全 文 ：第 28卷 ,第 6期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 8 , No . 6
2 0 1 1年 1 1月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory November , 2 01 1
荧光法测定维药刺糖中氨基酸的含量①
① 新疆维吾尔自治区高校科研计划 ( XJEDU2009S49)
② 联系人 ,电话: ( 0991) 4362471;手机: ( 0) 15909000768; E-mail: gruli104@ hotmai l. com
作者简介:李改茹 ( 1975— ) ,女 ,山西省忻州市人 ,副教授 ,硕士 ,主要从事天然药物分析工作。
收稿日期: 2011-03-08;接受日期: 2011-04-06
李改茹②　常军民　王 岩　吴 晶
(新疆医科大学药学院　乌鲁木齐市新医路 393号　 830054)
摘　要　建立维药刺糖中氨基酸含量测定的荧光分析法。 刺糖经蒸馏水超声提取 ,氨基酸用 0. 1%邻
苯二甲醛衍生化后用荧光分析法测其氨基酸含量。 测定的线性范围为: 3. 0952— 15. 5071μmo l· L- 1
( r= 0. 9990) ,检出限为 9. 70× 10- 7mol· L- 1 ,平均回收率为 93. 6%— 99. 7% , RSD为 1. 9%— 2. 5%。该法
灵敏度高 ,且简便、快捷 ,适用于天然药物中氨基酸的含量测定。
关键词　刺糖 ;氨基酸 ;荧光分析法
中图分类号: O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2011) 06-2965-04
1　引言
刺糖 ( Saccharum Alhagi )为豆科植物骆驼刺 ( Alhagi pseudlhagi. Desv )叶中分泌液凝结而成的
糖粒 ,为一味传统维吾尔医药 [1 ]。在《维吾尔常用药材》中早有记载 ,至今临床仍在使用 ,维吾尔医将
之与其他药材配伍 ,用于治疗痢疾、腹泻、胃脘胀痛、血尿等疾病。 刺糖还具有滋补强壮、精液浓缩、
益精壮阳、涩肠止痛、祛痰止咳的功效 [2 ]。
刺糖中主要成分为糖类、维生素、氨基酸等 ,其中氨基酸含量测定传统方法是用氨基酸自动分
析仪 [3 ]。测定氨基酸的另一方法是荧光分析法 ,尤其是邻苯二甲醛衍生荧光法已用于海水中氨基酸
的含量测定 [4 ]。 本文首次用邻苯二甲醛衍生荧光法测定了维药刺糖中的氨基酸成分 ,该法原理是
U-巯基乙醇为还原剂时 ,邻苯二甲醛与氨基酸类化合物通过环化、缩合反应 ,可形成很强的荧光物
质 ,该物质最大激发波长 (λex )约为 340nm,最大发射波长 (λem )约为 450nm ,荧光强度与氨基酸浓度
成正比。反应式为:
本法简便、快速、灵敏度高 ,是天然药物中氨基酸含量测定的较佳方法 ,为今后进一步对新疆药
用植物资源的开发和利用提供基础研究资料。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
RF-5301PC荧光分光光度计 (日本岛津公司 ) ; TP-114万分之一电子天平 (德国赛多利斯公
司 )。
氨基酸对照品 (中国药品生物制品检定所 ,供含量测定用 ,批号: 140624-200805) ;刺糖 (购于维
药市场 ,批号: 20091221) ;维药制剂刺蜜颗粒 (新疆乌鲁木齐市民族医院 ,批号 1002) ;邻苯二甲醛、
U-巯基乙醇 (天津市光复精细化工研究所 , AR) ;其余试剂均为分析纯。 实验用水为二次重蒸水。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　磷酸盐缓冲溶液 ( pH= 8. 0)和硼酸缓冲溶液 ( pH= 9. 5)的制备
准确称取磷酸二氢钾 2. 2695g于烧杯中 ,用少量水溶解后 ,转入 250mL容量瓶中 ,用水稀释至
刻度 ,摇匀。同法称取磷酸氢二钠 2. 9675g用水溶解并定容至 250mL。 取上述配好的磷酸二氢钾
10. 0 mL与磷酸氢二钠 190. 0mL混合均匀即得 pH 8. 0的磷酸缓冲溶液。
准确称取硼酸 2. 5g溶于水并稀释至 100mL,再用 2mol /L NaOH溶液调 pH至 9. 5。
2. 2. 2　 0. 1%邻苯二甲醛衍生化试剂 ( O PA)的制备
称取 50mg邻苯二甲醛 ,加入 1mL无水乙醇使其完全溶解 ,再加入 19mL pH 9. 5的硼酸缓冲
