全 文 ：第 26卷 第 5期
2 0 0 8年 5月
中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 26 No. 5
M ay 2 0 0 8
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中华中医药
学刊
楮实子对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响
王玉凤,凤良元,鄢顺琴,袁 静
(安徽中医学院,安徽 合肥 230038)
摘 要:目的: 研究楮实子对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响。方法: 以环磷酰胺制备小鼠免疫低下模型
并结合体外药理实验,测定灌胃给药后小鼠体内巨噬细胞吞噬率、血清溶血素抗体水平,并观察植物血凝素诱导
T淋巴细胞的增殖反应。采用含药血清体外培养小鼠腹腔巨噬细胞, MTT法考察巨噬细胞的活性, 并观察体外培
养的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。结果:楮实子提高免疫抑制小鼠碳粒廓清率,促进血清溶
血素形成。结论: 楮实子有提高免疫抑制小鼠免疫功能的作用, 但未显示出促进 T淋巴细胞增殖的作用。
关键词:楮实子; 碳粒廓清;巨噬细胞; MTT法;鸡红细胞; 溶血素; T淋巴细胞;免疫抑制
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2008) 05 - 1023 -03
E ffect o f F ructus Broussonet iae on Immunolog ica l Funct ion in
Immunosuppress ive M ice Induced by Cyc lophospham ide
WANG Yu-feng, FENG L iang-yuan, YAN Shun-qin , YUAN Jing
( Anhu i Col lege of Trad itionalC h inese M edicine, H efei230038, Anhu ,i Ch ina)
Abstrac:t Ob jective: T o study the immunom odulation of F ruc tus Broussonetiae on immunosuppressivem ice induced
by cyc lophospham ide ( CTX ) . M ethod s: The imm unosuppressive m ice induced by CTX w ere adm in istra ted w ith F ructus
B roussone tiae fo r8d. The carbon pa rticle clearance leve,l serum hemo lysin leve,l and pro life ra tive re sponse o f T lym pho-
cy te induced by phy tohemagg lu tin in ( PHA ) w ere m easured. U sing serum containing d rug to culture peritonea l m acro-
phage (MÆ) in v itro, the e ffec t o f F ruc tus Broussonetiae on activ ity o fMÆwe re studied byMTT assay. The phagocy tic
ab ility of the phagocytizing o f ch icken red blood cell byMÆ cu ltu red in vitro w asm easured. Results : F ruc tus B roussone-
tiae significan tly strengthened the carbon particle clearance leve l and the hem o lysin leve .l C onclusion: F ructus Brous-
sone tiae imp roved imm uno log ica l func tion o f immunosuppre ssive m ice induced by CTX, but did no t show the effect of the
p rom o ting o f T lymphocy te proliferation.
Keywords: fruc tus broussone tiae; ca rbon pa rtic le c lea rance; m acrophage; MTT assay; ch icken red b lood cel;l he-
m o lysin; T lymphocy te; imm unodepression
收稿日期: 2007 - 12 - 26
基金项目:安徽省教育厅青年教师 /资助计划 0项目 ( 2004 jq171)
作者简介:王玉凤 ( 1974 - ) , 女,河南辉县人, 讲师, 硕士, 研究方
向:中药药理。
据文献报道, 楮实子有提高机体免疫功能的作用 [1 ],
但迄今为止笔者尚未见具体实验研究报道。本实验主要研
究楮实子对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫功能的影
