEGA 3.1软件分别对其序列长度、(G+C)含
量和遗传距离进行分析 , 确定供试菌株间的亲缘关系。结果表明 , 白阿魏侧耳、刺芹侧耳、阿魏侧耳之间具有较近的亲缘关系 ,而且阿
魏侧耳与白阿魏侧耳之间的亲缘关系比其与刺芹侧耳之间的亲缘关系更近 ,但白阿魏侧耳、刺芹侧耳、阿魏侧耳为 3个不同的种。同时
提示线粒体 SSU rDNA 5′端序列可以区分不同种间亲缘关系。
关键词　白阿魏侧耳;近缘种;亲缘关系
中图分类号　Q936　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2007)33-10617-02
Analysis of the Mitochondrial SSU rDNA 5′Sequences from Pleurotus.nebrodensis and its Related Species
SHENG Wei et al　(Anhui Science and Technology University ,College of Life Science ,Fengyang ,Anhui 233100)
Abstract　In this study , we used Pleurotus.nebrodensis , Pleurotus.eryngii and Pleurotus.ferulae as tested materials to extract the mitochondrial DNA of
the tested strains with the method of differential centrifugation and improved CTAB , and applied the extracted DNA as template ,MS1 and MS2 as specific
primers to amplify the DNA fragment of tested strains mitochondrial SSU rDNA 5′PCR products and then they were purified and sequenced.After being
proofread , the sequence length GC content and genetic distance of the measured sequences were analyzedwith the BioEdit 6.0.5 and MEGA 3.1 software
to determine the genetic relationship of the tested strains.The result showed that Pleurotus.nebrodensis , Pleurotus.eryngii and Pleurotus.ferulae have the
close genetic relationship , and the genetic relationship between the Pleurotus.ferulae and Pleurotus.nebrodensis was much closer , but the Pleurotus.ne-
brodensis , Pleurotus.eryngii and Pleurotus.ferulae belonged to three different species.And the results also showed that the mt SSU rDNA 5′sequence can
be used to distinguish different species.
Key words　Pleurotus.nebrodensis;Related species;Phylogenetic relationships
基金项目　安徽省教育厅自然科学基金项目(2005319zc)。
作者简介　盛伟(1974-),男 ,安徽蚌埠人 ,硕士 ,讲师 ,从事细胞生物
学和分子生物学研究。
收稿日期　2007-06-28
　　白阿魏侧耳(Pleurotus.nebrodensis)是四极性异宗结合蕈
菌 ,隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌纲(Basidiomycetes)、伞菌
目(Agaricales)、侧耳科(Pleurotaceae)、侧耳属(Pleurotus)。在
侧耳属中 ,白阿魏侧耳有两个近缘种 ,即刺芹侧耳和阿魏侧
耳。目前 ,这 3种蕈菌都是作为有极大开发价值的新品种出
现在中国食用菌栽培业中 ,拥有各自的商业名称[ 1] 。但是由
于它们形态相似 、生境相同 ,相互间的分类学关系很不明了。
尤其是白阿魏侧耳和阿魏侧耳的形态特征非常相似 ,并都起
源于新疆地区 ,致使在菌名的使用上常出现混淆的情况 ,这
为菌种管理 、品种选育 、栽培引种 、产品生产和学术研究带来
诸多不便 ,极大地阻碍了对白阿魏侧耳的研究开发和国际市
场的开拓。因而 ,澄清这 3种栽培蕈菌的分类学关系 ,克服
菌种命名混乱现象是进一步研究和开发白阿魏侧耳等蕈菌
的首要任务 。
笔者以白阿魏侧耳及其近缘种刺芹侧耳 、阿魏侧耳为供
试材料 ,运用分子系统学分析手段 ,测定供试样品的线粒体
SSU rDNA 5′端序列 ,通过序列分析 ,确定供试菌株之间的系
统进化关系 ,为进一步保护种质资源和选育优良新品种奠定
研究基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌株。包括 2株白阿魏侧耳 、2株刺芹侧耳和 1
株阿魏侧耳(表 1)。
