全 文 ：药物分析杂志 C h in J P ll a ri n A n a l 2 0 0 8 , 28 ( 5 ) 7 55
藏药打箭菊中总黄酮及木犀草素的含量测定 ’
张凌 ’ , 张道英 ’ , 刘亚丽 ’ , 罗晶 ’ , 顿珠 2
( 1
. 江西中医学院教 育部重点实验室 ,南昌 330 04 ; 2 . 西藏藏医学院 , 拉萨 8 5 0 0 0 0)
摘要 目的 : 建立藏药打箭菊中总黄酮及木犀草素的含量测定方法 。 方法 : 以芦丁为指标性成分 , 用紫外分光光度法通过在
27 5
n m 处测定其铝配化合物来求得打箭菊中总黄酮的含量 ;采用反相高效液相色谱法 ,使用 H yP er 蒯 O D S Z 色谱柱 ( 5 卜m , 250
m m x 4
.
6
,n m )
, 以乙睛 一 0 . 7% 醋酸 ( 25 : 75 )为流动相 , 流速 1 . 0 , l lL · , in 。 一 ’ , 检测波长 350 n m , 以外标法讨一算打箭菊中木犀草
素的含量 。 结果 : 总黄酮浓度在 4 . 2 一 21 . 0 卜g · , n L 一 l范围内与吸收度呈良好的线性关系 ( : 二 0 . 9 99 ) ,平均回收率 ( 。 = 5) 为
98
.
6% ( R s D = 2
.
6% ) ;木犀草素浓度在 9 . 02 一 90 . 2 林g · m L 一 ’ 范围内与峰面积呈 良好的线性关系 ( : = 0 . 9 9% ) , 平均回收率
(
。 二 6 )为 98 . 6% ( Rs D 二 1 2% ) 。 结论 :紫外分光光度法和高效液相色谱法均简便 、快捷 ,适用于打箭菊中总黄酮和木犀草素
的含量测定 、
关键词 : 打箭菊 ;总黄酮 ;木犀草素 ;紫外分光光度法 ;反相高效液相色谱法 ;含量测定
中图分类号 : 9R 17 文献标识码 : A 文章编号 : 02 5 4 一 17 93 ( 200 8 )0 5 一 0 7 55 一 04
D e t e r m i n a it o n o f t o t a l fl a v o n o id s a n d l u t e o l i n i n t r a d i it o n al T i b e t a n
d r u g yP re ht ru m at ts i
e n ` n s e ( B u r
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e t F r a n c h
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) L i n g
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Z H AN G L i
n g ’ , z H A N G D a o 一 y in g l , L IU Y a 一 111 , LU o J i n g ` , D u N z h u Z
( 1
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T ib
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L a
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Ch i n a )
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t a t s ie n e邢e . M e ht o d : T h e e o n t e n t o f t o t a l fl a v o n o i d s w a s d e t e rm i n e d b y u l t r a v i ( ) l e t s Pe e t ro p h o t o m e t巧 , a n d e o m p ar e d
w i th ur t i n a s a er fe er n
e e s u b s t a n e e w i th A 1
3 十 e o m p o u n d at 2 7 5 n m : T h e e o n te n t o f l u t e o l i n w a s d e t e mr i
n e d b y 即 -
Hp L C
,
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e o l u m n w a s H y p e
r s i l OD S 2 e o l u nr ( 5 协m
,
2 5 0 m m x 4
.
6 m m )
,
th e m o b i l e p h a
s e e o n s i s t e d o f
a e e to n i t ir l e 一 w a t e r o f 0
.
7% a
e e t ie a e id ( 2 5 : 7 5 )
a t a fl o w
r a t e o f 1
.
0 m L
·
im
n 一 ’ , a n d t h e d e t e e ti o n wa
v e l e n gt h w a s
35 0 n m
.
R e s川 st :仆。 l i n e ar r a n罗 o r r o t a l 且a v o l l o id s wa 。 4 . 2 一 2 2 . 0 林g · m L 一 ’ ( r = 0 . 9 9 9 9 ) a n d th e a v e ar 罗 er e o v e叮
( , ; 二 5 ) w a s 9 8
.
6% ( R SD = 2
.
6% ) ; Th
e l i n e ar o f l u t e o l i n w a s i n t h e ar n g e o f 9
.
0 2 一 9 0
.