响, 并结合含药血清体外培养细胞实验, 考察楮实子对体外
培养的巨噬细胞活性的影响,以探讨体内外实验的相关性。
1 材 料
1. 1 动物 18 ~ 22g昆明种小鼠, 雌雄兼用, 安徽医科大
学实验动物中心提供。
1. 2 药品与主要试剂 实验用楮实子药材经安徽中医学
院中药教研室凤良元教授鉴定符合 2005年版5中华人民共
和国药典6规定。将药材用 6倍量水微沸煎煮 3次, 每次
0. 5h, 合并提取液,在水浴上浓缩成 1g生药 /mL供实验用。
环磷酰胺 ( CTX )粉针剂; 左旋咪唑 ( LMS)片;印度墨汁; 4%
G iem sa -磷酸盐缓冲液; 鸡红细胞 ( CRBC)悬液; 5%豚鼠补
体; RPM I1640细胞培养液制备的植物血凝素 ( PHA )溶液
( 250Lg /mL) ;噻唑蓝 ( MTT)溶液 ( 5m g /mL ); H ank s液等。
1. 3 主要仪器 UV757CRT紫外可见分光光度计 (上海精
密科学仪器有限公司 ); 318酶标仪 (上海 SANCO) ; SW -
C J - 1F型净化工作台 (上海一恒科技有限公司 ); HH. CP -
TW型二氧化碳培养箱 (上海一恒科技有限公司 ) ; DL -
4000B型冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂 )等。
2 方 法
2. 1 分组给药及免疫低下模型的制备 小鼠按体重随机
分为 4组, 每组 10只: ( 1)正常对照组; ( 2) CTX模型组;
( 3) LM S阳性对照组; ( 4)给药组。给药组按 15mL /kg ig给
药, LMS组按 30m g /kg ig给药, 正常对照组及 CTX模型组
ig给等量生理盐水,每日 1次, 连续 8天。给药后第 3天,
除正常组外, 每只小鼠均 ip CTX 30mg /kg, 连续 3天, 制备
CTX致小鼠免疫低下模型。
DOI：10.13193/j.archtcm.2008.05.128.wangyf.064
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2. 2 含药血清的制备 取 18~ 22g雄性昆明种小鼠 9只,
按体重随机分为 3组, 每组 3只。 ( 1)正常对照组; ( 2) LMS
阳性对照组; ( 3)给药组。给药组按 15m L /kg ig给药, LMS
阳性药组按 50m g /kg ig给药, 正常对照组 ig等量生理盐
水, 每日 2次,连续 3天。于末次给药 1h后分别采血, 分离
血清, 同组血清混合, 滤过除菌,分装, - 20e 冻存以备用。
2. 3 碳粒廓清实验 [2 ] 照 / 2. 1分组给药及免疫低下模型
的制备 0项下方法, 于末次给药 1h后, 各鼠尾静脉注入稀
释印度墨汁 10m L /kg体重, 于注后第 3m in和第 13m in从鼠
眼眶后静脉丛取血 25LL, 加到 Na2CO3溶液 2. 0mL中摇匀。
于 600nm波长处测定吸光度 ( A )值。计算吞噬指数 K和
吞噬系数 A(校正吞噬指数 )。
2. 4 对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞 ( MÆ)活性的影
响 [3] 照 / 2. 2含药血清的制备0项下方法制备各组血清。
常规制备小鼠 MÆ悬液 ( 2 @ 106 /mL ) [4 ]。取 MÆ悬液 100
LL, 加入 96孔培养板中。实验分为 4组, 每组 3复孔: ( 1)
无血清对照组: 每孔加生理盐水 50LL; ( 2 )正常血清对照
组: 每孔加正常对照血清 50LL; ( 3)阳性药对照组:每孔加
含阳性药血清 50LL; ( 4)给药组: 每孔加含药血清 50LL。
各组每孔均加 RPM I1640培养液 100LL。培养板置 37e 、
5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养 48h。采用 MTT法测
定各组的吸收度 ( A )值 (测定波长 578nm, 参比波长为
630nm ) [4]。
2. 5 对体外培养的 MÆ吞噬 CRBC的影响 [ 4] 照 / 2. 4对
体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞 ( MÆ)活性的影响0项下的
方法, 自 /照- 2. 2含药血清的制备 . 项下方法制备含药血
清0起,至 /培养板置 37e 、5% CO2及饱和湿度的培养箱中
培养 48h0止, 同法操作。培养结束后,弃上清 ,用 H ank s液
洗涤孔中 MÆ一次, 每孔加 CRBC 悬液 100LL (每孔含
CRBC 1 @ 106个 ) , 37e 培养 30m in, 每 10m in摇动 1次。弃
上清, 每孔加 4e H ank s液 200LL, 轻轻吹吸洗脱黏附的
MÆ,照文献 [6 ]方法制片。在油镜下计数 200个 MÆ, 计算
吞噬百分率和吞噬指数。
2. 6 血清溶血素实验 [4 ] 照 / 2. 1分组给药及免疫低下模
型的制备0项下方法,于给药后第 3天, 每只小鼠均 ip CRBC
悬液 0. 2mL。末次给药后 1~ 2h,摘眼球采血,分离血清,备
用。采用微量溶血分光光度法测定血清溶血素含量 [5],取各
组血清 50LL, 用生理盐水稀释 80 倍, 取各血清稀释液