1.1.2　主要试剂。Taq DNA聚合酶 、dNTP 、PCR Buffer 缓冲
液(加MgCl2)均为 TaKaRa公司产品;DNA纯化回收试剂盒为
北京道普生物科技有限公司产品。
　　表1 供试菌株
编号 种名 菌株名称 来源
1 Pleurotus.nebrodensis 白灵菇-1 江苏
2 Pleurotus.nebrodensi白灵菇-beijing 北京
3 Pleurotus.eryngii 杏鲍菇-AA 江苏
4 Pleurotus.eryngii 杏鲍菇-1 江苏
5 Pleurotus.ferulae 阿魏蘑 意大利(GenBank 登录号:AY639942)
1.2　方法
1.2.1　供试菌株线粒体总 DNA提取 。将供试菌株 1、3和 4
号试管菌首先用PDA斜面培养基进行菌丝活化 ,然后接种到
液体培养基中培养 8 d ,获得大量菌丝体;从市场上购买的 2
号供试菌株子实体直接进行试验。根据多次试验 ,最后决定
采取两种方法结合提取供试菌株线粒体总DNA ,首先采取差
速离心法分别获得 4种不同菌株线粒体 ,然后再采用改良的
CTAB法[ 2]提取总的线粒体中的 DNA。
1.2.2　供试菌株 mt SSU rDNA 5′端基因PCR扩增及产物纯
化。以提取出的供试菌株线粒体 DNA 基因组为模板 ,MS1
(5′-CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG )、MS2(25′-GCGGATTA-
TCGAATTAAATAAC )为引物 ,对线粒体小亚基 rDNA 5′端进行
PCR扩增 。
PCR扩增体系是 50.0μl:DNA模板 3.0μl ,PCR buffer 缓
冲液 5.0 μl , dNTP 4.0 μl ,引物MS1和MS2各 2.0 μl , Taq 酶
0.5μl ,加水补齐至 50.0μl。
PCR反应程序为:94 ℃预变性 4 min , 92 ℃变性 2 min ,
48.3 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 1 min , 35个循环;PCR扩增产物
用 1%琼脂糖凝胶电泳进行分析 ,利用 DNA凝胶回收纯化试
剂盒(道普生物科技北京有限公司)进行纯化回收 。
1.2.3　目的基因片断的测序。将纯化回收的PCR扩增产物
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2007, 35(33):10617-10618, 10621　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　李菲菲
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2007.33.047
直接送上海基康生物技术有限公司进行测序。
1.2.4　序列分析。用 BioEdit 6.0.5软件对所测序列进行比
对 ,比较 5个菌株序列间的差异 ,通过DNAstar软件分析序列
的同源性 ,绘制系统进化发生树。
2　结果与分析
2.1　供试菌株线粒体 SSU rDNA 5′端基因序列的获得　用
改良的CTAB 法提取出供试菌株线粒体总DNA基因组 ,以供
试菌株线粒体总DNA为模板 ,MS1、MS2为引物 ,进行 PCR扩
增反应 ,扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳 ,可以见到约为
600 bp的条带(图 1)。
图1　PCR扩增产物
2.2　序列长度及(G+C)百分含量分析　测得的 4种供试
菌株以及从GenBank中下载的 Pleurotus.ferulae长度及(G+
C)百分含量用 BioEdit 6.0.5 软件进行分析 ,结果见表 2。
　　表 2　供试菌株的 mt SSU rDNA 5′端序列长度及(G+C)百分含量
编号 菌株名称 长度∥bp (G+C)百分含量∥%
1 白灵菇-1 586 34.47
2 白灵菇-beijing 600 34.50
3 杏鲍菇-AA 623 34.67
4 杏鲍菇-1 608 34.54
5 阿魏蘑 545 34.13
　　根据表 2数据可知 ,供试菌株线粒体 SSU rDNA5′端基因
序列长度为 545 ～ 623 bp , (G +C)百分含量为 34.13%～
34.67%。通过(G+C)百分含量比较 , 1、2 、3和 4号与 5号菌
株差异很大 ,相差为 0.34%～ 0.54%,而所测 4株菌株之间的
(G+C)百分含量差异在 0.03%～ 0.20%,也就是说 ,这 4种
供试菌株与 5号菌株亲缘关系较远;根据 4株菌株之间的(G
+C)百分含量 ,发现它们之间的差异不大 ,说明菌株之间的
亲缘关系较近 ,但 1和 2号菌株的(G+C)百分含量更接近 5
号菌株 ,说明它们之间的亲缘关系更近 。
2.3　序列的同源性分析　用DNAstar软件分析序列的同源
性 ,其结果见图 2。
　　从图 2可见 ,5号菌株与其他 4种供试菌株序列同源性
差异很大 ,而 4种供试菌株之间的差异并不显著。
2.4　供试菌株系统关系分析　用DNAstar软件绘制供试菌
株的系统进化发生树 ,结果见图 3。
　　从图 3可见 ,5号 ,即 Pleurotus.ferulae与其他 4种亲缘关
系较远 ,而 4种供试菌株之间亲缘关系较近 ,其中 3号和 4号
关系最近 ,属于同一个种 ,即 Pleurotus.eryngii , 1号和 2 号同
属一个种 ,既 Pleurotus.nebrodensis 。同时 ,也说明了 Pleurotus.
