全 文 ：China Brewing
2013 Vol.32 No．12
Serial No．261
栒子（Cotoneaster multiflorus Medic.）为蔷薇科栒子属
（Cotoneaster）落叶灌木，在我国分布广泛。我国约有50种
栒子属植物，占全球栒子属植物种类数的一半以上。国外
研究发现，栒子属植物中含有多种黄酮[1]、黄酮醇[2]、异黄
酮[3]、黄酮苷[4]及二苯并呋喃类植物抗毒素成分[5-6]。开发黄
酮类化合物作为自由基清除剂是目前国内外的研究热点[7]。
在我国，栒子因其木材质地坚韧，作为砧木使用[8]，或用作
手杖或器物柄[9]；同属的灰栒子（C. acutifolius Turcz）为藏
药，有凉血和止血的功能，民间曾用来治疗月经过多、缓解
牙龈出血等症[10]。多数种类的栒子可作观赏植物，且果肉
含有多种营养物质，具有较高的开发和利用价值[11-12]。水栒
子原产我国黑龙江、新疆、内蒙古等省区，朝鲜、亚洲北部
至欧洲亦有分布[9，14]。目前国内关于水栒子较多的研究集
中在栽培、育苗技术[15-18]及植物群落多样性[19-25]。近年来研
究发现，水栒子具有较优良的生物活性[26-27]，且其种子油脂
成分较高，是一种有待开发的油料树种[28]。本实验采用匀
浆法对水栒子果肉黄酮进行提取，采用 DPPH自由基清除
法、ABTS自由基清除法、超氧阴离子自由基清除法
（superoxide radicals scavenging assay，SRSA）、还原能力测
定法和铁离子还原/抗氧化能力法（ferric reducing antiox-
idant power，FRAP）对黄酮粗提物的体外抗氧化活性进行
研究，希望对栒子属植物资源的开发利用有所启示。
水栒子果肉黄酮的体外抗氧化活性研究
贾 佳1，刘春萍2，许璟龙3
（1.大庆医学高等专科学校 药学检验系，黑龙江 大庆 163312；2.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；
3.大庆油田有限责任公司第二采油厂，黑龙江 大庆 163414）
摘 要：以水栒子果肉总黄酮的粗提物为原料，测定其体外抗氧化能力。利用匀浆法提取水栒子果肉黄酮，比色法测定其含量。采用
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法、2，2-吖嗪双（3-乙基-7-苯并噻唑啉磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除法、超氧阴离子
自由基清除法（SRSA）、还原能力测定法和铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP），对其进行体外抗氧化活性研究。结果表明，水栒子果
肉总黄酮的自由基清除能力和还原能力随总黄酮浓度的升高而增强，DPPH自由基清除能力和超氧阴离子自由基（O-2·）清除能力与
特丁基对苯二酚（TBHQ）相当，高于丁基羟基甲苯（BHT）、丁基羟基茴香醚（BHA）、VC、VE；ABTS清除能力高于BHT、VC、VE，略低
于TBHQ和BHA；还原能力与TBHQ相当，高于BHT、VE，略低于BHA和VC；铁还原能力与TBHQ相当，高于BHT、VC、VE，低于BHA。
水栒子果肉黄酮有较强的体外抗氧化能力，具有很好的开发潜力。
关 键 词：水栒子；总黄酮；自由基；体外抗氧化
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2013）12-0052-05
Antioxidant activity of total flavonoids from Cotoneaster multiflorus pulp in vitro
JIA Jia1, LIU Chunping2, XU Jinglong3
(1.Department of Pharmacy and Medical Laboratory, Daqing Medical College, Daqing 163312, China；
2.School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；
3.The Second Oil Production Plant, Daqing Oilfield Co., Ltd., Daqing 163414, China)
Abstract: Taking the crude extract of total flavonoids from the Cotoneaster multiflorus pulp as material, the antioxidant activity was measured in vit-
ro. The method of homogenate was utilized to extract the total flavonoids of the C. multiflorus pulp, and colorimetry to measure the content. The an-
tioxidant activity of total flavonoids in vitro was measured by DPPH method, ABTS method, SRSA method, FRAP method and reducing capacity
method. The results showed that the free radical scavenging activity and reducing capacity were enhanced by the increase of flavonoids concentration.
