全 文 ： 第 27 卷第 3 期 长 春工 业大 学学 报(自然科学版) Vol. 27 , No . 3
2006 年 9 月 Journal o f Changchun Univ ersity of Techonolog y(Na tur al Science Edition) Sep. 2006
文章编号:1006-2939(2006)03-0201-03
粪鬼伞深层发酵培养的研究
邱芳萍 , 张 菁 , 解丛林
(长春工业大学 生物工程学院 , 吉林 长春 130012)
摘 要:采用深层发酵培养粪鬼伞菌丝体。重点讨论影响粪鬼伞菌丝体生物量生长的主要因素 , 确定了深层
发酵培养的最适条件。
关键词:粪鬼伞;深层发酵;生物量
中图分类号:TQ92 文献标识码:A
粪鬼伞(Coprinus sterqulinus Fr.), 也叫粪
生鬼伞 ,其分类地位为伞菌目 、鬼伞科 、鬼伞属。
春秋季于粪堆上散生至群生。该菌幼嫩时可食
用 ,成熟后菌盖自溶成墨汁状 。
人工栽培的子实体 ,生长周期长且易受到病
虫害等因素的影响 。因此 ,利用食药用菌在培养
液中快速生长的特点 ,改变过去从子实体中提取
有益成分的做法 ,直接从发酵液中提取诸如多糖 、
氨基酸等代谢产物是目前研究的热点。深层发酵
培养是将纯种微生物接种于含有适当营养成分的
灭菌液体培养基内 ,在一定的温度 、气体条件下进
行培养 ,具有生产效率高 、周期短 、产品均匀等优
点[ 1] 。深层发酵的产品是食药用菌的菌丝体 ,营
养价值一般高于消耗营养阶段的子实体 ,药用价
值也与之相似[ 2] 。文中研究了粪鬼伞深层培养的
条件 ,为今后粪鬼伞发酵产品的开发奠定了基础。
1 材料和方法
1. 1 供试菌种
菌种由吉林大学生物技术研究所提供。
1. 2 斜面培养基
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA) 。
1. 3 培养方法
(1)菌种活化:将菌种用接种针接入斜面培养
基上 ,28 ℃恒温培养 3 d。
(2)种子瓶培养:从活化菌种中取 2 至 3块
0. 5 cm 2的斜面培养基 ,接入装有按下面方法配制
的种子培养液 50 mL 于 250 mL 三角锥形瓶中 ,
置 130 r /min 的旋转式摇床 ,在 28 ℃恒温培养
48 h ,经显微镜检验 ,无杂菌污染。
(3)液体培养:将培养好的种子以 10%～
15%的量接入盛有与种子培养液同样组分的发酵
培养基中 ,置旋转式摇床 ,接通 130 r /min , 28 ～
30 ℃培养 120 h 。每种液体培养基每批配制三
瓶 ,培养三批 ,结果取所得菌丝生物量的平均值。
1. 4 测试方法
菌丝干重的测试[ 3] 发酵结束后 ,将发酵液离
心分离(3 500 r /min ,15 min)弃上清取菌丝 ,将菌
丝体经蒸馏水冲洗后 ,按上述方法离心弃上清 ,测
菌丝体鲜重为生物量。然后置 60 ℃的干燥箱中 ,
烘干至恒重 ,电子天平称菌丝体干重。
2 结果与讨论
2. 1 发酵培养基的筛选
2. 1. 1 最佳碳源的筛选
碳源是发酵培养基的基础 ,它既能被菌丝利
用合成细胞结构 ,又是菌丝产生各种代谢产物和
细胞贮藏物质的主要原料[ 4] 。在基础培养(0. 1%
KH 2PO 4 , 0. 1% MgSO 4 7H2O , 0. 5%酵母粉 ,
1%牛粪水)中 ,分别加入廉价易得的葡萄糖 、蔗
糖 、麦芽糖 、玉米淀粉和小麦粉 5种碳源 ,其质量
分数均为 1%。经 120 h深层发酵培养 , 5种碳源
的培养基中都有菌丝生长 ,以葡萄糖 、蔗糖作为碳
源培养出来的菌丝球最好 ,菌丝球均匀细小 。玉
米淀粉和小麦粉为碳源培养的菌丝上有糊状附
着 ,不好分离。
收稿日期:2005-12-20
基金项目:吉林省科技厅科学基金资助项目(200504305)
作者简介:邱芳萍(1955 -),女 ,吉林长春人 ,长春工业大学教授 , 理学博士 ,主要从事生物技术研究 .
