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食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第07期 生物工程
收稿日期：2013-01-22 *通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目(31160312)。
作者简介：张国良(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。
张国良，白羽嘉，张 乐，谢现英，冯作山*
(新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)
摘要：阿魏侧耳属低温栽培的食用菌，菌丝体必须经过低温处理后才能发育形成子实体，以
阿魏侧耳为对象，研究低温处理对菌丝体漆酶、酪氨酸酶活力及同工酶表达的影响。采用液
体培养方式，25 ℃振荡培养7 d，10 ℃低温处理3、6、9、12、24、36、48 h，测定菌丝体漆
酶、酪氨酸酶活力，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定漆酶、酪氨酸酶同工酶。结果表明：10
℃处理9~12 h漆酶活力明显提高，处理24 h以后漆酶活力变化趋于稳定；10 ℃处理3~12 h，
酪氨酸酶活力低于25 ℃培养，10 ℃处理12~48 h，酪氨酸酶活力出现明显的提高。10 ℃处理
菌丝体，漆酶同工酶出现30.0 ku P.ferulae Lacc-1、33.0 ku P.ferulae Lacc-2和45.0 ku P.ferulae
Lacc-3三条酶带，其中P.ferulae Lacc-2为低温诱导产生；酪氨酸酶出现28.0 ku P.ferulae Tyr-1和
43.5 ku P.ferulae Tyr-2两条酶带，与25 ℃培养相比，10 ℃处理菌丝体P.ferulae Tyr-1活力减弱，
P.ferulae Tyr-2活力增强。低温处理对阿魏侧耳菌丝体漆酶、酪氨酸酶酶活力及同工酶产生了明
显的影响。
关键词：低温处理；阿魏侧耳；漆酶；酪氨酸酶；同工酶
中图分类号：TS 201.2+5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)07-0015-05
Effect of low temperature treatment on laccase and tyrosinase and
isoenzyme in Pleurotus ferulae
ZHANG Guo-liang, BAI Yu-jia, ZHANG Le, XIE Xian-ying, FENG Zuo-shan*
(College of Food Science and Pharmaceutical Science, Xingjiang Agricultural University,
Urumqi 830052)
Abstract: Pleurotus ferulae low temperature cultivated edible fungus, mycelium must through the low
temperature treatment to development form fruiting body. This study used Pleurotus ferulae as object
to research the effect of low temperature treatment on laccase, tyrosinase activity and isoenzyme
expression in mycelium. By liquid-quivering culturing, mycelium was treated at 10 ℃ for 3 h, 6 h, 9 h, 12
h, 24 h, 36 h, 48 h separately after 7 days of cultivating at 25 ℃. Then detected the activity of laccase and
tyrosinase, furthermore native polyacrylamide gel electrophoresis were used to make an analysis of the
isoenzyme. The study shows that the activity of laccase signifi cantly increase under 10 ℃ for 9~12 h and
低温处理对阿魏侧耳漆酶、
酪氨酸酶及同工酶的影响
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阿魏侧耳[1]Pleurotus ferulae又称阿魏菇，其
色泽洁白、营养丰富，是侧耳属中最具经济价值
的品种，阿魏菇起源于新疆冬季气候寒冷的阿勒
泰、伊犁、塔城等地区[2]。阿魏菇是低温型食用
菌，生理成熟的菌丝体必需经过0~15 ℃低温处理
才能有效诱导菌丝分化和子实体发育。食用菌生
长发育分为营养生长阶段和生殖生长阶段。大部
分食用菌营养生长所需温度基本相近，而生殖生