DPPH and superoxide radical scavenging capacity was equal with TBHQ, higher than BHT, BHA, VC and VE; ABTS free radical scavenging capaci-
ty was higher than BHT, VC and VE, a little lower than TBHQ and BHA. Reducing capacity was equal with TBHQ, higher than BHT and VE, a little
lower than BHA and VC; ferric reducing capacity was equal with TBHQ, higher than BHT, VC and VE, lower than BHA. The in vitro antioxidant ac-
tivity of total flavonoids from C. multiflorus pulp was strong, so C. multiflorus would have a good development potential.
Key words: Cotoneaster multiflorus ; total flavonoids; free radical; antioxidant activity in vitro
收稿日期：2013-10-28
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目（2006BAD18B04）
作者简介：贾 佳（1983-），女，讲师，硕士，研究方向为天然产物活性成分研究。
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2013年 第 32卷 第 12期
总第 261期
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水栒子鲜果采摘于东北林业大学树木园，-70℃超低
温冰箱冷冻保存，用前解冻，将果肉与果核剥离，果肉作为
黄酮提取原料。
2，2-吖嗪双（3-乙基-7-苯并噻唑啉磺酸）二铵盐（2，
2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）、
水溶性维生素E（trolox）、氯化硝基四氮唑蓝（nitro-blue te-
trazolium chloride，NBT）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicoti-
namide adenine dinucleotide，NADH）、硫酸甲酯吩嗪（phe-
nazine methyl sulfate，PMS）、三吡啶三吖嗪（tripyridyl-tria-
zine，TPTZ）、1，1-二苯基 -2-三硝基苯肼（1，1-dipheny
l-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitroph-
enyl）hydrazyl，DPPH）、叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroqu-
inone，TBHQ）、二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，
BHT）、丁基羟基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）、L-抗
坏血酸（VC）、维生素E（VE）购自美国Sigma公司；芦丁对
照品购自西安华萃生物技术开发有限公司，其他试剂为市
售国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HR2870/00型匀浆机：荷兰Philips公司；SpectroArt 200
型紫外分光光度计：美国Wealtec公司；Allegra X-22R型台
式高速微型离心机：美国Beckman公司；SHB-Ⅲ型循环水
