全 文 ：※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.14 169
响应曲面法优化大高良姜黄酮酶法提取工艺
彭 晶，杨 颖，牛付阁，李清宇，贾琳斐，段玉峰*，郭 行
(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710062)
摘 要：为研究大高良姜活性成分，选用纤维素酶法提取大高良姜黄酮，并选取酶添加量、酶解时间、酶解温度
和酶解pH值4个因素进行单因素试验，在此基础上以4个因素为自变量，提取率为响应值，采用Box-Behnken试验设
计和响应面分析法，建立数学模型确定大高良姜黄酮提取的最佳工艺条件为酶添加量30.0U/mL、酶解温度56.6℃、
pH5.14、酶解时间1.71h，在此条件下，大高良姜总黄酮的提取率为5.08%。
关键词：大高良姜；黄酮；纤维素酶法提取；响应曲面法
Optimization of Enzymatic Extraction of Flavonoids from Galangal Rhizomes (Alpinia galanga)
PENG Jing，YANG Ying，NIU Fu-ge，LI Qing-yu，JIA Lin-fei，DUAN Yu-feng*，GUO Xing
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)
Abstract：The cellulose-assisted extraction of flavonoids from galangal rhizomes (Alpinia galanga) was optimized by
response surface methodology based on Box-Behnken design. The extraction efficiency of flavonoids was investigated with
respect to four variables including enzyme dosage, hydrolysis time, temperature and pH, and a mathematical model was
developed. The optimal enzyme dosage, temperature, initial pH and time for extracting flavonoids from galangal rhizomes
were 30.0 U/mL, 56.6 ℃, 5.14 and 1.71 h, respectively. The extraction yield of flavonoids under these conditions was 5.08%.
Key words：galangal rhizomes；flavonoids；cellulose-assisted extraction；response surface methodology
中图分类号：TS201.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)14-0169-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201314034
收稿日期：2012-04-15
作者简介：彭晶(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为食品功能成分开发及利用。E-mail：715249879@qq.com
*通信作者：段玉峰(1955—)，男，教授，博士，研究方向为食品功能成分开发及利用、天然产物化学。E-mail：yfduan@snnu.edu.cn
大高良姜为姜科多年生草本植物大高良姜的根茎，
味辛，性热；有散寒、暖胃、行气止痛之功效，主治胃
脘冷痛、伤食吐泻等症 [1-2]。黄酮类成分对人类的健康
起着重要的作用，具有抗氧化、抗衰老、抗癌抗肿瘤、
抗炎、抗心脑血管疾病、免疫调节、镇痛及保护肝脏
等功能，在临床医学中发挥很大作用 [3-5]。黄酮类成分
是大高良姜的药效基础，为功能食品的研发提供理论依
据[6]。黄酮类化合物的提取方法很多，酶法是近年来运
用较多的一种生物技术，主要是在提取溶液中加入适当
的酶，使提取液发生酶解反应，并使植物的组织细胞破
坏，降低提取条件，从而有利于有效成分的提取，大大
提高了总黄酮提取率 [7-8]。而溶剂提取所得粗提物普遍
存在黄酮含量较低、提取率低、有机溶剂残留等缺陷。
酶法提取黄酮，具有绿色环保、高效安全等优点[9-10]。
本实验用纤维素酶法进行大高良姜黄酮的提取，通过响
应曲面分析，确定纤维素酶提取大高良姜黄酮的最佳工
艺，以期对工业化生产大高良姜有效成分及功能食品的
研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
大高良姜购于陕西省西安市药材市场，经生物学鉴
定为姜科山姜属植物大高良姜(Alpinia galangal Willd)的
干燥根茎。
芦丁标准品 北京化学试剂公司Acros进口分装；
纤维素酶 润德生物技术有限公司；无水乙醇、石油醚
(60～90)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为国产分析纯。
U-3010紫外-可见分光光度计 日本日立公司；
HD-3紫外检测仪 上海沪西分析仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 材料的预处理
将大高良姜洗净，放于烘箱内(90℃)烘干，将烘干后
的大高良姜粉碎，过40目筛，经石油醚脱脂后干燥备用。
1.2.2 大高良姜黄酮含量的测定
采用可见分光光度法，以芦丁为对照品，以NaNO2-
Al(NO3)3-NaOH为显色剂，在510nm波长处测吸光度，绘
170 2013, Vol.34, No.14 食品科学 ※工艺技术