溶液和 200μLU-巯基乙醇 ,混匀 ,用硼酸缓冲液稀释至 50mL, 4℃冰箱保存 ,保存期两天。
2. 2. 3　氨基酸对照品溶液的制备
准确称取苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸对照品适量 ,分
别置于 8个容量瓶中 ,各加水制成每毫升含 0. 2mg的溶液 ,即得对照品溶液。
2. 2. 4　氨基酸荧光衍生物的制备
准确吸取氨基酸对照品溶液 1. 0mL于 10mL具塞试管中 ,依次加入 pH 8. 0磷酸盐缓冲溶液
2. 0mL和 0. 1%邻苯二甲醛衍生化试剂 2. 0mL,用水定容至刻度 ,暗处反应 30min,待测。
2. 2. 5　供试品溶液的制备
准确称取刺糖 2. 0g ,置于 50mL烧杯中 ,加入水 20mL,常温下超声处理 30min,过滤 ,收集滤
液 ,同法用 10mL水对滤渣进行提取 ,合并滤液 ,用水定容至 50mL,即得样品溶液。准确移取该样品
溶液 5mL至 50mL容量瓶中 ,用水定容至刻度 ,待测。
2. 2. 6　氨基酸含量测定
在激发波长λex= 352nm,发射波长λem= 451nm的条件下测定亮氨酸衍生物标准系列的荧光强
度 ,绘制校准曲线。然后在上述相同的条件测定样品的荧光强度 ,再用回归方程求取含量。
3　结果与讨论
3. 1　 8种氨基酸荧光衍生物的荧光激发和发射光谱
按“ 2. 2. 4”项下方法制得上述氨基酸荧光衍生物 ,上机扫描 ,结果见表 1。 8种氨基酸荧光衍生
物最大激发波长在 343— 356nm ,最大发射波长在 448— 456nm。考虑到荧光发射波长不受激发波
长的影响 ,故本文以亮氨酸为对照品选择λex= 352nm,λem= 451nm为测定波长。
2966 光谱实验室 第 28卷
表 1　氨基酸荧光衍生物最大激发和发射波长 ( nm)
苯丙氨酸 蛋氨酸 亮氨酸 赖氨酸 色氨酸 苏氨酸 缬氨酸 异亮氨酸
λex 345 348 352 353 343 356 355 348
λem 451 448 451 456 456 451 453 451
3. 2　测定条件的选择
图 1　 pH值对亮氨酸衍生物荧光强度的影响
3. 2. 1　溶液酸度的影响
为了考察溶液 pH对氨基酸衍生物荧光强度的影
响 ,分别在“ 2. 2. 3项”下 8种氨基酸中加入不同 pH值
的磷酸盐缓冲溶液 ,进行衍生化反应 ,暗处反应 30min
后测其荧光强度。 实验结果表明 ,当 pH值等于 8. 0时 ,
荧光强度较大 (如图 1所示 ) ,且趋于稳定。 所以本文选
用 pH值为 8. 0的磷酸盐缓冲液控制衍生化酸度。
3. 2. 2　衍生化时间的影响
取亮氨酸对照品 1mL于 10mL试管中 ,在上述实验
条件下进行衍生化反应 ,记录荧光强度随衍生化时间的
变化。实验结果表明 ,反应时间为 10min时 ,亮氨酸荧光
强度达最大值 ,之后略有下降 ,但 30min后趋于稳定 (如
图 2　衍生化时间对亮氨酸荧光强度的影响
图 2所示 ) ,故本文选择衍生化反应的时间为 30min。
3. 2. 3　 OPA加入量的影响
取亮氨酸对照品 1mL于 10mL试管中 ,在上述实验
条件下加入不同体积的衍生化试剂 ,进行衍生化反应 ,
暗处反应 30min测其荧光强度。实验结果表明 ,当衍生
化试剂用量大于 1mL时 ,荧光强度达最大且趋于稳定
(如图 3所示 ) ,说明荧光反应已进行完全。 为了使反应
更彻底 ,本文选择 0. 02% OPA加入量为 2. 0mL。
3. 3　校准曲线及方法的检出限
在选定的最佳实验条件下 ,按“ 2. 2. 4项”配制不同
浓度的亮氨酸对照品 ,对线性范围进行考察。 实验结果
图 3　 OPA加入量对亮氨酸荧光强度的影响
表明 ,荧光强度与亮氨酸浓度在 3. 1— 15. 51μmol· L- 1
具 有 良 好 的 线 性 关 系 , 回 归 方 程 为
y= 6. 5777x - 3. 0157,式中: y—— 荧光强度 , x—— 亮
氨酸浓度 (μmol· L- 1 ) ,相关系数 r= 0. 9990,说明衍生
物荧光强度与亮氨酸浓度线性显著相关。 以 S /N > 3
计 ,方法检出限为 9. 70× 10- 7mol· L- 1。
3. 4　回收率实验
称取已知含量的刺糖样品 (批号: 20091221)共 9
份 ,每份约 1g ,准确称定 ,按低 ( 0. 8μg· mL- 1 )、中
( 1. 6μg· mL- 1 )、高 ( 4. 8μg· mL- 1 )浓度分别准确加入
亮氨酸对照品溶液 2. 0、 4. 0、 12. 0mL,每个浓度平行 3