2 林g · m L 一 ’ ( r = 0 . 9 9 9 6 ) ,
a n d th e a v e ar g e er e o v e巧 ( n = 6 ) w a s 9 8 . 6% ( RSD = 1 . 2% ) . C o n d us i o n : hT e m e t h o d s o f V[J a n d H PL C a er 5 1呷 le ,
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, r a p id a n d a er s u i t a b l e fo r d e t e mr i
n a t i o n o f to t a l fl a v o n o i d s a n d ] u t e o l i n i n 巧er th ur m ta st ie n e o e
K e y w o r d s :马 er zh r u m t a t s ie , ; e n s e ; t o t a l fl a v o n o id s ; l u t e o li n : UV ; R P 一 H P LC ; a s s a y
打箭菊 ,又名鞋新菊或川西小黄菊 ,为菊科匹菊
属 ( 或 小 黄 菊 属 ) 植 物 川 西 小 黄 菊 脚er ht ur m
t a st i e n e n s e ( B
u r
.
e t F r a n e h
.
) L i
n g ! C h sr
a n t h e m u m
t a t s ie n e。 。 B u r . e t F r a n e h . ]的十燥头状花序 ,生长于
海拔 3 . 5 一 5 . 0 km 高山草坡或灌丛林缘 , 分布于青
海 、 四川 、 云南 、 西藏及甘肃等地 , 为一种常用藏药 ,
其藏名为 “ 阿加塞窘 ” 、 “ 塞窘美多 ” 。 性寒 , 味苦 ,无
毒 。 具有活血 、 散癖 、 祛湿 、 消炎 、 止痛功 能 ,其藏名
“ 塞窘 ” 就为解痛之意 。 主要用 于 脑震 荡 、 “ 黄水
病 ” 、瘟疫病 、 太阳穴头痛 、跌打损伤和湿热疮疡 。
文献报道 ,打箭菊中主要含有木犀草素 、 木犀草
素 一 7 一 O 一刀一 D 一 葡萄糖背 、 洋芹素 、芫花素等黄
酮类成分 t ’ 〕 。 研究表明 : 黄酮类化合物具有降血
糖 、 降血脂 、 抗菌消炎 、抗氧化 、 抗衰老 、消除体内自
由基等药理作用 [ ’ 〕 , 而木犀草素及其昔具有抗菌 、
抗炎 、抗病毒 、 抗氧化及扩张血管等作用 3[] 。 本文
* 教育部 “ 质爸工程 ” 西部援助项 口 ;江西中医学院对 口援助西藏藏医学院项 目
第一作者 eT l / Fax : ( 0 7 9 1 ) 7 1 15 5 2 5 ; E 一 m a i l : d叭 64 8 10 @ 26 3 . 。 o m
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2008. 05. 005
药物分析杂志 C h i,1 J P h a n n A n a l 2 00 8 , 28 ( 5 )
喇麒荆
以芦丁为指标性成分 , 采用 紫外分光光度法对打箭
菊中总黄酮进行含量测定 ; 以木犀草素为指标性成
分 ,采用反相高效液相色谱法对打箭菊中木犀草素
进行含量测定 ,从而为进一 步开发利用打箭菊资源
并对其进行质量控制提供了科学依据 。
1 仪器与试药
u 一 3 0 0 0 s p e e t r ( )p h 〔) t o m e t e r ( 日本 日立 公 司 ) ;
A g i l e n t 1 10 0 型高效液相色谱仪 ( G 13 1 5 A 型 DA D 检
测器 ; H P 色谱工作站 ) ; 1月 0 万电子分析天平 (上海
梅特勒 一 托利多仪器有 限公司 ) ; S3B 2 0 超声波清
洗仪 (上海博迅实业有 限公司医疗设备厂 ) ;万能粉
碎机 (天津市泰斯特仪器有 限公司 ) 。
对照品芦丁 (批号为 1 00 0 8 0 一 2 0 0 3 0 6 ) 及木犀
草素 (批号为 1 1 15 2 0 一 2 0 0 2 0 1 )购 自中 国药品生物
制品检定所 ;打箭菊药材 (西藏藏医学院提供 ) 由西
藏藏医学院藏药研究所顿珠副教授鉴定为川西小黄
菊 产卜咫 th r u n ; za , s i e n e o e ( B u r . e t Fr a n c h . ) L i n g 的花 ;
流动相用 乙睛 、 甲醇为色谱纯 , 水为双蒸水 ;其他试
剂为分析纯 。
2 试验方法与结果
2
.
1 总黄酮的含量测定
2
.
1
.
1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取 12 0 ℃
减压干燥至恒重 的无水芦丁 20 . 9 m g , 置于 10 m L
量瓶中 ,加 甲醇溶解 ( 如不溶则置水浴上微热使溶
解 ) 并稀释至刻度 , 摇 匀 , 即得 ( 每 1 m L 含 芦 丁
0
.