式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE-5229型旋
转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；PXX-KNX型电热恒温培
养箱：上海跃进医疗器械厂。
1.3 方法
1.3.1 样品处理方法
采用匀浆法制备果肉中总黄酮。称取300g水栒子果
肉，提取溶剂为体积分数75%的乙醇，料液比1∶15，匀浆提
取2min，提取2次，过滤，合并滤液。将滤液减压浓缩除去
乙醇（55℃，-0.09MPa），水相用等体积乙酸乙酯萃取3次，
合并乙酸乙酯相将其减压浓缩至干，得水栒子果肉总黄酮。
将水栒子果肉总黄酮分别配制成100μg/mL、87.5μg/mL、
75μg/mL、62.5μg/mL和50μg/mL的甲醇溶液，保存备用。
1.3.2 水栒子果肉总黄酮定量检测方法
采用比色法测定总黄酮含量。精密移取一定浓度的
甲醇溶解待测样品1mL于10mL容量瓶中，加入甲醇溶液
至5mL，随后加5% NaNO2溶液0.3mL，振荡后放置5min，加
入10%Al（NO3）3溶液 0.3mL，摇匀后放置 6min，加 4%
NaOH溶液2mL，用甲醇定容至刻度，摇匀静置10min，以未
加铝盐试剂为空白，取1mL溶液在波长500nm处测定吸
光度值。以芦丁为标准品，绘制标准曲线，计算回归方程。结
果表明，总黄酮浓度为0.005mg/mL~0.160mg/mL时呈良好
的线性关系。其线性回归方程及相关系数分别为y=12.464x+
0.0264，R2=0.9987，其中y为吸光度值（A），x为对照品质量
浓度，mg/mL。
1.3.3 DPPH自由基清除能力测定
吸取1.3.1项下系列浓度溶液以及相同浓度梯度的人
工合成抗氧化剂（BHA、BHA、TBHQ、VC、VE）的甲醇溶液
各0.1mL，加入25mg/L DPPH甲醇溶液3.9mL，混合后于暗
处静置30min，于波长517nm处测定吸光度值，空白对照
用0.1mL甲醇溶液替代样品溶液，全部吸光度值测定3次后
取平均值。DPPH自由基清除能力与样品溶液的吸光度值
负相关，DPPH自由基清除率计算公式：
SC（%）= A0-A样
A0
×100% （1）
式中：SC为 DPPH自由基清除率，%；A0为不加样品的溶液
在 t=0时的吸光度值；A 样为样品溶液的吸光度值。
1.3.4 ABTS自由基清除能力测定
将等体积的2.6mmol/L过硫酸钾溶液与7.4mmol/L
ABTS溶液混合，室温暗处反应12h得ABTS+·。取1mL
ABTS+·溶液，用适量甲醇稀释，使其在波长734nm处的吸
光度值为1.10±0.02。吸取1.3.1项下系列浓度溶液以及相同
浓度梯度的人工合成抗氧化剂（BHA、BHA、TBHQ、VC、
VE）的甲醇溶液各150μL与2850μL ABTS+·溶液混合，室
温暗处条件下反应2 h后测定其在波长744nm处吸光度值。
全部吸光度值测定3次后取平均值。以水溶性维生素E
（trolox）为标准品作标准曲线，线性回归方程相关系数 R2=
0.9976，线性范围：50μmol/L~600μmol/L。ABTS自由基清
除能力与水溶性维生素E当量（trolox equivalents，TE）正
相关，TE值计算公式：
TE=-0.01×A样 +0.5995 （2）
式中：A 样为样品溶液的吸光度值；TE为水溶性维生素 E当量。
1.3.5 超氧阴离子清除能力测定（SRSA）
吸取1.3.1项下系列浓度溶液以及相同浓度梯度的人
工合成抗氧化剂（BHA、BHA、TBHQ、VC、VE）的甲醇溶液
各1mL，与3mL磷酸钠缓冲液（100mmol/L，pH 7.4）、1mL
NBT（150μmol/L）溶液和1mL的NADH（468μmol/L）溶液
混合，通过加入1mL PMS（60μmol/L）溶液开始反应，反应
混合物于25℃水浴5min，然后在波长550nm处测定吸光
度值，空白对照用0.1mL甲醇溶液替代样品溶液测定吸光
度值，超氧阴离子清除能力与样品溶液的吸光度值负相
关，羟自由基清除能力计算公式：
SC（%）= A0-A样
A0
×100% （3）
式中：SC为超氧阴离子清除率，%；A0为不加样品的溶液在