100LL,加入 96孔培养板中, 继而依次加入 2. 5% CRBC悬液
100LL和生理盐水稀释的豚鼠血清 ( 1y 20) 100LL。空白对
照孔用生理盐水代替血清,实验均设 3复孔。置 37e 孵箱内
温育 1h后,准时取出培养板置冰块上终止反应。冷却后,离
心 ( 4e , 2000r /m in, 10m in)。取离心后的上清液 150LL,置另
一 96孔培养板内, 置酶标仪测定 A值,检测波长为 414nm。
照文献 [ 4]方法计算溶血素含量。
2. 7 淋巴细胞转化实验 照 / 2. 2含药血清的制备0项下
的方法制备各组血清。将 CTX致免疫功能低下的小鼠 [给
小鼠 ip CTX 50mg /( kg# d) ,每天 1次, 连续 4天 ]放血致
死, 常规制备脾细胞悬液 [4 ], 用 RPM I1640培养液调成 1 @
107个细胞 /mL。取脾细胞悬液 100LL,加入 96孔培养板孔
中。实验分为 4组,每组 3复孔: ( 1)正常对照组: 每孔加正
常组血清 50LL; ( 2)模型对照组: 每孔加正常对照血清
50LL; ( 3)阳性药对照组: 每孔加含阳性药血清 50LL; ( 4)
给药组: 每孔加含药血清 50LL。除正常对照组加不完全
RPM I1640培养液 100LL外, 其余各组每孔均加 PHA溶液
100LL。培养板置 37e 、5% CO 2及饱和湿度的培养箱中培
养 72h。采用 MTT法测定各组的 A值 (测定波长 578nm, 参
比波长 630nm) [4]。
2. 8 统计学处理 实验结果均用 ( €x ? s ) 表示, 组间比较
采用 t检验。
3 结 果
3. 1 对体外培养的 MÆ活性及其吞噬 CRBC的影响 实
验结果表明, 与无血清对照组比较,正常小鼠血清明显提高
MÆ活性及促进 MÆ吞噬 CRBC ( P < 0. 01)。与正常血清
对照组比较, LM S显著提高 MÆ活性及促进 MÆ吞噬
CRBC( P < 0. 01), 楮实子未显示明显的提高 MÆ活性及
促进 MÆ吞噬 CRBC的作用 ( P﹥ 0. 05)。见表 1。
表 1 楮实子对体外培养的小鼠腹腔 MÆ活性
及其吞噬 CRBC功能的测定结果 ( n = 3, €x ? s )
组别 MÆ活性 ( A值 ) 吞噬百分率 吞噬指数
无血清对照组
正常血清对照组
LM S阳性对照组
楮实子
0. 259? 0. 012
0. 369? 0. 024* *
0. 484? 0. 026##
0. 398? 0. 031v
15. 67? 1. 53
32. 67? 2. 31* *
64. 67? 2. 08##
36. 33? 2. 08v
0. 183 ? 0. 015
0. 393 ? 0. 015* *
0. 767 ? 0. 031##
0. 423 ? 0. 038v
注:与无血清对照组比较, * * P﹤ 0. 01; 与正常血清对照组比较, v P
﹥ 0. 05, ## P﹤ 0. 01。
3. 2 对碳粒廓清率和血清溶血素生成水平的影响 实验
结果表明, 与正常组比较, CTX显著抑制正常小鼠的碳粒廓
清率和血清溶血素生成水平 ( P < 0. 01)。与模型组比较,
LMS显著提高 CTX诱导的免疫抑制小鼠的碳粒廓清率和
血清溶血素生成水平 ( P < 0. 01), 楮实子显著提高免疫抑
制小鼠的碳粒廓清率和血清溶血素生成水平 ( P < 0. 01)。
见表 2。
3. 3 对体外培养的小鼠淋巴细胞转化的影响 实验结果
表明, 与正常血清对照组比较, PHA明显促进淋巴细胞的
转化 ( P < 0. 01)。与模型对照组比较, LM S显著促进淋巴
细胞的转化 ( P < 0. 01), 但楮实子对淋巴细胞的增殖无显
著促进作用 ( P ﹥ 0. 05)。见表 2。
表 2 楮实子对免疫功能低下小鼠的碳粒廓清水平血清溶
血素生成水平及小鼠淋巴细胞增殖影响的测定结果 ( €x ? s )
组别
A值
( n = 10)
溶血素含量
( n = 10 )
淋巴细胞增殖
( n = 3)
正常组
模型组
LM S组
楮实子
5. 42 ? 0. 47
3. 42 ? 0. 29* * ( CTX )
4. 04 ? 0. 46##
4. 14 ? 0. 42##
37. 03 ? 9. 98
1. 93 ? 1. 56* * ( CTX )
6. 11 ? 2. 83##
4. 58 ? 1. 03##
0. 044 ? 0. 006
0. 169 ? 0. 007* * ( PHA)
0. 230 ? 0. 010##
0. 189 ? 0. 017v
注:与正常组比较, * * P ﹤ 0. 01; 与模型组比较, v P ﹥
0. 05, ## P﹤ 0. 01。
4 讨 论
单核巨噬细胞的活性及其吞噬能力是衡量机体非特异
性免疫功能的标志之一。本文采用含药血清体外培养 MÆ
实验, 考察 MÆ的活性及其体外吞噬 CRBC功能, 并结合整
收稿日期: 2007 - 12 - 12
基金项目:广西省科技厅资助项目 (桂科基 0639039)
作者简介:唐炳兰 ( 1979 - ) ,女 (瑶族 ), 广西百色人,硕士研究生,
研究方向:中药药理。
通讯作者:马丽焱 ( 1963 - ) ,女,江苏无锡人, 研究员, 硕士研究生
导师,博士,研究方向:中药药理。
体实验方法,多角度研究楮实子对单核巨噬细胞的活性及
其吞噬能力的影响。体外培养的 MÆ虽不具增殖能力, 但
当 MÆ活化时, 其还原 MTT能力比静止细胞还原作用
