全 文 ：2007 年 5 月　　
第 23卷第 2期　
陕西教育学院学报
Journal of Shaanx i Institute of Education
　　May , 2007
Vol.23　No.2
杜仲叶提取物的体外抗氧化作用
刘　静
(陕西教育学院生命科学系 , 陕西西安　710061)
摘　要:通过测定杜仲叶提取物对 O -2 和·OH 的清除率 ,对小鼠红细胞氧化溶血的影响和对各脏器 MDA生成
的抑制率 ,评价杜仲叶提取物的体外抗氧化作用 。实验结果表明 ,杜仲叶提取物具有明显的体外抗氧化作用。
关键词:杜仲叶;体外抗氧化;自由基
中图分类号:Q946-33;R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-598X(2007)02-0065-03
杜仲(Eucommia ulmiodes O liver)为被子植物门杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属落叶乔木 , 是一种名贵药材。《神农本草经》
将其列为上品 ,它具有补中益气 、坚筋骨 、强志 、安胎……久服轻身耐老之功效。长期以来 , 人们都以杜仲皮入药 , 近年来的研
究表明[ 1 , 2 , 3] , 杜仲叶与皮具有相似的化学成分和药理作用 ,可代皮供药用。为了开发利用这一天然资源 , 我们对杜仲叶的体
外抗氧化作用进行了实验研究。
1　材料与方法
1.1　材料
杜仲叶:采自秦岭山区 , 提取液由陕西教育学院生命科学系生化实验室制备。
1.2　动物
1月龄的 ICR小鼠 ,体重 20±2克 , 雌雄兼用。由陕西省中医药研究院实验动物中心提供(陕医动字 08-004 号)。
1.3　实验方法
1.3.1　对 O-2 的清除率的测定[ 4]
每支试管加入 3mlT ris-HCl 缓冲液(pH8.2), 0.1ml 不同药液或溶媒 , 25℃±0.5℃水浴平衡 20min 后 , 加入 0.3ml
7mmol.L-1的邻苯三酚 ,准确反应 4min ,各加入 1ml 10mo l.L-1 HCl终止反应 , 420nm 测 A值 , 计算清除率。
1.3.2　对·OH 清除率的测定[ 5]
用 FeSO 4+H2O2 产生·OH , 以·OH 氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示·OH 的多少 , 吸光值越大 ,·OH 越多。 3ml反应
液中含 0.15mmol.L -1FeSO4 , 6mmol.L-1H2O2 , 2mmol.L-1水杨酸钠及不同浓度的药物 ,最后加 H2O2 启动反应 , 37℃反应 1h ,
测 510nm 吸光值 ,吸光值越低 ,清除·OH 效果越好。
1.3.3　对小鼠红细胞氧化溶血的影响[ 6]
小鼠眼眶取血分离红细胞 ,生理盐水洗 3次后制成 0.5%悬液。取红细胞悬液 1ml , 加不同浓度的杜仲叶提取液 , 最后加
100mmol.L-1H2O2 混匀 , 37℃温浴 1h , 用生理盐水稀释 5 倍 , 1000g 离心 10min , 取上清液于 415nm 比色测定 , 以对照组为
100%溶血 , 计算溶血度。
1.3.4　丙二醛(MDA)含量的测定
组织匀浆制备:用引颈法处死小鼠 , 迅速取其肝 、心组织 ,冰浴下匀浆 , 制成 5%的悬液。
肝亚细胞制备:肝组织于冰浴下以 0.25mol.L-1蔗糖缓冲液制成 10%匀浆 , 1000g 离心 10min ,沉淀用预冷的 0.25mol.