2 0 9 m g )
。
2
.
1
.
2 供试品溶液的制备 取打箭菊 细粉约 0 . 1
g
, 于 60 ℃干燥 6 h , 精密称定 ,置索氏提取器中 , 加
乙醚 1 5 0 m L ,加热 回流至提取液无色 , 弃去乙 醚提
取液 。 待乙醚挥干后 ,将粉末置干燥箱中 60 ℃干燥
l h
,然后加人少量 50 % 乙醇使粉末全部转移至 150
m L 烧瓶中 , 加 50 % 乙醇 30 m L ,加热回流提取 2 次 ,
每次 3 h ,滤过 , 用 5 0% 乙醇 10 m L 充分洗涤残渣 ,
合并提取液与洗涤液 ,置水浴上挥干 ,用适量甲醇溶
解 ,并转移至 10 m L 量瓶中 ,再用甲醇稀释至刻度 ,
摇匀 , 即得 〔` ] 。
2
.
1
.
3 测定波长的选择 取芦丁对照品溶液和供
试品溶液各 2 m L , 分别置于 25 m L 量瓶中 , 各加 甲
醇至 6 m L , 加人 2% 三氯化铝 甲醇溶液 ( 含 l % 醋
酸 ) 0 . 5 m L , 摇匀 , 再加甲醇至刻度 , 即得芦丁对照
品三氯化铝溶液和供试品三氯化铝溶液 , 放置 60
m in 显色 , 在 20 0 一 60 0 n m 波长范围内扫描 。 结果
表明 ,芦丁对照品和打箭菊均在 2 75 n m 处有最大吸
收 , 因此选 2 75 n m 为测定波长 , 结果 见图 1 。
6 0 0 人 /n m
图 1 芦丁 和样品的吸收光谱
F 19 1 A b
s一1甲 t i o r l s p e c 一ar o f 川 t i r l a l l d s a m p l e
1
. 芦丁对照 品溶液 ( So lu t i ( ,n o f ur t sn ) 2 . 供 试品溶 液 ( s `〕l u t io n o f
s a m p l e ) 3
. 芦丁 三氯化铝溶液 ( AI C13 s o lu * i o n o f ur t i n ) 4 . 供试品
三氯化铝溶液 ( AIC I; s o lu * i o n o f s a n l p l e )
2
.
1
.
4 线性关系考察 精密量取芦丁对照品溶液
0
,
0
.
5
,
1
.
0
,
1
.
5
,
2
.
0
,
2
.
5 m L
,分别置于 2 5 m L 量瓶
中 ,各加 甲醇至 6 m L ,加入 2 % 三氯化铝 甲醇溶液
(含 1% 醋酸 ) 0 . 5 m L , 摇匀 ,再加 甲醇至刻度 , 放置
6 0 m in 显色 , 以第 1 瓶中溶液作为空白 , 在 2 75 n m
处测定各溶液 的吸收度 , 以吸收度 A 为纵坐标 , 浓
度 C 为横坐标 ,得回归方程 :
C = 0
.
0 2 7 4 A 一 0
.
0 O0 1
r = 0
.
9 9 9 9
上述结果表明 :芦丁浓度在 4 . 2 一 21 . 0 畔 · m L 一 ’ 范
围呈 良好线性关系 〕
2
.
1
.
5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液 6
份 , 每份 6 m L ,分别加人 2% 三氯化铝 甲醇溶液 (含
1% 醋酸 ) 0 . 5 m L , 摇匀 , 再加甲醇至刻度 , 放置 60
m访 显色 ,在 2 75 n m 处测定吸收度 。 结果吸收度 的
R SD = 1
.
3% (
n = 6 )
,说明精密度 良好 。
2
.
1
.
6 稳定性试验 精密吸取供试品溶液 6 m L ,
加人 2% 三氯化铝 甲醇溶液 (含 1% 醋酸 ) 0 . 5 m L ,
摇匀 ,再加甲醇至刻度 ,放置 60 m in 显色 , 测定显色
后 1 2 0 m i n 内 ( 0 , 10 , 3 0 , 6 0 , 9 0 , 12 0 m i n ) 在 2 7 5 n m
处 的吸收度 。 结果表明 , 吸收度的 R s D = 0 . 65 % ( 几
= 6 )
, 说明供试品溶液在显色后 120 m in 内测定都
很稳定 。
2
.
1
.