DOI牶牨牥牣牨牭牴牪牫牤j牣cnki牣cn牪牪牠牨牫牳牪牤t牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牥牰
不同碳源对菌丝体生物量见表 1 。
表 1 不同碳源对菌丝体生物量(g /100 mL)
碳源 葡萄糖 蔗糖 果糖 玉米淀粉 小麦粉
生物量 1. 03 0. 88 0. 72 0. 56 0. 49
注:S=0. 22。
从表 1可看出 ,粪鬼伞深层发酵培养以葡萄
糖 、蔗糖作为碳源效果最好 ,然后 ,依次为果糖 、玉
米淀粉 、小麦粉 。考虑灭菌条件的限制 ,最佳碳源
选择蔗糖 。
2. 1. 2 最佳氮源的筛选
氮源是食用菌细胞合成蛋白质和核酸必不可
少的主要原料[ 4] 。在基础发酵培养基中加入 1%
的蔗糖 ,然后分别加入 1%的脱脂豆粉 、硫酸铵 、
小麦粉 、麦麸 、牛肉膏作为氮源 。经 120 h 深层发
酵培养 ,以脱脂豆粉 、麦麸为氮源培养的粪鬼伞菌
丝球均匀 、细小。以硫酸铵 、小麦粉 、牛肉膏作为
氮源的培养基中未见有明显的菌丝生长 。
不同氮源对粪鬼伞菌丝体生物量的影响见表
2。
表 2 不同氮源对粪鬼伞菌丝体生物量(g /100 mL)
氮源 脱脂豆粉 硫酸铵 小麦粉 麦麸 牛肉膏
生物量 1. 76 0. 27 0. 52 1. 68 0. 35
注:S=0. 74。
从表 2可知 ,粪鬼伞深层发酵培养有机氮源
明显优于无机氮源 ,脱脂豆粉最好 ,其次为麦麸。
2. 1. 3 无机盐选择
各种微生物在生长繁殖和产生代谢产物中 ,
需要无机盐和微量元素作为酶的激活剂 ,生物活
性物质的组成或生理活性作用的调节剂 ,磷酸盐
是所有微生物生长所必需的[ 5] 。试验选用
KH2 PO 4 和 K 2HPO4 两种无机盐。无机盐在较
低浓度时 ,对细胞生长和产物合成有促进作用 ,而
在高浓度时常表现出显著的抑制作用[ 6] ,所以 ,在
下面的正交实验中 ,把无机盐作为一个重要的因
子设计了 3个浓度水平 ,摸索有利于粪鬼伞菌丝
生长的最适浓度 。
2. 1. 4 培养基的优化
根据上面的实验结果 ,以蔗糖为碳源 ,脱脂豆
粉和麦麸为氮源 , KH 2PO 4 和 K2HPO 4 为无机
盐 ,设计 L 9(34)正交实验表 ,以确定培养基的最
佳组合。9个组合 3次重复 ,以 1. 3 培养方法中
(2),(3)所述方法进行深层发酵培养 ,根据菌丝体
生物量 ,确定最佳发酵培养基组合 。
表 3 因素和水平的选择(单位:%)
水平 因素 A蔗糖 因素 B脱脂豆粉 因素 C麦麸 因素 DKH 2PO4
因素 D
K2 HPO 4
1 0. 5 0. 5 0. 5 0. 5 0. 5
2 0. 75 1. 0 0. 75 0. 75 0. 75
3 1. 0 1. 5 1. 0 1. 0 1. 0
表 4 正交实验结果及级差分析
实验编号 因素A 因素 B 因素C 因素D 菌丝体生物量(g /100mL)
1 1 1 1 1 2. 16
2 1 2 2 2 1. 93
3 1 3 3 3 1. 66
4 2 1 2 3 2. 31
5 2 2 3 1 1. 84
6 2 3 1 2 1. 98
7 3 1 3 2 2. 04
8 3 2 1 3 1. 87
9 3 3 2 1 1. 53
K 1 5. 75 6. 51 6. 01 5. 53
K 2 6. 13 5. 64 5. 77 5. 95
K 3 5. 44 5. 17 5. 54 5. 84
L 1 1. 92 2. 17 2. 00 1. 84
L 2 2. 04 1. 88 1. 92 1. 98
L 3 1. 81 1. 72 1. 85 1. 95
R 0. 23 0. 45 0. 15 0. 11
注:影响顺序 B>A>C>D。
根据表 1 ～ 表 4 的结果得出 ,粪鬼伞的最佳
培养基组合为:1%蔗糖 , 1. 5%脱脂豆粉 , 1%麦
麸 , 0. 5% KH 2PO 4 , 0. 5% K 2HPO4 , 0. 1%
MgSO 4 7H 2O ,0. 5%酵母粉 ,1%牛粪水。
2. 2 发酵条件的选择
按照上面总结的粪鬼伞最佳培养基组合制备