t=0时的吸光度值；A样为样品溶液的吸光度值。
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1.3.6 还原能力测定
吸取1.3.1项下系列浓度溶液以及相同浓度梯度的人
工合成抗氧化剂（BHA、BHA、TBHQ、VC、VE）的甲醇溶液
各1mL，与2.5mL磷酸缓冲液（0.2mol/L，pH 6.6）、2.5mL铁
氰化钾溶液（1%，w/v）混合，水浴50℃反应20min后迅速冷
却，加入2.5mL三氯乙酸溶液（10%，w/v）以终止反应，
3000r/min离心10min，取上层溶液2.5mL，先后与2.5mL蒸
馏水、0.5mL三氯化铁溶液（0.1%，w/v）混合，于波长700nm
处测定吸光度值，全部吸光度值测定3次后取平均值。反
应混合物的还原能力与吸光度值正相关。
1.3.7 铁还原/抗氧化能力测定（FRAP）
将25mL醋酸盐缓冲液（0.3mol/L、pH 3.6）、2.5mLTPTZ
溶液（10mmol/L）和2.5mL FeCl3溶液（20mmol/L）混合，并
于37℃反应30min，制成TPTZ工作液。吸取1.3.1项下系列
浓度溶液以及相同浓度梯度的人工合成抗氧化剂（BHA、
BHA、TBHQ、VC、VE）的甲醇溶液各0.2mL，加入1.8mL
TPTZ工作液，混匀后于37℃暗处反应10min，波长593nm
处测定吸光度值，全部吸光度值测定3次后取平均值。以
FeSO4·7H2O为标准品作标准曲线，线性回归方程相关系
数 R2=0.9983，线性范围：50μmol/L~600μmol/L。根据反应
后吸光度值，依式（4）求得相应FeSO4的浓度（μmol/L），定
义为铁还原/抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，
FRAP）值。铁还原抗氧化活性与FRAP值正相关。FRAP值
计算公式：
FRAP=0.0019×A样 +0.079 （4）
式中：A样为样品溶液的吸光度值；FRAP为铁还原/抗氧化
能力。
1.3.8 数据统计
实验中的相关数据应用Excel 2007软件进行分析与
处理。
2 结果与分析
2.1 DPPH自由基清除能力测定
DPPH是一种稳定的色原体自由基，其醇溶液为紫色，
在波长515nm~528nm处有最大吸光度值。当DPPH自由基
遇到可以提供氢原子和电子的物质时，就会被清除，溶液
随之褪色。根据这个原理，物质的抗氧化能力可以用DPPH
自由基的清除率来表示。体系内DPPH自由基的浓度越
高，溶液的吸光度值越大；向体系内加入抗氧化剂后，溶液
的吸光度值越小则抗氧化剂的活性越强。图1的结果显示，
在0~100μg/mL有效浓度范围内，DPPH清除能力随溶液
质量浓度的增加而逐渐增强。在0~62.5μg/mL质量浓度范
围内，量效关系明显，在62.5μg/mL~100μg/mL质量浓度范
围内，DPPH自由基的清除能力的增加不明显，无明显量
效关系。水栒子果肉总黄酮的DPPH自由基清除能力与
TBHQ相当，明显高于其他4种人工合成抗氧化剂。因此，
水栒子果肉黄酮粗提物具有较强的DPPH自由基清除能力。
2.2 ABTS自由基清除能力测定
ABTS经过硫酸铵的氧化后可生成相对稳定阳离子
自由基ABTS+·，其水溶液在波长734nm处呈蓝绿色，水溶
性抗氧化剂可使ABTS+·还原成ABTS，随后溶液退色。加
入的抗氧化剂活性越强，溶液退色越明显。图2的结果显
示，在0~100μg/mL质量浓度范围内，ABTS清除能力随溶
液质量浓度的增加而逐步增强，具有明显的量效关系。水
栒子果肉总黄酮的ABTS+·清除能力显著高于BHT、VC和
VE，略低于BHA和TBHQ。因此，水栒子果肉黄酮具有较
强的ABTS+·清除能力。
2.3 清除超氧阴离子能力测定
超氧阴离子（O2-·）可通过反应生成其他形式的氧自
由基，引起氧化反应。在硫酸甲酯吩嗪（PMS）-烟酰胺腺嘌
呤二核苷酸（NADH）体系中，NADH的氧化和氯化硝基四
氮唑蓝（NBT）的还原产生O2-·，NBT则还原成在波长550 nm
处有吸光度值的二甲臜（diformazan）。体系中O2-·的浓度
越高，吸光度值越大。向体系内加入抗氧化剂后，溶液的
吸光度值越小则抗氧化剂的活性越强。图3结果显示，在
