全 文 ：·华夏医学掠影·
白背叶根对肝纤维化大鼠的实验研究
赵进军 ,吕志平 ,张绪富(第一军医大学中医系 ,广东 广州 510515)
Experimental Study on the Root of Mallotus Apelta(Lour.)Muell.-Arg.in
Rats with Liver Fibrosis
ZHAO Jin-jun , LU Zhi-ping , ZHANG Xu-fu(Department of Tradi tional Chinese Medicine , The First
Military Medical University , Guangzhou 510515 , China)
Abstract:Objective To investigate the effect of the root of M allo tus apelta(Lour.)Muell.-Arg.in the pre-
vent ion and the t reatment of liver fibrosis through the rat model , and to discuss its mechanism.Method
Liver f ibrosis rat model w as prepared w ith 40%CCl4 in peanut oil.A series of items in the blood were de-
tected , including ALB , GLB ,ALT ,AST , HA , LN , P ⅢC and Collagen Ⅳ.The changes of the liver tissue
w ere observed too.Results The serum levels of GLB ,ALT ,HA ,LN and Collagen Ⅳ decreased significant-
ly ,while the deg rees of liver inf lammation and collagen f ibers proliferation were successfully relieved af ter
the t reatment.Conclusion The root of M allotus apelta(Lour.)Muell.-Arg .could retard the prog ression of
liver fibrosis.
Key words:The root of M allo tus apelta(Lour.)Muell.-Arg.;Liver f ibrosis;The Chinese herbs therapy
摘要:目的 通过大鼠肝纤维化动物模型 , 研究白背叶根防治肝纤维化的作用 , 并探讨其作用机理。方法 采用 40%
CCl4花生油溶液制备大鼠肝纤维化模型 ,观察白背叶根对大鼠血清中多项指标及组织病理学改变的影响。观察的血清
学指标包括:白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门氨酸转氨酶(AST)、透明质酸(HA)、层粘蛋白
(LN)、前三型胶原(PⅢC)和四型胶原(Collagen Ⅳ)。结果 白背叶根能显著降低大鼠血清中 GLB、ALT、HA 、LN和 Col-
lagen Ⅳ的水平 ,并能减轻肝脏内炎症和胶原纤维增生程度。结论 白背叶根具有较好的抗肝纤维化作用。
关键词:白背叶根;肝纤维化;中药治疗
中图分类号:R575.2 文献标识码:A 文章编号:1001-8174(2002)05-0257-03
各种病因引起的慢性肝病 ,各种损伤因素所致的
肝脏损伤 ,都可能发生肝细胞坏死 、炎症 ,并继发纤维
化的病理特征。在过去的几十年里 ,肝纤维化 、肝硬化
能否发生逆转 ,一直是医学界有争议的问题 。自从
Rogking 提出人典型发展的肝硬化完全可以发生逆转
后 ,肝纤维化的研究成了消化病学中的一个热点课题 ,
但目前还缺乏有效的药物完全阻断或逆转这一过程。
我们经临床验证发现白背叶根可以较好地治疗急性病
毒性肝炎 。本实验是为了研究其是否具有抗肝纤维化
作用 ,并进一步探讨其作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性普通级Wistar 大鼠 60只 ,体重
190±10g ,第一军医大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂 分析纯 CCl4 ,汕头光华试剂厂产品;
透明质酸(Hyaluronate acid , HA)、层粘蛋白(Laminin ,
LN)、前三型胶原(procollagen type Ⅲ , P ⅢC)、四型胶
原(type Ⅳ Collagen)放免检测试剂盒购于上海海军医
学研究所;A LT 、AST 试剂盒为南京建成生物工程公
司产品。马洛替酯 ,锦州九泰药业有限责任公司产品 ,
批号 000201 ,制成混悬剂 ,作为阳性对照药。白背叶