长所需温度差别较大，不同种类的食用菌、同一
种类不同品种甚至同一品种不同生长阶段的食用
菌生长发育所需的温度也有所不同。目前国内外
学者以白灵菇[3-5]、杏鲍菇[6]、金福菇[7]、大球盖
菇[8]、外生菌根菌松乳菇和高大环柄菇[9]以及红
菇[10]等为材料，研究不同温度对菌丝生长发育的
影响，比较菌丝在不同温度下的生长差异、子实
体的分化数量和质量。
漆酶和酪氨酸酶广泛存在于高等真菌中，是
降解木质素的关键酶[11]。漆酶和酪氨酸酶活性高
表明真菌对木质素的降解加快，菌丝生长速度加
快，同时开始大量地积累营养物质[12-13]。漆酶和
酪氨酸酶同工酶与食用菌种类、组织部位和生长
发育阶段等因素有密切关系[14]。研究低温处理对
阿魏侧耳菌丝体漆酶、酪氨酸的影响，分析其动
态变化规律，有助于了解低温对阿魏菇菌丝生理
代谢产生的作用，为栽培阿魏菇的生长发育、品
质调控提供研究基础和方法借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
供试菌株：阿魏侧耳，新疆农业科学院。
马铃薯浸出粉：北京奥博星公司；葡萄
糖、邻苯二酚、醋酸、无水醋酸钠、聚乙二醇
6000(PEG6000)、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、Triton
X-100、对氨基苯磺酸、磷酸、氯化钠、乙醇、
盐酸：分析纯；2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-
磺酸)(ABTS)、过氧化氢酶：Sigma公司；牛血清
蛋白(BSA)、考马斯亮蓝G-250、丙烯酰胺、甘氨
酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、过硫酸铵、四甲基
乙二胺(TEMED)：上海生物工程公司。
1.2 仪器与设备
TU-1810C型紫外-可见分光光度计：北京
普析通用公司；DYY-6C电泳仪、DYCZ-24D电
泳槽：北京市六一仪器厂；TY-80R脱色摇床：
江苏省金坛市医疗仪器厂；TGL-16 gR高速冷
冻离心机：上海安亭科学仪器厂；THZ-98C恒
温振荡器、无菌接种台：上海一恒科学仪器有
限公司；FE20实验室pH计：梅特勒-托利多仪
器有限公司；电热恒温水浴锅：北京市永光明
医疗仪器厂。
1.3 实验条件
1.3.1 PDA培养基制备 马铃薯浸出粉300 g，葡萄
糖20 g，水1000 mL，115 ℃灭菌15 min，自然冷却
至室温。
1.3.2 处理方法 250 mL液体培养基接种2.5 mL液
体菌种，25 ℃、160 r/min震荡培养7 d。25 ℃处理
(对照组)3、6、9、12、24、36、48 h；10 ℃低温
处理3、6、9、12、24、36、48 h。
1.3.3 样品的处理 收集菌丝体，用PBS缓冲液冲
洗3次，3000×g离心10 min，除去水分，液氮研磨
成粉。
1.3.4 粗酶液的制备 取0.5 g研磨后的菌丝体，加
入1 mL PBS缓冲液混匀，4 ℃提取30 min，8000×g
离心30 min，收集上清液即为漆酶酶液。取0.5 g研
磨后的菌丝体，加入50 mmol/L的醋酸-醋酸钠提
取缓冲液(含1 mmol/L PEG、4% PVPP、1% Trition
X-100，pH5.5)，4 ℃提取15 min，10000×g离心
10 min，收集上清液即为酪氨酸酶酶液。
1.3.5 漆酶活力测定 2.5 mL 50 mmol/L醋酸-醋酸
begins to stabilize after 24 h. As for the activity of tyrosinase, 10 ℃ for 3~12 h is lower than 25 ℃, but it
signifi cantly increased during 12~48 h. Three laccase isoenzyme bands: 30.0 ku P.ferulae Lacc-1, 33.0
ku P.ferulae Lacc-2 and 45.0 ku P.ferulae Lacc-3 appeared in 10 ℃ treatment. Among which P.ferulae
Lacc-2 is induced by low temperature treatment. Two tyrosinase isoenzyme bands: 28.0 ku P.ferulae Tyr-1
and 43.5 ku P.ferulae Tyr-2 appeared in 10 ℃ treatment. The activity of tyrosinase isoenzyme P.ferulae
Tyr-1 reduced and P.ferulae Tyr-2 increased under 10 ℃ treatment compared with 25 ℃ cultivation. Low
temperature treatment on Pleurotus ferulae mycelium laccase, tyrosinase enzyme activity and isozyme
produced had a signifi cant infl uence.
