全 文 ：白背叶叶中总黄酮含量的测定
桂劲松 ,韦汉燕 ,戴　平 ,朱开梅
(桂林医学院药学院 ,广西 桂林 541004)
摘要: 目的: 探索白背叶叶总黄酮的最佳提取方法 ,并建立白背叶叶提取物中总黄酮含量的测定方法。方法: 利用 NaNO2
- Al( NO3 )3- NaOH显色、分光光度法测定白背叶叶中黄酮类物质含量 ,检测波长为 510nm。结果: 芦丁检测浓度在 0. 004～
0. 02mg m L- 1范围内与吸光度线性关系良好 ( r = 0. 9998) ,加样平均回收率为 100. 15% , RSD= 1. 01% ( n= 5) ,用乙醇提取法
提取的叶中总黄酮含量可达到 0. 024% 。结论:本方法简便、快速、准确 ,而且对仪器设备的要求不高 ,操作简单易行 ,适用于黄
酮类物质的含量测定。
关键词: 分光光度法 ;白背叶叶 ;黄酮含量
中图分类号: R927. 2　文献标识码 : A　文章编号: 1008- 0104( 2009) 03- 0024- 02
　 　白背叶为大戟科植物白背叶 Mallo tus apelta ( L our )
Muell- Arg 的干燥叶 ,为广西民间常用草药 ,具清热、利湿、
止痛、解毒、止血之功效 ,主治淋浊、胃痛、口疮、痔疮、溃疡、
跌打损伤、蛇咬伤、外伤出血等症 [1]。药理实验表明 ,以白背
叶的叶为主的复方醇提取物对大鼠实验性胃溃疡有明显的
抑制作用 [2 ]。这一复方的临床观察表明 ,对急性胃、十二指肠
出血的临床治愈率达 94. 1% [3]。
黄酮类化合物提取时多采用水、甲醇、体积分数 70%乙
醇作溶剂 ,用乙酸乙酯作萃取剂。本文以芦丁作为对照品 ,采
用紫外可见光分光光度法对背叶叶总黄酮含量的测定方法
进行探讨 ,旨在建立一套简便、快速、准确的方法 ,为充分利
用我国丰富的白背叶资源、进一步研究和开发白背叶医药保
健品提供参考。
1　 实验材料
1. 1　 试剂
白背叶 (桂林市郊雁山采集 );芦丁对照品 (国家药品生
物制品检定所制 ) ;石油醚 ,乙酸乙酯 , 95%乙醇 ,亚硝酸钠 ,
硝酸铝 ,氢氧化钠 ,三氯化铝 ,氨水 ,盐酸等 (以上试剂均为分
析纯 )。
1. 2　 主要仪器
722可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司 ) ;
JA1003电子天平 (上海天平仪器厂 ); RE- 52旋转蒸发仪 (上
海安亭实验仪器有限公司 ) ;离心沉淀机 (上海医用分析仪器
厂 ) ;微波真空干燥机 (贵阳新奇微波工业有限责任公司 ) ;
SG3300H超声波清洗仪 (上海冠特超声仪器有限公司 )。
2　 方法
2. 1　 白背叶粗黄酮的提取
2. 1. 1　 水提取法
取干燥白背叶粗粉 500g ,加 5000m L蒸馏水浸泡 30min,
加热提取 2h ,过滤 ,滤渣加 4000m L蒸馏水加热提取 1h,过滤 ,
收集滤液 ,合并两次滤液。离心 ( 3000r min- 1 , 15min) ,抽滤 ,
除去叶绿素等杂质 ,滤液为微波真空浓缩至稠状 ,加适量的
石油醚萃取两次 ,除去叶绿素、脂类 ,弃醚相 ,水相用适量的
乙酸乙酯萃取两次 ,收集乙酸乙酯层 ,回收乙酸乙酯。加热浓
缩至粘稠状 ,干燥 ,称重 ,所得粗黄酮为样品Ⅰ ,计算白背叶
粗黄酮的产率 ,约为 0. 008% 。
2. 1. 2　 乙醇提取法
取干燥白背叶粗粉 500g ,加 5000m L70%乙醇浸泡
30min,加热回流提取 2h ,过滤 ,滤渣再加 4000m L 70%乙醇
加热回流提取 1. 5h ,过滤 ,收集滤液 ,合并两次滤液 ,减压回
收乙醇 ,离心 ( 3000r min- 1 , 15min) ,过滤 ,除去沉淀析出物 ,
滤液加热浓缩至稠状 ,加适量的石油醚萃取两次 ,除去叶绿
素、脂类 ,弃醚相 ,水相用适量的乙酸乙酯萃取两次 ,收集乙
酸乙酯层 ,回收乙酸乙酯。加热浓缩至粘稠状 ,干燥 ,称重 ,所
得粗黄酮为样品Ⅱ ,计算白背叶粗黄酮的产率 ,约为 0. 13% 。
2. 1. 3　 改进的乙醇提取法
取干燥白背叶粗粉 500g ,加 70%乙醇 5000m L,于 85℃水
浴回流 2h,冷却过滤 ,滤渣再加 70%乙醇 4000m L,于 85℃水
浴回流 1. 5h ,冷却过滤 ,合并两次滤液 ,旋转蒸发仪减压回收
乙醇 ,浓缩液加 20% NaOH调 p H为 9～ 10左右 ,搅匀 ,静置
1h ,抽滤 ,滤液用半倍量的石油醚萃取两次 ,水相加 15% HCl
调 pH为 5～ 6,搅匀 ,沉淀 0. 5h,离心 ( 3000r min- 1 , 15min) ,
抽滤 ,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取 3次 ,合并 3次乙酸乙酯
相 ,减压回收乙酸乙酯 ,最后干燥得粗黄酮。该法所得粗黄酮