制吸光度A与芦丁溶液质量浓度Y的标准曲线，得回归方
程：Y=100.43A－0.0697(式中：Y为芦丁含量/(μg/mL)，
A为吸光度)，R2=0.9999，在0～1000μg/mL范围内线性良
好。根据标准曲线，得提取液中黄酮类化合物的质量浓
度，由质量浓度计算大高良姜黄酮的提取率[11-12]。大高良
姜黄酮的提取率计算公式如下：
黄酮提取率/%=样品中黄酮类物质质量/g原料质量/g ×100
1.2.3 纤维素酶法提取大高良姜黄酮的工艺研究
1.2.3.1 单因素试验
称取1.0g大高良姜干粉于150mL锥形瓶中，加60%乙
醇使酶解体积为25mL，分别以酶添加量、酶解时间、酶
解温度和酶解pH值4个因素对提取率的影响进行单因素试
验。所得酶解液在85℃条件下放置15min使酶失活[13]，然
后在70℃水浴中提取1.5h，提取液经过滤离心后，计算黄
酮的含量[14]。
1.2.3.2 响应面设计试验
在研究上述因素的基础上，进行四因素三水平的响应
曲面设计试验，以确定最佳酶解工艺条件。以大高良姜黄酮
的提取率为响应值，以酶添加量(U/mL)、酶解温度(℃)、酶
解时间(h)和酶解pH值为影响因素进行编码[15-16]。因素编码
及水平见表1。
表 1 响应面试验的因素和水平编码表
Table 1 Factors and levels for response surface design
水平 A酶添加量/(U/mL) B酶解温度/℃ C pH D酶解时间/h
－1
0
1
19.2
28.8
38.4
50
55
60
4.5
5.0
5.5
1.0
1.5
2.0
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.80
2.85
2.90
2.95
3.00
3.05
3.10
3.15
3.20
3.25
3.30
9.6 19.2 28.8 38.4 48.0 57.6 67.2
䝊⏏ࡴ䞣/(U/mL)
ᦤ
প
⥛
/%
a
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
䝊㾷ᯊ䯈/h
ᦤ
প
⥛
/%
b
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
35 40 45 50 55 60
䝊㾷⏽ᑺ/ć
ᦤ
প
⥛
/%
c
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
pH
ᦤ
প
⥛
/%
d
图 1 酶添加量(a)、酶解时间(b)、酶解温度(c)、pH值(d)对
黄酮提取率的影响
Fig.1 Effects of enzyme amount, hydrolysis time, temperature and
initial pH on the extraction yield of fl avonoids
2.1.1 酶添加量对大高良姜黄酮提取率的影响
分别加9 .6、19 .2、28 .8、38 .4、48 .0、57 .6、
67.2U/mL纤维素酶溶液，在酶解温度50℃，自然pH值条
件下酶解2.0h，考察不同酶添加量对黄酮提取率的影响。
结果见图1a，随酶添加量的增大，总黄酮提取率逐步提
高。增加酶添加量可以提高酶促反应速度，同时酶添加
量对反应速度的影响具有饱和现象[14]，即当酶添加量达
28.8U/mL时，黄酮提取率变化趋于平稳。所以选28.8U/mL
作为标准。
2.1.2 酶解时间对大高良姜黄酮提取率的影响
在酶添加量28.8U/mL、酶解温度50℃、自然pH值条
件下分别酶解0.5、1.0、1.5，2.0、2.5、3.0h，考察不同
酶解时间对黄酮提取率的影响。结果见图1b，在较短时
间段内，黄酮的提取率随时间的延长而增加，在1.50h达
最大，继续延长时间黄酮的提取率反而降低。一方面是
由于酶反应完全，活性降低，另一方面是黄酮的结构遭
到破坏所致[17]。因此选择1.50h作为酶解时间。
2.1.3 酶解温度对大高良姜黄酮提取率的影响
在酶添加量为28.8U/mL，酶解温度分别为35、
40、45、50、55、60℃，自然pH值条件下酶解1.5h，
考察不同温度对黄酮提取率的影响。结果见图1c，随着
温度的升高，酶的活性也升高，黄酮提取率也随之提
高，但当温度升高到一定程度时，酶蛋白开始受热变
性，酶活性降低，使黄酮提取率降低[14]。当酶解温度在
55℃时，黄酮的提取率最高。所以选55℃作为酶解温度
较合适。
2.1.4 酶解pH值对大高良姜黄酮提取率的影响
在酶添加量为28.8U/mL、酶解温度55℃，调节pH值
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.14 171
分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶解1.5h，考察不
同pH值对黄酮提取率的影响。结果见图1d，当pH值小于
5时，黄酮的提取率随pH值的增加而增加；当pH值高于5
时，黄酮的提取率却与pH值负相关性。这是因为pH影响
蛋白质的水合性质和疏水相互作用，所以酶的活性也受
到影响，在最适pH值下酶的活力最大[17]。因此选择 pH值
为5.0。
2.2 响应面设计结果与分析
2.2.1 响应面试验设计与结果
利用Design Expert软件对表2的试验数据进行分析，
得到纤维素酶法提取大高良姜黄酮提取率的二次回归
模型方程R1=50.08＋1.78A＋1.39B＋1.79C＋1.888D－
0.25AB－1.08AC－0.75AD＋6.8×10－3BC＋0.82BD＋
0.46CD－4.26A2－2.90B2－3.68C2－3.00D2。
表 2 响应面试验设计与结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
试验号 A酶添加量/(U/mL) B酶解温度/℃ C pH D酶解时间/h 提取率/%