Key words: low temperature treatment; Pleurotus ferulae; laccase; tyrosinase; isoenzyme
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FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2013年 第38卷 第07期 生物工程
钠缓冲液(pH5.5)中加入400 μL ABTS(20 mg/100
mL)、0.1 mL粗酶液，在420 nm波长处测吸光度
值，每15 s读取1次，连续测量10 min[15-16]。以每克
鲜重样品每分钟吸光度变化值增加0.01时为1个酶
活性单位(U)。计算公式为：
式中：△OD为反应混合液的吸光度变化值；
V为样品提取液总体积，mL；
△t为反应时间，min；
VS为测定时所取样品提取液体积，mL；
W为样品质量，g。
1.3.6 酪氨酸酶活力测定 4.0 mL 50 mmol/L的醋
酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)加入1.0 mL 50 mmol/L邻
苯二酚、0.1 mL酶液，反应15 s。测定420 nm吸光
度值，每1分钟读取1次，连续10次。以每克鲜重
样品每分钟吸光度变化值增加1时为一个酶活性单
位(U)。计算公式为：
式中：△OD为反应混合液的吸光度变化值；
V为样品提取液总体积，mL；
△t为反应时间，min；
VS为测定时所取样品提取液体积，mL；
W为样品质量，g。
1.3.7 Bradford测定蛋白质含量 蛋白质标准溶液
的配制：精确称取(BSA)10 mg，PBS缓冲液定容
至100 mL，配成0.1 mg/mL的蛋白质标准溶液。考
马斯亮蓝G-250试剂：100 mg考马斯亮蓝G-250，
溶解于50 mL 95%的乙醇，加入120 mL 85%的磷
酸，用纯水稀释至1 L。按照表1加入试剂并震荡
混匀，25 ℃反应2 min，测定595 nm处吸光度值。
表1 Bradford法测定蛋白含量
编号 蛋白质标准溶液/mL
蛋白质含
量/μg 水/mL 工作液/mL A595
1 0.00 0.0 1.00 5.00 0.001
2 0.10 10.0 0.90 5.00 0.131
3 0.20 20.0 0.80 5.00 0.215
4 0.40 40.0 0.60 5.00 0.479
5 0.60 60.0 0.40 5.00 0.765
6 0.80 80.0 0.20 5.00 0.946
7 1.00 100.0 0.00 5.00 1.057
1.3.8 同工酶电泳 采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶
电泳，10%分离胶，5%浓缩胶，蛋白上样量200
μg。4 ℃、60 mA恒流电泳至溴酚蓝位移距玻板
下端1 cm处。
(1)漆酶染色：电泳结束后，用50 mmol/L醋
酸钠缓冲液(pH5.5)仔细清洗凝胶，加入染色液(50
mmol/L醋酸钠缓冲液200 mL、50 mg ABTS、125 U/
mL过氧化氢酶，pH5.5)，40 ℃孵育至凝胶中出现
漆酶的绿色条带[17]。
(2)酪氨酸酶染色：电泳结束后，用纯水清洗
凝胶，加入染色液(100 mmol/L磷酸-磷酸钠缓冲
液200 mL、儿茶酚415 mg、对氨基苯磺酸50 mg，
pH6.5)，30 ℃孵育至凝胶中出现酪氨酸酶红棕色
条带[18]。
2 结果与分析
2.1 温度对漆酶活力的影响
图1 25、10 ℃处理阿魏菇漆酶活力变化
图2 25、10 ℃处理阿魏菇酪氨酸酶活力变化
图1表明，25 ℃培养阿魏侧耳菌丝体，漆酶
变化不明显。10 ℃处理3~48 h漆酶活力增加显著
(p<0.01)，10 ℃处理9~12 h漆酶活力明显提高，处
理24 h以后漆酶活力变化趋于稳定。阿魏侧耳属
于低温菇类，必须经过适当的冷刺激后才能诱导
菌丝分化，形成原基，产生子实体。漆酶在真菌
生长过程中主要作用是降解木质素、纤维素成为
可利用的糖类，低温处理显著提高了菌丝体漆酶
活力，在处理24 h后活力很高，推测菌丝在后续
过程中需要大量的糖类，低温诱导菌丝产生漆酶
以降解这类物质。
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图2表明，25 ℃培养阿魏侧耳菌丝体，酪氨
酸酶变化不明显。10 ℃处理3~48 h漆酶活力增加