为样品Ⅲ ,计算白背叶粗黄酮的产率 ,约为 0. 21% 。
2. 2　 黄酮的定性鉴别
经紫外光下呈色反应 ,浓氨水反应 ,三氯化铝反应 ,乙酸
镁反应 , 盐酸 - 镁粉反应 ,均为阳性反应 ,表明白背叶提取
物中含有黄酮。
2. 3　 芦丁对照品标准曲线的绘制
2. 3. 1　 对照品溶液的制备
准确称量于 105℃下干燥至恒重的芦丁对照品 10mg ,置
于 100mL容量瓶中 ,加 60%乙醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即
得浓度为 100μg m L- 1的芦丁对照品溶液。
2. 3. 2　 标准曲线的绘制
分别量取 0、 1. 0、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 5. 0mL对照品溶液 ,置于
25m L容量瓶中 ,分别加 1% NaNO2溶液 3. 0mL ,摇匀 ,放置
6min,加 1% Al( NO3 )3溶液 3. 0m L,摇匀 ,放置 6min,加 1%
NaOH溶液 4m L,加 60%乙醇稀释至刻度 ,摇匀 ,放置 15min,
得对照品待测液 ,在 510nm波长处用可见紫外分光光度计测
定吸光度。
C = 0. 0941A + 0. 0003, r = 0. 9998( n= 5) ,
实验表明 ,芦丁在检测浓度在 0. 004～ 0. 02mg mL- 1范
围内与吸光度线性关系良好。
2. 4　 白背叶总黄酮含量测定
2. 4. 1　 供试品溶液的配制
转移样品Ⅲ干燥粉末 ,加入 60%乙醇定容到 100m L,超
声溶解 30min,摇匀 ,静置 ,冷却至室温 ,吸取上清夜 ,即得供
试品溶液。
2. 4. 2　 供试品溶液的含量测定
精密吸取供试品溶液 1. 0m L,共 5份 ,分别置于 100m L容
量瓶中 ,按照 2. 3. 2项下的方法操作 ,得供试品待测液 ,分别
测定吸光度 ,根据芦丁标准曲线方程得到供试品待测液中总
黄酮的浓度 ,计算白背叶提取物总黄酮的含量。含量计算公
式为: 含量% = (供试品待测液中总黄酮的质量 /500g )×
100% 。
2. 5　 测定方法的考察
2. 5. 1　测定波长的选择
精密吸取供试品溶液 1. 0m L置于 100m L容量瓶中 ,按
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照 2. 3. 2项下的方法操作 ;同法用 60%浓度的乙醇作空白 ,在
300～ 600nm范围进行扫描。供试品溶液和芦丁对照品溶液
在 510nm处均有最强吸收峰 ,而空白溶液在相同的位置无吸
收峰。故选定 510nm为测定波长。
2. 5. 2　 精密度实验
精密吸取供试品溶液 1. 0m L,共 5份 ,分别置于 100m L容
量瓶中 ,按照 2. 3. 2项下的方法平行操作 ,连续测定 5份试液
的吸收度。RSD= 0. 84% 。
2. 5. 3　 重复性实验
精密吸取供试品溶液 1. 0m L,共 5份 ,分别置于 100m L容
量瓶中 ,按照 2. 3. 2项下的方法操作 ,分别测定吸光度。RSD
= 0. 99% 。
2. 5. 4　 稳定性实验
精密吸取供试品溶液 1. 0mL ,置于 100m L容量瓶中 ,按
照 2. 3. 2项下的方法操作 ,分别测定吸收度分别于 0min、
30min、 60min、 90min、 120min测定吸光度。结果 120min内测
得吸收度的 RSD= 2. 737% ,表明在 120min内完成测定时结
果准确、稳定。
2. 5. 5　加样回收率
实验精密吸取供试品溶液 1. 0mL ,共 5份 ,分别置于
100m L容量瓶中 ,分别加入芦丁标准液适量 ( 10mL ) ,按照
2. 3. 2项下的方法操作 ,分别测定吸光度 ,计算回收率 ,回收
率计算公式为: 回收率= (加入芦丁后测得的总黄酮的量 -
样品中总黄酮的量 ) /芦丁标准品加入量× 100% 。由芦丁标
准曲线计算含量 ,根据公式计算回收率 ,得到平均回收率为
100. 15% , RSD= 1. 0% ( n= 5) ,说明该方法系统误差较小 ,
准确度较高。
3　结果
本课题组就几种不同提取方法所得的白背叶粗黄酮样
品 ,对其总黄酮的含量平行测定三次 ,取平均值 ,结果发现按
照改进的乙醇提取法所得的粗黄酮产率及其总黄酮含量均
为最佳。测定结果见表 1。
表 1　白背叶粗黄酮产率及其总黄酮含量 (% )
提取方法 粗黄酮产率 总黄酮含量
水提取法 (样品Ⅰ ) 0. 08 0. 0018
乙醇提取法 (样品Ⅱ ) 0. 13 0. 0123
碱溶酸沉法 (样品Ⅲ ) 0. 21 0. 0240
4　讨论
白背叶总黄酮提取可采用许多方法 ,采用了水提取法、
乙醇提取法、改进的乙醇提取法。结果表明 ,改进的乙醇提取
法 ,增加了碱溶、酸沉两步的乙醇提取法优于其它方法 ,粗黄