1 1(38.4) 0(55) 0(5.0) －1(1.0) 4.56
2 0(28.8) －1(50) 0 1(1.5) 4.18
3 0 1(60) －1(4.5) 0(2.0) 4.38
4 0 －1 0 1 4.57
5 0 1 0 1 4.92
6 0 0 1(60) 1 4.73
7 0 0 0 0 4.98
8 －1(19.2) 0 1 0 4.36
9 －1 0 0 －1 3.92
10 0 0 0 0 5.06
11 0 －1 －1 0 4.04
12 1 0 1 0 4.45
13 0 0 0 0 4.97
14 0 0 0 0 5.01
15 －1 0 0 1 4.21
16 0 －1 1 0 4.38
17 1 0 0 1 4.55
18 0 1 1 0 4.72
19 －1 1 0 0 4.24
20 －1 －1 0 0 3.88
21 0 0 1 －1 4.22
22 0 0 －1 －1 3.86
23 0 1 0 －1 4.20
24 0 0 0 0 5.00
25 0 0 －1 1 4.18
26 1 0 0 0 4.21
27 1 －1 －1 0 4.39
28 1 0 0 0 4.47
29 －1 1 －1 0 3.87
由表3可知，4个因素对提取率的影响都极显著，
A2、B2、C2、D2都达到极显著的效果，AB、AC、AD、
BC、BD、CD交互作用均不显著，且4个因素对大良姜黄
酮提取率影响先后顺序为：酶解时间＞酶解温度＞酶添
加量=pH值。
表 3 回归模型方差分析表
Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression equation
方差来源 平方和 df 均方 F值 P值
A 38.23 1 38.23 22.06 0.0003
B 23.31 1 23.31 13.46 0.0025
C 38.41 1 38.41 22.17 0.0003
D 42.21 1 42.21 24.36 0.0002
AB 0.26 1 0.26 0.15 0.7049
AC 4.70 1 4.70 2.71 0.1218
AD 2.23 1 2.23 1.29 0.2752
BC 1.850×10-4 1 1.850×10-4 1.068×10-4 0.9919
BD 2.68 1 2.68 1.55 0.2341
CD 0.84 1 0.84 0.49 0.4973
A2 117.50 1 117.50 67.82 ＜0.0001
B2 54.62 1 54.62 31.52 ＜0.0001
C2 87.99 1 87.99 50.79 ＜0.0001
D2 58.50 1 58.50 33.76 ＜0.0001
响应曲面分析纤维素酶法提取大高良姜黄酮的响应
曲面见图2。
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
3.70
4.05
4.40
4.75
5.10
a
提
取
率
/%
A˖
ࡴ䝊
䞣C˖pH
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
3.800
4.125
4.450
4.775
5.100
b
A˖
ࡴ䝊
䞣B˖ᦤপ⏽ᑺ
提
取
率
/%
1.0
0.5
0.0
0.5 1.0
1.00.5
0.00.5
1.0
3.800
4.125
4.450
4.775
5.100
A˖
ࡴ䝊
䞣D˖䝊㾷ᯊ䯈
c
提
取
率
/%
d
提
取
率
/%
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
4.000
4.275
4.550
4.825
5.100
B˖
ᦤপ
⏽ᑺC˖pH
172 2013, Vol.34, No.14 食品科学 ※工艺技术
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
4.170
4.395
4.620
4.845
5.070
B˖
ᦤপ
⏽ᑺ
D˖䝊㾷ᯊ䯈
e
提
取
率
/%
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
1.0
0.5
0.0
0.5
1.0
3.800
4.125
4.450
4.775
5.100
C˖
pH
D˖䝊㾷ᯊ䯈
f
提
取
率
/%
图 2 不同因素及其交互作用对大高良姜黄酮提取率的响应面图
Fig.2 Response surface plots showing the effects of the operating
parameters on the extraction yield of fl avonoids
由图2可知，各因素的交互作用均不显著。比较各
因素对应的响应曲面坡度，坡度越陡说明对黄酮提取率
的影响越显著，可知酶解时间对黄酮提取率的影响最为
显著，酶解温度影响较为显著，酶添加量和pH值影响均
显著[18-19]。根据响应曲面设计得出的最佳工艺条件是酶
添加量30.0U/mL、酶解温度56.6℃、pH5.14、酶解时间
1.71h[20]。
2.2.2 验证实验
在最佳工艺条件下做3次平行实验，得大高良姜总
黄酮的提取率为5.08%。与预测值5.06%相比误差仅为
0.02%。说明回归方程能够比较真实的反映各因素对大高
良姜黄酮提取率的影响，证明响应面优化酶法提取大高
良姜黄酮提取条件真实可靠[21]。
3 结 论
本实验选择纤维素酶法提取大高良姜黄酮，根据响
应曲面设计得出的最佳条件是酶添加量30.0U/mL、酶解
温度56.6℃、pH5.14、酶解时间1.71h，在此条件下，大
高良姜总黄酮的提取率为5.08%，与预测值5.06%相比误
差仅为0.02%。证明响应面优化酶法提取大高良姜黄酮提
取条件是合理可靠的。该研究结果为大高良姜在药物、
食品等领域的深入开发提供了一定的理论基础和参考。
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