7 重复性试验 取同一 批打箭菊样品细粉 6
份 ,分别按 “ 2 . 1 . 2 ” 项下方法制备供试品溶液 ,精密
吸取 6 m L ,分别加人 2% 三氯化铝甲醇溶液 (含 l %
醋酸 ) 0 . 5 m L , 摇匀 ,再加 甲醇至刻度 , 放置 60 m in
显色 ,在 2 75 n m 处测定吸收度 ,求得样品中总黄酮
含量的平均值为 4 . 24 % , R S D = 1 . 4 % ( n = 6 ) ,说明
该测定方法的重复性良好 。
药物分析杂志 Ch in J Ph arm An al 20 0 8
,
2 8 ( 5 ) 一 75 7 一
2
.
1
.
8 回收率试验 取已 知总黄酮含量 ( 4 . 24 % )
的打箭菊细粉 5 份 , 每份约 0 . 05 9 , 于 60 ℃ 干燥 6
h
,精密称定 ,分别精密加人芦丁对照 品约 2 . 29 m g ,
按 “ 2 . 1 . 2 ” 项下方法制备溶液 ,精密吸取 6 m L ,分别
加人 2% 三氯化铝 甲醇溶液 (含 1% 醋酸 ) 0 . 5 m L ,
摇匀 ,再加 甲醇至刻度 ,放置 60 im n 显色 ,在 2 75 n m
处测定吸收度 ,计算回收率 。 结果 5 次测定的平均
回收率为 98 . 59 % , R SD 二 2 . 6% ,说明该测定方法测
得的结果准确 。
2
.
1
.
9 样品的测定 精密量取供试品溶液 6 m L ,
置 25 m L 量瓶中 , 加人 2% 三氯化铝 甲醇溶液 ( 含
1% 醋酸 ) 0 . 5 m L , 摇匀 , 再加 甲醇至刻度 , 放置 60
m in 显色 ,在 2 75 n m 处测 定吸收度 , 由回归方程计
算总黄酮浓度 , 并求出打箭菊中总黄酮的含量 。 结
果 3 批样品中总黄酮含量分别为 4 . 2 % , 4 . 26 % ,
4
.
3 2%
。
2
.
2 术犀草素的含量测定
2
.
2
.
1 对照品溶液 的制备 精密称取木犀草素对
照品 9 . 0 2 m g ,置于 10 0 m L 量瓶中 , 加 甲醇溶解并
稀释至刻度 ,摇匀 , 即得浓度为 0 . 0 902 m g · m L 一 ,的
木犀草素对照品溶液 。
2
.
2
.
2 供试品溶液 的制备 取打箭菊药材粉末
(过 5 一 6 号筛 )约 1 9 ,精密称定 ,置 巧 0 m L 平底烧
瓶中 ,加人 甲醇 50 m L , 回流提取 l h ,过 滤 , 并用 甲
醇充分洗涤残渣 ,合并提取液及洗涤液 ,置水浴上挥
干后 ,用 甲醇溶解并全部转移至 25 m L 量瓶中 ,再用
甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,过 0 . 45 林m 滤膜 , 即得 。
2
.
2
.
3 色谱条件 色谱柱 : H y p e r s i l O D S Z 柱 ( 5
林m , 2 5 0 m m x 4 · 6 m m ) ,流动相 : 乙睛 一 0 . 7 % 醋酸
( 2 5
: 7 5 )
, 流速 1 . 0 m L · m i n 一 ’ ,检测波长 3 5 0 n m ,柱
温 3 0 ℃ 。 理论塔板数以 木犀 草素计 , 应不 低于
20 0
。 对照品及样品色谱图见图 2 。
2
.
2
.
4 线性关系的考察 精密 吸取木犀草素对照
品溶液 l , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 m L ,分别置于 10 nr L 量瓶中 ,
加甲醇稀释至刻度 , 各进样 10 林 L , 记录色谱图 , 依
次测定峰面积 , 以峰面积 ( )Y 对浓度 ( X ) 进行线性
回归 ,得 回归方程 :
Y = 4
.
0 1 x 1O
4
X + 5 7
r = 0
.
9 9 9 6
上述结果表明 , 木犀草素的浓度在 9 . 02 一 90 . 2 林g
·
m L
一 ’范围内呈 良好的线性关系 。
2
.
2
.
5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液 10
协L ,连续进样 5 次 ,峰面积的 R SD = 1 . 2% 。 结果说
明精密度良好 。
亡/ m i n
图 2 对照品 ( A )及样品 ( )B 色谱图
F ig 2 Cli or n
l a t o g r a m s o f , e fe
r e n e e s u b
s r a n e e ( A ) a
n
d s a , n p le ( B )
1
. 木犀草素 ( l u t e o l i n )
2
.