显著(p<0.01)，10 ℃处理3~12 h，酪氨酸酶活力低
于对照组，10 ℃处理12~48 h，酪氨酸酶活力出
现明显的提高。阿魏侧耳菌丝体对温度的改变非
常敏感，培养温度由25 ℃降低到10 ℃，在开始的
3~12 h过程中，由于温度的降低，生理生化代谢
速度减慢，酶活力降低，在10 ℃处理12 h后，菌
丝体逐渐适应了这种低温环境，并对低温环境作
出了反应。
2.2 蛋白定量结果
力增强，低温处理诱导了漆酶同工酶的产生，菌
丝体在低温环境下酶的表达模式也发生了改变。
2.3.2 酪氨酸酶同工酶 采用非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳，蛋白质上样量200 μg，分离鉴定阿魏侧
图3 蛋白定量标准曲线
图5 10 ℃阿魏菇菌丝漆酶同工酶谱
图6 25 ℃各处理酪氨酸酶同工酶图谱
表2 样品蛋白含量 μg/μL
处理时间 3 h 6 h 9 h 12 h 24 h 36 h 48 h
25 ℃处理 14.03 14.09 13.11 13.25 13.94 14.00 12.96
10 ℃处理 13.28 13.65 13.54 11.99 13.25 12.85 12.92
标准曲线y=0.191x-0.2506，R2=0.9932，测定
各样品的蛋白质浓度，按每个点样孔上样200 μg
蛋白质，计算上样体积。
2.3 同工酶图谱
2.3.1 漆酶同工酶图谱 采用非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳，蛋白质上样量200 μg，分离鉴定阿
魏侧耳菌丝体漆酶同工酶(图4、图5)，漆酶同工
酶的种类和表达具有多样性。25 ℃培养阿魏侧
耳菌丝体出现分子量为30.0 ku P.ferulae Lacc-1和
45.0 ku P.ferulae Lacc-3两条同工酶带，P.ferulae
Lacc-1活力较强，P.ferulae Lacc-3活力较弱。10
℃处理菌丝体，出现30.0 ku P.ferulae Lacc-1、33.0
ku P.ferulae Lacc-2和45.0 ku P.ferulae Lacc-3三条
同工酶带，其中P.ferulae Lacc-2为10 ℃低温处理
过程中产生的。在10 ℃低温处理过程中P.ferulae
Lacc-1活力较25 ℃培养减弱，P.ferulae Lacc-3活
图4 25 ℃阿魏菇菌丝漆酶同工酶谱
耳菌丝体酪氨酸酶同工酶(图6、图7)。25 ℃培养
菌丝体出现分子量为28.0 ku P.ferulae Tyr-1和43.5
ku P.ferulae Tyr-2两条同工酶带。与25 ℃培养菌丝
体相比，10 ℃处理菌丝体P.ferulae Tyr-1酶活力减
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图7 10 ℃各处理酪氨酸酶同工酶图谱
弱，P.ferulae Tyr-2活力增强。在10 ℃低温处理过
程中P.ferulae Lacc-1低温处理改变了菌丝体酪氨酸
酶的表达模式。
3 结论
25 ℃培养阿魏侧耳菌丝体，漆酶变化不明
显，10 ℃处理9~12 h漆酶活力明显提高，处理24
h以后漆酶活力变化趋于稳定。25 ℃培养阿魏侧
耳菌丝体，酪氨酸酶变化不明显，10 ℃处理3~12
h，酪氨酸酶活力低于25 ℃培养，10 ℃处理12~48
h，酪氨酸酶活力出现明显的提高。
阿魏侧耳漆酶同工酶的种类和表达具有多
样性，25 ℃培养菌丝体出现分子量为30.0 ku
P.ferulae Lacc-1和45.0 ku P.ferulae Lacc-3两条
同工酶带，P.ferulae Lacc-1活力较强，P.ferulae
Lacc-3活力较弱。10 ℃处理菌丝体，出现30.0 ku
P.ferulae Lacc-1、33.0 ku P.ferulae Lacc-2和45.0
ku P.ferulae Lacc-3三条同工酶带，其中P.ferulae
Lacc-2为10 ℃低温处理过程中产生的。
阿魏侧耳酪氨酸酶同工酶，25 ℃培养菌丝
体出现分子量为28.0 ku P.ferulae Tyr-1和43.5 ku
P.ferulae Tyr-2两条同工酶带，与25 ℃培养菌丝体
相比，10 ℃处理菌丝体P.ferulae Tyr-1酶活力减
弱，P.ferulae Tyr-2活力增强。
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