nebrodensis是介于 Pleurotus.ferulae和 Pleurotus.eryngii 之间 ,
但三者分属不同的种 , Pleurotus.ferulae与 Pleurotus.nebroden-
sis的亲缘关系要比与 Pleurotus.ferula的亲缘关系更近 。
图 2　供试菌株的 mt SSU rDNA5′端序列的同源性比较
图3　系统进化树
3　结论与讨论
利用 DNA序列鉴定物种之间的亲缘关系是目前分类学
研究的热点 ,无论是在农业还是医学领域 ,都是近年来科研
工作的重点。在核糖体基因组(rDNA)中 ,线粒体中 rDNA是
近年来分子系统学研究的重点 ,核糖体 RNA编码的基因既
存在于核基因组中又存在于线粒体的基因组中 ,蕈菌的核糖
体基因组(rDNA)由于在其序列中包含了丰富的遗传变异信
息 ,近年来成为真菌分子系统学研究的焦点[ 3] 。线粒体中的
SSU rDNA(16S rDNA)序列的核苷进化率比核 18S rDNA进化
率要高 16倍 ,却比 ITS rDNA进化率要低 ,非常适用于在科与
种之间分布的分类单位之间的系统进化关系的分析[ 4] 。
Slippers等[ 5] 通过对 mt SSU rDNA 的序列分析 ,确定了
Amylostereum属中 4个生物学种 Amylostereum.areolatum ,Amy-
lostereum.chailletii , Amylostereum .laevigatum and Amylostereum .
ferreum 之间的进化关系;Patrice等[ 2]通过比较研究侧耳属线
粒体 rDNA的V4 、V6和V9区序列以及其二级结构的差异性 ,
确立了属于 16个生物学种的 48个菌株间的亲缘关系;Bao
等[ 6-7]运用核LSU rDNA 5′端的PCR-RFLP分析和线粒体 SSU
rDNA 5′端序列比较等方法对 12个生物学种之间的系统进化
关系进行了分析 ,结果表明侧耳属中的生物学种都是沿着独
立的系统进化枝进行演化的;通过比较核转录间隔区(ITS)
和线粒体核糖体小亚基(mt SSU rDNA)的可变区 V4 、V6和
V9 ,确定了在不同生境条件的松茸的遗传多样性。
该研究以白阿魏侧耳及其近缘种杏鲍菇 、阿魏侧耳为供
试材料 ,运用分子系统学分析手段 ,测定了供试样品的线粒
体 SSU rDNA 5′端序列 ,通过序列比对和分析 ,发现供试菌株
之间的亲缘关系很近 ,其中白阿魏侧耳与杏鲍菇亲缘关系非
常近 ,同时阿魏侧耳与白阿魏侧耳亲缘关系要比与杏鲍菇的
更近 ,但三者却分别属于不同的种 ,这一结果与卯晓岚[ 8]根
(下转第 10621页)
10618 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2007年
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(上接第 10618页)
据形态及生理特性 ,Rosa等[ 9] 根据微卫星序列标记及 Ur-
banelli等[ 10]根据同工酶及 DNA 指纹技术所得出的白灵菇 、
阿魏蘑 、杏鲍菇三者为不同种的结论相一致。但是 ,mt SSU
rDNA 5′端序列只是基因组序列的一部分 ,还不能反映全部基
因组的信息 ,因此还需研究更多基因序列方面的信息。此
外 ,物种分类和鉴定亲缘关系还必须与物种的各种宏观性状
特征紧密联系 ,这样才能依据客观事实 ,做出最接近真实的
结论。
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