L-1蔗糖缓冲液洗 2 次 ,合并上清液 , 以 10000g 离心 20min ,沉淀用 0.25mol.L-1的蔗糖缓冲液洗 2 次 ,合并上清液 , 所得沉淀
即为纯化的线粒体[ 7] 。
MDA 的测定[ 5] :取 1ml组织匀浆液或肝亚细胞悬液 ,加入不同浓度的杜仲叶提取物 , 再加入 6mmol.L-1 FeSO4100μl , 最
65
收稿日期:2007-01-15
作者简介:刘静(1978-), 女 ,辽宁朝阳人 , 陕西教育学院生命科学系助教。
后加 60mmol.L -1H2O2 40μl。在 37℃下 ,水浴 1h 后 ,加入 15%TCA 1ml结束反应 , 再加入 0.67%TBA 1ml , 于沸水浴中显色
15min , 冷却后离心 ,测 532nm 吸光度 ,以吸光度表示 MDA 含量多少 ,吸光值越大 , MDA含量越高。
2　结果与讨论
进行体外实验可以排除体内实验的复杂性 , 如药物在体内的分解 、代谢 、吸收 、转化等 , 药物与体内物质如抗氧化酶 、微量
元素等的相互作用 ,药物有效成分的利用度等各种问题 , 从而能够更为直接地观察药物的治疗效果 , 为药物的体内实验提供
实验依据 ,对于阐明药物的作用机制有一定帮助。
2.1　对 O-2 的清除率
　　O-2 是活性氧的一种 , 是机体内寿命最长的自由基 , 通常
作为自由基链式反应的引发剂 ,产生活性更强的自由基 , 在体
内由过氧化物歧化酶清除。如果体内过氧化物歧化酶活力下
降或 O-2 产生过量都会给机体造成危害。 本实验通过邻苯三
酚自氧化产生 O-2 , 来观察杜仲叶提取物在体外对 O-2 有无抑
制或清除作用 ,结果如表 1 所示。
由表 1 结果显示 ,加药组的 A420nm 值均低于对照组 ,表
明杜仲叶提取物可以清除 O-2 或使 O-2 的生成减少 , 当杜仲
叶提取物的浓度达到 8.00μg/ml时效果显著。
表 1　杜仲叶提取物对 O-2 的清除作用
( X±SD , n=6)
组别 剂量(μg.ml-1) A420nm 抑制率(%)
对照组 0 0.120±0.012 —
加药组 2.00 0.106±0.012 11.67
加药组 4.00 0.103±0.025 14.12
加药组 8.00 0.099±0.006＊ 17.50
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05
2.2　对·OH 的清除率
·OH 是氧化性极强的氧化剂 , 不仅是膜脂质过氧化的罪
魁祸首 ,它还一直被认为是引起 DNA损伤的重要因素。本实
验测定杜仲叶提取物在体外对·OH有无抑制作用 , 结果如表 2
所示。
表 2结果显示 , 杜仲叶提取物各剂量组的 A510nm 值均
小于对照组 ,数据差异极显著 , 说明杜仲叶提取物对·OH 有良
好的清除作用 ,且有一定的量效关系。
表 2　杜仲叶提取物对·OH 的清除作用
( X±SD , n=6)
组别 剂量(μg.ml-1) A510nm 抑制率(%)
对照组 0 0.302±0.010 —
加药组 2.00 0.224±0.009＊＊ 25.83
加药组 4.00 0.213±0.015＊＊ 29.47
加药组 8.00 0.206±0.016＊＊ 31.79
　　注:与对照组比较 , ＊＊P<0.01
2.3　杜仲叶提取物对小鼠红细胞溶血的影响
　　红细胞是机体运输O 2 和CO2 的细胞 ,含有引发催化脂质
过氧化作用的物质血红蛋白 ,膜上又含有大量不饱合脂肪酸 ,
因此容易受到氧化损伤。 本实验用 H2O2 诱导红细胞氧化溶
血来研究杜仲叶提取物对红细胞膜氧化损伤的抑制作用。结
果如表 3 所示。
表 3 结果显示 ,正常的红细胞在体外温育过程中有轻微
的溶血现象 ,这与报道结果一致[ 8] 。 模型组与正常组有极显
著差异 ,说明 H2O2 可以诱导红细胞的氧化溶血;加药组低于
模型组 ,差异显著或极显著 , 且呈一定的量效关系 , 说明杜仲
叶提取物可以抑制红细胞的氧化溶血。
表 3　杜仲叶提取物对红细胞氧化溶血的影响
( X±SD , n=6)
组别 剂量(μg.ml-1) A415nm 溶血度(%)
正常组 0 0.21±0.06＊＊ 15.33
模型组 0 1.37±0.09 100.00
加药组 15 0.92±0.08＊ 67.15
加药组 30 0.66±0.09＊＊ 47.18
加药组 60 0.54±0.10＊＊ 39.42
　　注:与模型组比较 , ＊P<0.05 ＊＊P<0.01
2.4　杜仲叶提取物对小鼠心 、肝匀浆及肝线粒体脂质过氧化产物生成的影响
MDA 为脂质过氧化产物 , 它可与含有游离氨基的蛋白质 、磷脂酰乙醇胺及核酸等进行多次交联 ,连接成比原来大许多倍
的大分子 , 致使膜蛋白变性 , 膜酶失活 ,膜受体失效 , 出现膜结构的破坏 , 膜流动性下降 , 膜脆性和通透性的增加 ,导致生物膜
结构和功能的异常 ,影响机体的物质代谢 , 能量代谢和信息传递 , 从而危及正常的生命活动。其生成的多少可以反映出组织
细胞的受损程度。
在生物体内 90%以上的氧分子在线粒体中被消耗 , 氧作为呼吸链的终电子受体参与产生 ATP的氧化磷酸化反应 ,是维
持生命的重要能量代谢过程 ,但是氧通过一系列化学反应生成有害的氧自由基 , 造成细胞损伤并导致疾病和衰老。实验证明
线粒体是细胞中产生活性氧的一个重要部位 , CHANCE 等[ 9]证明在正常生理情况下约有 2%的氧消耗于线粒体活性氧的产