份 ,按“ 2. 2. 5项”下进行处理得所需溶液 ,用上述实验
方法进行测定并计算回收率 ,实验结果见表 2。 平均回收率为 93. 6%— 99. 7% , RSD为
1. 9%— 2. 5% (n= 3)。
2967第 6期 李改茹等:荧光法测定维药刺糖中氨基酸的含量
表 2　刺糖回收率实验结果 (n= 3)
序号 加样量 ( mg) 测得量 ( mg ) 回收率 (% ) 平均回收率 (% ) RSD(% )
1 0. 4 0. 3728 93. 2
2 0. 4 0. 3824 95. 6 93. 6 1. 9
3 0. 4 0. 3684 92. 1
4 0. 8 0. 8096 101. 2
5 0. 8 0. 7833 97. 9 99. 7 1. 3
6 0. 8 0. 7992 99. 9
7 2. 4 2. 3208 96. 7
8 2. 4 2. 3808 99. 2 96. 7 2. 5
9 2. 4 2. 2632 94. 3
3. 5　样品测定
用上述实验方法测定了维药原药材刺糖 (批号: 20091221)和维药制剂刺蜜颗粒 (批号: 1002)中
氨基酸的含量 ,原药材刺糖中游离总氨基酸为 0. 9163mg· g- 1 ,维药制剂刺蜜颗粒中游离总氨基酸
为 0. 6534mg· g- 1 ,实验结果见表 3。 制剂中游离总氨基酸略低于原药材 ,是因为在制剂工艺过程
中部分氨基酸不稳定或损失所致。
表 3　样品测定结果表 (n= 5)
样品 含量 ( mg /g) 平均含量 ( mg /g)
刺糖药材 0. 9128 0. 9223 0. 9132 0. 9198 0. 9136 0. 9163
刺蜜颗粒 0. 6554 0. 6542 0. 6499 0. 6530 0. 6544 0. 6534
4　结论
本文建立了维药刺糖中总游离氨基酸含量测定的荧光分析法 ,考察了 pH、O PA用量、衍生化
时间等实验条件对氨基酸衍生物荧光强度的影响。该法操作简单 ,快速准确 ,测定灵敏度高 ,检出限
达 9. 70× 10- 7mol· L- 1 ,是天然药物中氨基酸含量测定的较佳方法。
参考文献
[1 ]李君山 ,刘勇民 ,蔡少青等 .维吾尔医用骆驼刺类药材的资源、商品流通及民间应用研究 [ J] .中国民族医药杂志 , 1996, 2( 2):
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Determination of Amino Acid in Saccharum Alhagi
from Uygur Medicine by Fluorimetry
LI Gai-Ru　 CHANG Jun-Min　WANG Yan　WU Jing
(College of Pharmacy ,X inj iang Medical University ,Urumqi 830054,P . R.Ch ina )
Abstract　 The method fo r the determination of the content of amino acid in Saccharum alhagi
f rom uygur medicine was established by f luorimetry. Amino acid was ex tracted f rom Saccharum alhagi
by ult rasound w ith disti lled w ater, and determined by fluorimetry af ter derived by 0. 1%
orthophthalaldehyde ( OPA) . The linea r range w as 3. 0952— 15. 5071μmol· L- 1 (r= 0. 9990) . The
detection limit w as 9. 70× 10- 7mol· L- 1 . The average recoveries of samples were 93. 6%— 99. 7%
w ith RSD in the range of 1. 9%— 2. 5% . The method is simple, rapid and high sensitiv ity , which can
be used for the determination of the contents of amino acids in natural drugs.
Key words　 Saccharum Alhagi; Amino Acids; Fluorometry
2968 光谱实验室 第 28卷