2
.
6 重复性试验 分别取同一打箭菊样品 5 份 ,
精密称定 ,照 “ 2 . 2 . 2 ” 项下方法制备供试品溶液 , 分
别进样 10 林L ,计算含量平均值为 0 . 032 6% , R S D =
0
.
9 8%
。 结果说明该方法 的重复性良好 。
2
.
2
.
7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液 10 林L ,
分别在 O , 4 , 8 , 12 , 2 4 , 4 8 h 进样 , 求得峰面积的 RSD
= 1
.
4 %
。 结果说明供试品溶液在 48 h 内稳定性良
好 。
2
.
2
.
8 加样回收率试验 取已测知含量 ( 0 . 0 3 26 % )
的打箭菊粉末 (过 5 一 6 号筛 ) 0 . 5 9 ,精密称定 ,置 巧 0
m L 平底烧瓶中 ,按照 药材 中含木犀草素量的 80 % ,
10 %
,
120 % 的量 , 分别精密加人 浓度为 0 . 164
m g
·
m L
一 ` 的木犀草素对照 品溶液 0 . 8 , 1 . 0 , 1 . 2
m L
,各 2 份 , 按 “ 2 . 2 . 2 ” 项 下 自 “ 加 甲醇 5 0 m l ” 起
操作 , 制备所需溶液 , 分别进样 10 协L 。 结果低 、
中 、 高 3 种浓度 回收率 ( n = 2 ) 分别为 9 8 . 8 5% (相
对平均偏差为 0 . 5% ) 、 9 9 . 4 0% (相对平均偏差为
1
.
7 % )
、
9 7
.
5 0 % (相 对平 均偏差为 0 . 7% ) , 平 均
回收率 ( n = 6 ) 为 9 8 . 5 8% ,说 明该方 法测得的结
果准确 。
一 7 5 8 一 药物分析杂志 C h in J P h amr A n日 2 0() 8 , 2 8 ( 5 )
2
.
2
.
9 样品测定 分别精密吸取供试品溶液和对
照品溶液各 10 林L , 按上述色谱条件进行测定 。 结
果 3 批样 品 中木犀 草素含 量分别 为 0 . 0 329 % ,
0
、
0 3 3 5%
,
0
.
0 3 2 6%
。
3 讨论
有文献报道用亚硝酸钠 一 硝酸铝 一 氢氧化钠体
系络合化学吸光法测定总黄酮 的含量 [ 5〕 ,但打箭菊
在 50 一 5 10 n m 处的吸收度非常低 ,且没有吸收峰
出现 ,所以本文不能采用该方法 ,而采用 三氯化铝甲
醇溶液 (含醋酸 )络合化学吸光法 〔4 ] 。
分别用石油醚 、 乙醚对打箭菊粉末进行脱脂预
处理 , 然后提取 ,并与不进行预处理直接提取所得溶
液的总黄酮含量相 比较 。 结果发现 , 不进行预处理
所得溶液的总黄酮含量要低的多 , 而用 乙醚处理比
用石油醚处理所得的总黄酮含量更高 。 所以应该对
打箭菊进行脱脂预处理 ,且脱脂溶剂应选用 乙醚 。
曾进行木犀草素提取方法考察 ,分别采用均匀
设计与单因素 2 种方法进行 ,结果表明过 5 一 6 号筛
的打箭菊粉末 、 加甲醇 50 m L 、 回流提取 l h 的方法
最佳 。
根据木犀草素甲醇溶液的 UV 吸收图谱 ,在 2 54
n m 与 35 0 n m 处有最大吸收峰 , 综合考虑测定波长
选择在 3 5 0 n m 。
分别用不同比例的甲醇 一水与乙睛 一 水做流动
相 ,进行比较选择 ,发现用 甲醇 一 水时 ,供试品溶液
中木犀草素峰后有一小峰不能分开 , 而用 乙睛 一 水
时则可 以完全分开 ,所以确定用乙睛 一 水做流动相 。
参考文献
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(郭亚健 ) , F AN l i (范莉 ) , W A N G X i a o 一 q i a , 19 (王
晓强 ) , e t a l . I) i s e u s s i o n a b o u t N a N O : 一 A I ( N O 3 ) 3 一 Na 0 H e o l o r i -
m e t卿 fo r d e t e rm i n a t i o n o f t o t al fl a v o , l o id s (关于 N a N O : 一 A I ( N O : ) 3
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(木文于 2 0 07 年 7 月 9 日收到 )