生 ,生成活性氧的前体是 O-2 和 H2O 2 , 它们是呼吸链底物端漏出的电子引起氧分子单电子还原生成的。本实验用 FeSO 4 和
H2O 2产生·OH 来诱导组织脂质过氧化 , 测定了杜仲叶提取物对小鼠心 、肝匀浆及肝线粒体中 M DA 生成的影响 , 结果如表 4、
66
表 5、表 6 所示。
表 4　杜仲叶提取物对小鼠心匀浆中
　　MDA生成的影响( X±SD , n=6)
组别 剂量(μg.ml-1) A532nm 抑制率(%)
正常组 0 0.06±0.01＊＊ —
模型组 0 1.42±0.05 —
加药组 15 0.83±0.02＊＊ 41.55
加药组 30 0.68±0.02＊＊ 52.11
加药组 60 0.34±0.03＊＊ 76.06
　　注:与模型组比较 , ＊＊P<0.01
表 5　杜仲叶提取物对小鼠肝线粒体中
　　MDA 生成的影响( X±SD , n=6)
组别 剂量(μg.ml-1) A532nm 抑制率(%)
正常组 0 0.08±0.03＊＊ —
模型组 0 1.36±0.09 —
加药组 15 0.83±0.08＊＊ 38.97
加药组 30 0.65±0.07＊＊ 52.21
加药组 60 0.36±0.05＊＊ 73.53
　　注:与模型组比较 , ＊＊P<0.01
表 4、表 5、表 6 显示 ,模型组与正常组相比 ,MDA 的生成
量增加 , 数据差异极显著 , 说明·OH 可使小鼠心脏 、肝脏及肝
线粒体的脂质过氧化反应加速。加药组与模型组相比 MDA
的含量显著下降 ,数据差异显著或极显著 , 说明杜仲叶提取物
可以有效抑制·OH 所致的小鼠组织及肝亚细胞脂质过氧化的
发生 ,保护细胞膜的完整性 , 从而保护组织免受损伤 , 而且抑
制率随杜仲叶提取物浓度增加而提高。
表 6　杜仲叶提取物对小鼠肝匀浆中
　　MDA 生成的影响( X±SD , n=6)
组别 剂量(μg.ml-1) A532nm 抑制率(%)
正常组 0 0.07±0.01＊＊ —
模型组 0 1.22±0.06 —
加药组 15 0.74±0.02＊ 39.34
加药组 30 0.62±0.03＊＊ 49.18
加药组 60 0.32±0.03＊＊ 73.77
　　注:与模型组比较 , ＊P<0.05 ＊＊P<0.01
[ 参 考 文 献]
[ 1] 　王景祥.杜仲叶与杜仲皮的成分比较中草药[ J] .1987 , 18(3):11.
[ 2] 　张康健.杜仲叶与皮有效成分含量的比较研究[ J] .西北林学院学报 , 1996 , 11(2):42.
[ 3] 　宋丽青.杜仲叶与杜仲皮的药理试验[ J] .中草药 , 1986 , 17(2):15.
[ 4] 　王书芳 ,王勤 , 潘静 ,等.吡咯啉氮氧自由基及衍生物抗大鼠不同组织脂质过氧化损伤[ J] .中国药理学通报 , 2001 , 17
(4):424-427.
[ 5] 　王建华 , 张民 ,甘璐 , 等.枸杞多糖-1 对羟自由基所致小鼠肝线粒体损伤的作用[ J] .中国药学杂志 , 2001 , 36(10):669.
[ 6] 　田京伟 , 杨建雄.白藜芦醇苷的体外抗氧化活性[ J] .中草药 , 2001 , 32(10):918-920.
[ 7] 　曹炜 , 尉亚辉 ,杨建雄.蜂胶对氧自由基和四氧嘧啶致小鼠肝脏损伤的保护作用[ J] .中草药 , 2001 , 32(11):1013-1015.
[ 8] 　冯立明 , 潘华珍 , 闵福宝 , 等.麦芽醇对红细胞氧化损伤的保护作用[ J] .中国药理学通报 , 1990 , 11(6):26.
[ 9] 　CHANCE B , SIES H , BOVERIS A.Hydropero xide metabolism in mammalian organs[ J] .Physiological Review s , 1979 , 59
(3):527-605.
[ 责任编辑　朱毅然]
The Vitro Anti-oxidative Experimental Study
of Extracts from Eucommia Ulmiodes Olirer Leaves
LIU Jing
(Depar tment o f life science Shaanxi education stitucade , Xi an 710061 , China)
Abstract:A study of vit ro anti-oxidative of ex t racts f rom Eucommia ulmiodes Olirer Leaves is conductes.
The elimination O-2 and ·OH , the generation of MDA in heart 、liver and liver mitochondrion w ere determined.
The results show the ext racts of Eucommia ulmiodes Olir leaves have the activity of vi tro anti-oxidative resis-
tance.
Key words:Eucommia ulmiodes Olir leaves;vi tro anti-oxidative;f ree radical
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