强 [3]。本文采用 MTT法考察含药血清体外培养的 MÆ活
性, 实验结果表明,药物对体外培养的 MÆ活性的影响与药
物对体外 MÆ吞噬 CRBC功能的影响相关一致, 但体内外
实验结果未必完全一致。
据文献报道, 楮实子有提高机体免疫功能的作用 [1 ],
但它对网状内皮细胞吞噬功能的影响尚未见具体实验研究
报道。本文实验结果揭示楮实子显著提高小鼠碳粒廓清水
平, 但体外实验表明楮实子不具有提高 MÆ活性及其促进
MÆ吞噬 CRBC的作用,反映了体内外实验的差异性, 说明
体外实验结果不能完全代替体内实验结果。
血清溶血素水平高低与 B细胞分泌抗体密切相关, 是
反映体液免疫功能的重要指标。淋巴细胞转化实验可用来
研究中药的有效成分对细胞免疫功能的影响。虽有文献报
道楮实子有提高机体免疫功能的作用,但它对血清溶血素
水平的影响和对淋巴细胞转化的影响尚未见具体实验研究
报道。本文实验结果表明,楮实子能显著促进免疫抑制小
鼠的血清溶血素的生成,但楮实子对淋巴细胞的增殖无显
著促进作用。
参考文献
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进作用 [ J ].中药药理与临床, 1997( 5 ): 27 - 29.
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1993: 757 - 759.
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卫生出版社, 2002.
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中国免疫学杂志, 1999, 15( 4) : 46.
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中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
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中华中医药
学刊
我国民族药抗流感的应用与研究
唐炳兰 1,缪剑华1,马丽焱 2
( 1. 中国医学科学院药用植物研究所广西分所, 广西 南宁 530023; 2.中国医学科学院医药用植物研究所,北京 100094)
摘 要:对蒙、藏、维、侗、彝、布衣、哈尼族等民族常用的抗流感药方及其疗效、抗流感民族药的现代研究和开
发利用进行综述。
关键词:民族药; 抗流感;疗效; 开发
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 1673 - 7717( 2008) 05 - 1025 -03
Applica tion and Research on Anti- influenza Formulas from M inorities of China
TANG Bing-lan1, L IAO Jian-hua1, MA L i-yan2
( 1. Guangxi B ranch Station, the Insti tue ofM edicina lP lan tDevelopm en,t C hinese A cadem y ofM ed ica lS cien ces, N anning 530023,
Gu angx,i Ch ina; 2. The Insti tue ofM edicina lP lan tD evelopm en,t C hinese A cadem y ofM ed icalS cien ces, Bei jing 100094, C h ina)
Abstract: C lin ica l applica tion, research and deve lopm ent of anti - influenza fo rmu las from m ino rities of China such
asM ongo lian nationality, Z ang na tiona lity, Uygur nationality, Dong M ino rity, Y i e thnic m inority, Bu - y i ethnic m ino rity
and H a - ni ethn ic m ino rity, etc we re rev iew ed.
Keywords: m inorities herbs; anti - in fluenza; currative e ffec;t deve lopm en t
病毒性流行性感冒简称流感, 是由流感病毒引起的一
种急性呼吸道传染病。流感病毒为正黏病毒科 RNA病毒,
根据其核蛋白 ( NP )和膜基质蛋白 M 抗原性不同可分为甲
( A )、乙 ( B )、丙 ( C ) 3型。甲型流感病毒又因其表面蛋白
红细胞凝集素 ( HA )和神经氨酸酶 ( NA )的抗原性可区分
亚型 (H1 -H15和 N1 -N 9 ) [1]。流感具有患病率高、流行广
泛、传播迅速的特点,是我国重点预防与控制的病毒性传染
性疾病。
目前流感的防治以疫苗和化学药物为主。流感病毒疫
苗在同型免疫的情况下对健康成年人的保护率可达 80%
~ 90% ,但它存在接种率低 ( 5% ~ 10% )、对儿童和老年人
的保护率仅为 40% ~ 60%、毒株易发生变异而疫苗研发相
对滞后等缺陷 [2]; 化学药物均有不同程度的副作用, 并且
易产生抗药性毒株。近年来, 国内外许多学者致力于高效、