根购于第一军医大学南方医院中药房 ,水煎 3次后经
75℃水浴浓缩成高 、中 、低三种剂量 ,含生药 0.75g/
ml、0.5g/ml和 0.25g/ml。
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全军医药卫生科研基金课题资助项目
1.3 动物分组及模型制备 雄性普通级Wistar大鼠
60只 ,随机分为 6组:正常组 、病理组 、阳性药组和中
药低 、中 、高剂量治疗组。病理组和中药治疗组:第一
次后腿皮下注射 40%四氯化碳花生油溶液 0.5ml/
100g ,以后改为 0.3ml/100g ,每周 2次;正常组注射同
量的生理盐水 ,共 6周 。前 2周给动物饲以高脂饮食
(79.5%玉米粉+20%猪油+0.5%胆固醇),后 4周饲
以单纯玉米面(混以 0.5%胆固醇)。
1.4 药物处理 实验第 7周开始给予药物灌胃 ,每日
1次 ,每次 2ml;阳性药对照组按 60mg/kg 给予马洛替
酯;正常组和模型组给予等量生理盐水 ,共给药 30天 ,
末次给药 24小时后 ,戊巴比妥钠麻醉 ,打开腹腔 ,腹主
动脉采血;取肝左叶肝脏 ,中性 10%福尔马林固定制
作光镜标本。
1.5 指标测定 (1)光镜标本:石蜡包埋 ,常规切片 ,
HE染色 ,按 1995 年全国病毒性肝炎防治方案病理诊
断标准进行肝纤维化程度分级;(2)血清指标:ALB 、
GLB 检测应用日立 750 型自动生化分析仪;ALT 、
AST 检测采用赖氏法 。HA 、LN 、PⅢC 、Ⅳ型胶原检测
采用放免法 ,按试剂盒说明进行操作。
1.6 统计学方法 上述各项指标均计算均数( x)±
标准差(s),用统计软件 SPSS 8.0进行单因素变量方
差分析和 SNK两两比较 。
2 结果
2.1 动物观察 在造模结束后 ,病理组和中药低 、中
剂量组各有 2只和 1只大鼠死亡。病理组大鼠皮毛干
涩 ,胡须下垂 ,喜睡少动;中药各组大鼠皮毛光洁 ,与正
常鼠相似 。
2.2 血清中 ALB 、GLB 、ALT 、AST 的变化 白背叶
根各组可以显著升高血清中 ALB 水平(P <0.01),而
降低 GLB ,但高剂量组降低 G LB的趋势反没有低 、中
剂量大;并可显著降低 ALT(P <0.01)水平 , 但对
AST 仅有降低的趋势(见表 1)。
表 1 白背叶根对血清中蛋白和转氨酶的影响 x±s
n ALB(g/ L) GLB(g/ L) ALT(U/ L) AST(U/ L)
正常组 10 32.12±3.11■34.00±3.08■ 59.94±9.50■ 108.35±25.86■
病理组 8 26.23±6.28＊40.00±3.71＊ 661.45±294.48＊ 449.26±278.41＊
阳性药组 10 34.67±1.36■32.51±1.62■ 149.81±45.47■ 188.09±36.12■
低剂量组 9 34.06±2.58■31.43±3.31■ 355.35±210.52＊■ 343.62±172.64＊
中剂量组 9 33.56±4.52■31.47±4.22■ 298.76±98.85＊■ 330.27±102.68＊
高剂量组 10 33.78±5.33■34.06±2.95■ 280.49±52.40＊■ 306.88±67.17＊
注:与正常组相比 , ＊P<0.05;与病理组相比 , ■P<0.05。
2.3 血清中HA 、LN 、P ⅢC 、Ⅳ型胶原的变化 白背
叶根各组可以显著降低血清中 LN(P <0.05)、HA 和
Ⅳ型胶原的水平(P <0.05),但对三型前胶原仅有降
低的趋势(见表 2)。
表 2 白背叶根对血清中肝纤四项的影响 x±s
n
HA
(ng/ml)
LN
(ng/ml)
PⅢC
(μg/ L)
Collagen Ⅳ
(μg/ L)
正常组 10 63.42±17.36■ 38.51±21.58■ 3.95±2.92■ 15.92±8.52■
病理组 8 284.88±266.56＊ 58.28±24.10＊ 8.15±3.25＊ 22.83±11.95＊
阳性药组 10 80.75±30.67■ 42.25±13.21■ 7.56±2.42 16.30±6.23■
低剂量组 9 75.90±26.34■ 38.12±9.02■ 7.96±2.58 17.29±5.19■
中剂量组 9 87.76±42.48■ 37.76±16.23■ 10.14±5.13＊15.47±4.43■
高剂量组 10 70.58±23.41■ 33.34±15.21■ 7.85±2.24 15.25±2.91■
注:与正常组相比 , ＊P<0.05;与病理组相比 , ■P<0.05。
2.4 肝组织病理学观察
2.4.1 光镜下形态学变化 正常组没有肝细胞变性 、
坏死;病理组可见肝小叶内有较广泛的肝细胞点状坏
死 ,伴明显的淋巴细胞浸润 ,肝细胞再生明显 ,有严重
的脂质空泡存在 ,部分肝小叶内可见到桥接样坏死 ,肝
小叶破坏;阳性药对照组仅可见到部分范围内的肝细