酮产率及总黄酮含量皆为最高。白背叶黄酮类物质在碱性环
境中易溶 ,碱溶是为了让尽可能多的黄酮溶解 ,防止在回收
乙醇步骤让黄酮类物质随杂质析出而滤去 ;酸沉一是为除杂
质 ,二是让黄酮类分子游离出来 ,利于乙酸乙酯萃取。而且本
方法简便 ,试剂易购 ,便于操作 ,对环境污染小。石油醚提取
液经黄酮定性反应为阴性 ,说明脱脂不会造成黄酮损失。本
实验采用紫外可见光分光光度法测定白背叶叶中总黄酮含
量 ,操作简单易行 ,线行关系良好 ,结果稳定可靠。在我国鹅
白背叶分布广泛 ,资源丰富 ,药用价值比较高。本实验对其含
量测定做了初步的研究 ,有利于白背叶的进一步开发与利
用 ,以便充分利用天然植物资源。
参考文献:
[ 1 ]广西卫生局 .广西中药材标准 (白背叶 ) [M ] .第 2册 .南宁:广西
科技出版社 , 1992
[ 2 ]Xie J X, Lin Q Y, Wang Q W , et al. Pharmacological study on
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1994, 17( 2) : 45- 49
[3 ] Fan X M , Wang R Q, Xie J X, et al. Clinical and experimen- tal
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hemorrhage[ J] . J Emerg Syndromes Tradi t Chin Med, 1993, 2( 5):
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[4 ]孟志芬 ,董彩霞 ,吕丹丹 .毛泡桐花中总黄酮的含量测定及提取工
艺研究 [ J].光谱实验室 , 2008, 25( 2): 273- 776
(收稿日期: 2008- 12- 11)
作者简介: 桂劲松 ( 1977～ )男 ,河北遵化人 ,硕士研究生 ,讲师。
The content determination of total flavones in Mallotus apelta leaf
GUI J in- song ,WEI Han- yan, DA I Ping , Z HU Kai- mei
( Department of Ph armacy of Gui lin M edical College, Guilin 541004, China)
Abstract: Objective: To explo re the optimal method of ex t racting total flavones in Mallotus apelta leaf , and
establish the method for the content determination of total flav ones in Malotus apelta leaf ext racts. Methods:
The NaNO2- Al( NO3 ) 3- NaOHvisible ligh t sepct rophotometry w as adopted in the determination w ith the de-
tection wavelength of 510 nm. Results: There w as good linear relationship wi th the abso rbability when the de-
tect concentration of rutin w as w ithin a range f rom 0. 004 to 0. 03g mL- 1 ( r = 0. 9998) , and the average recov-
ery w as 100. 15% , RSD= 1. 01% ( n= 5) . The total flavones in the Mallotus apelta leaf by alcohol could achieve
0. 024% . Conclusion: The method is simple, rapid and accurate. The requirement of equipment is not st rict, and
the manipulation is very easy. The method is suitable for the content determination of the f lav ones material.
Key words: sepct rophotometry; Mallotus apelta leaf; total f lav ones; content
·25·HEILONGJIAN G MEDICINE AND PHARMACY Jun. 2009, Vo l. 32 No. 3