培养基 ,重复 1. 3培养方法中(2),(3)步骤 ,摸索
最佳培养条件 。
2. 2. 1 培养基起始 pH 值对菌丝产量的影响
将培养基配成溶液后 ,调 pH 值至 1 ～ 12的
范围 ,接 10%液体菌种 ,振荡 6 d ,进行二级发酵。
pH 值对菌丝体生长的影响如图 1所示。
图 1 pH 值对菌丝体生长的影响
从图 1中可以看出 ,粪鬼伞的 pH 值在 3 ～ 8
202 长 春 工 业 大 学 学 报(自然科学版) 第 27 卷
内都能生长 ,pH 值为 6 ～ 7时最适宜。
2. 2. 2 通气量对菌丝产量的影响
粪鬼伞是嗜氧菌 , 因此 , 需讨论发酵过程中
通气状况对菌丝生长状况的影响 , 而装液量的多
少将直接影响培养基的通气状况 。若装液量过
大 , 则影响通气 , 菌丝缺氧而生长缓慢 , 通气过
多 ,菌体过度生长 ,反而影响菌球数量 ,使菌丝干
重减少[ 5] 。在 250 mL 三角锥形瓶中分别按下表
所示装量。移 5%～ 10%液体菌种进行试验 ,其
影响见表 5。
表 5 通气量对菌丝体生长的影响(g /100 mL)
装液量 /m L 30 40 50 60 70
生物量 1. 83 2. 21 2. 53 2. 60 2. 56
装液量 /m L 80 90 100 110
生物量 2. 47 2. 31 2. 19 1. 98
注:S=0. 38。
由表 5可以看出 ,在粪鬼伞菌丝发酵过程中 ,
装液量为 50 ～ 80 mL 时 ,菌丝生长的情况最好 ,
得率最高 。选择装液量为 60 mL 。
2. 2. 3 接种量对菌丝产量的影响
为了选择最佳接种量 , 用 2%, 5%, 10%,
15%,20%这 5个接种量进行实验 ,见表 6 。
表 6 接种量对菌丝体生长的影响(g /100 mL)
接种量 /% 2 5 10 15 20
生物量 2. 29 2. 32 3. 03 3. 27 3. 52
注:S=0. 56。
由表 6可以看出 ,随着接种量增加 ,生物量也
逐渐提高 。当接种量由 2%增加到 10%时 ,生物
量提高 32. 3%,接种量从 10%增加到 20%时 ,生
物量再提高 16%。接种量以 20%较为理想 。
3 结 论
研究结果表明 ,粪鬼伞深层发酵最佳培养基
可选用 1. 5%脱脂豆粉 , 1%蔗糖 ,1%麦麸 ,0. 5%
KH 2PO 4 , 0. 5K2HPO 4 , 0. 1% MgSO 4 7H2O ,
0. 5%酵母粉 , 1%牛粪水 。粪鬼伞发酵 pH 值在
6 ～ 7之间最适生长 ,接种量为 20%。
首次报道了粪鬼伞的菌丝体的人工深层培养
技术 , 确定了深层发酵的各种条件 ,为进一步进
行商业化研究和药用活性培养成分的提取和开发
奠定了理论基础。
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Study on submerged fermentation of corpr inus sterqulinus Fr.
QIU Fang-ping , ZHANG Qing , XIE Cong-lin
(S chool of Biological E ngineering , Changchun Universi ty of Technology , Changchun 130012 , China)
Abstract:Corprinus sterqulinus Fr. Mycelium had been cultiv ate w ith the method of submerged
fermentation. The inf luential facto rs relating to i ts g row th are studied to determine the optimum
condi tions fo r the submerged fermentation.
Key words:corprinus sterqulinus Fr;submerged fermentation;mycelium .
203第 3 期 邱芳萍 ,等:粪鬼伞深层发酵培养的研究