胞点状坏死 ,淋巴细胞浸润不明显 ,小范围内有少量脂
质空泡的存在 ,破坏的肝小叶几乎恢复正常;白背叶根
各组肝小叶中有较少的点状坏死和淋巴细胞浸润 ,高 、
中剂量组较病理组 ,坏死和浸润改善更明显。
2.4.2 肝纤维化程度分级[ 1] 0 级:正常肝脏 ,未见
肝纤维化;Ⅰ级:包括汇管区 、汇管区周围纤维化和限
局窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕 ,二者均不影响小叶
结构的完整性;Ⅱ级:可见纤维间隔即桥接纤维化
(Bridging fibrosis),虽有纤维间隔形成 ,但小叶结构大
部仍保留。 Ⅲ级:大量纤维间隔 ,分隔并破坏肝小叶 ,
致小叶结构紊乱 ,但尚无肝硬化;Ⅳ级:早期肝硬化 ,肝
实质广泛破坏 ,弥漫性纤维增生 ,被分隔的肝细胞团呈
不同程度的再生及假小叶形成 。本实验中 ,仅有高剂
量治疗组与病理组间有显著性差异 , P <0.05(见表
3)。
表 3 各组大鼠肝纤维化程度观察结果
n
肝纤维化程度(级)
0 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
正常组＊＊ 10 10 0 0 0 0
病理组 8 0 1 1 4 2
阳性药组＊＊ 10 3 4 2 1 0
低剂量组 9 1 3 3 2 0
中剂量组 9 1 4 2 2 0
高剂量组＊ 10 2 3 2 2 1
注:与病理组相比 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
3 讨论
肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后修复过程的
炎症反应 ,以细胞外基质(Ex tracellular matrix , ECM)
在肝内过量沉积为病理特征 ,最终可以导致肝硬化和
肝衰的病变过程 。肝纤维化的产生是多种类型细胞 、
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氧化压力 、细胞因子和化学因子等一系列复杂作用的
结果[ 2] 。其中 ,枯否氏细胞(KC)和肝星状细胞(HSC)
的激活是肝纤维化发生过程中两个重要的步骤。肝星
状细胞被激活后 ,转变为肌成纤维细胞 ,后者是细胞外
基质蛋白增生的主要来源 。KC和 HSC 还可经旁分泌
和自分泌途径产生多种细胞因子 ,如 TGF-β1 、PDGF 、
EGF 和 IGF 等 ,进一步加剧肝纤维化的形成[ 3] 。因
此 ,抑制肝内炎症 ,保护肝脏功能 ,减少肝细胞坏死 、增
生和预防肝星状细胞的激活是防治肝纤维化的主要手
段。
目前发现多种中药都具有防治肝纤维化的作用 ,
但本实验首次对白背叶根进行肝纤维化防治的动物实
验研究 ,并发现它具有良好的抗肝纤维化功能 。白背
叶根味苦 、微涩 ,性平。具有清热解毒 、收涩消瘀的作
用 , 《福建药物志》上记载:“清热平肝。治肝炎 , ……” ,
白背叶鲜根 30 ～ 60克可以治疗急慢性肝炎 。我们经
临床验证也发现它可以较好地治疗急性肝炎 。白背叶
根中含熊果酸乙酸酯 、古柯二醇-3-乙酸酯 、β-甾醇 、2β ,
29-二羟基羽扇烷等多种成份[ 4] ,可以有效地抑制多种
细菌的生长 ,起到抗炎的作用[ 5] 。由本实验也可看
到 ,白背叶根可以显著升高血清中白蛋白水平 ,降低球
蛋白水平;并可显著降低丙氨酸转氨酶 ,虽天冬氨酸转
氨酶降低不显著 ,但也可看出有此趋势 。因此 ,抑制肝
内炎症可能是白背叶根预防肝纤维化的机理之一 。
肝纤四项的检查是目前较常采用的一种无创检查
肝纤维化的指标 。但对该四项指标能否正确反映出肝
纤维化及其程度 ,尚有很大的争议 。从本实验结果看 ,
肝纤四项与肝纤维化程度的相关系数从大到小排列
是:HA>LN>Ⅳ胶原>PⅢC 胶原 ,因此我们认为 HA
和 LN可以较好地反映出肝纤维化的程度 ,而PⅢC和
Ⅳ型胶原则较差 ,这与其他学者的看法相似[ 6] 。在诊
断肝纤维化时 ,是以病理检查为标准 ,在本实验中 HE
染色表明白背叶根可以明显减轻肝内炎症反应 ,并显
著减轻肝纤维化程度;Masson染色显示白背叶根组纤
维增生程度明显低于 CCl4 组 。研究结果说明白背叶
根可以减少肝细胞坏死 ,抑制肝内纤维增生 ,阻断肝纤
维化的发展过程 ,这可能是白背叶根治疗肝纤维化的
另一个机理 。但白背叶根治疗肝纤维化的具体机理 ,
以及何种成份起作用等还需进一步研究 。就目前研究
可以看出白背叶根具有良好的治疗肝纤维化的前景。
参考文献:
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收稿日期:2002-02-01;修回日期:2002-03-11
(陈可冀院士 审)
作者简介:赵进军(1978-),男 ,河南偃师市人 ,在读硕士生。研究方
向:中药抗肝纤化。
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