0~100μg/mL质量浓度范围内，O2-·清除能力随溶液浓度
图1 水栒子果肉总黄酮DPPH自由基清除能力
Fig. 1 DPPH free-radical scavenging ability of total flavonoids
from C. multiflorus pulp
图2 水栒子果肉总黄酮ABTS自由基清除能力
Fig. 2 ABTS free-radical scavenging ability of total flavonoids
from C. multiflorus pulp
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的增加而逐步增强，具有明显的量效关系。水栒子果肉总黄
酮的O2-·清除能力与TBHQ相当，显著高于其他4种人工合成
抗氧化剂。因此，水栒子果肉黄酮具有较强的O2-·清除能力。
2.4 还原能力测定
通常，样品的还原能力与抗氧化活性有显著的相关
性。图4结果显示，在0~100μg/mL有效浓度范围内，样品
还原能力随溶液质量浓度的增加而逐渐增强，具有明显的
量效关系。水栒子果肉黄酮的还原能力与TBHQ相当，明
显高于VE和BHT，略低于VC和BHA。因此，水栒子果肉黄
酮具有较强的还原能力。
2.5 铁还原/抗氧化能力测定
在酸性环境中，Fe3+-三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被反应
体系中的抗氧化物质还原为Fe2+形式，在波长593nm处呈
蓝色。图5结果显示，在0~100μg/mL有效质量浓度范围内，
铁还原能力随溶液浓度的增加而增强，具有明显的量效关
系。水栒子果肉总黄酮的还原能力与TBHQ相当，明显高
于BHT、VC和VE，低于BHA。因此，水栒子果肉黄酮具有
优良的还原能力。
3 结论
水栒子果肉黄酮的抗氧化能力与自由基清除能力和
还原能力有关。随黄酮质量浓度的增加，其抗氧化能力增
强。水栒子果肉黄酮粗提物的DPPH清除能力、超氧阴离
子清除能力、还原能力和铁还原能力与TBHQ相当，ABTS
清除能力略低于TBHQ，具有极好的抗氧化能力，且在有
效浓度范围内，总黄酮含量和抗氧化能力呈正相关性。
本次研究对象为水栒子果肉黄酮的粗提物，下一步的
研究方向为黄酮类化合物的分离纯化及鉴定，并比较不同
种类黄酮化合物的抗氧化活性的异同，筛选出高活性的黄
酮类化合物，为水栒子资源的多元性开发利用提供有价值
的参考依据。
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图3 水栒子果肉总黄酮超氧阴离子清除能力
Fig. 3 O2- free-radical scavenging ability of total flavonoids from
C. multiflorus Pulp
图4 水栒子果肉总黄酮还原能力
Fig. 4 Comparison of reducing ability of total flavonoids from
C. multiflorus Pulp
图5 水栒子果肉总黄酮铁还原能力
Fig. 5 Comparison of ferric reducing ability of total flavonoids
from C. multiflorus Pulp
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《中国酿造》杂志征稿启事
《中国酿造》创刊于1982年，由中国商业联合会主管，中国调味品协会及北京食品科学研究院主办的综合性科技期刊。并历次
被评为全国中文核心期刊，中国科技核心期刊，《中国知网》重点收录期刊，《万方数据库》全文收录期刊，《中文科技期刊数据库》来
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征稿范围：
（1）新工艺、新技术、新设备在酿造行业的应用；（2）调味品的研发创新与推广应用；（3）调味品产业生产管理及产品质量安全
评价；（4）食品添加剂在酿造行业的应用；（5）现代高新检测技术在酿造行业的应用；（6）酿酒产品开发、生产管理及产品质量安全
的控制；（7）发酵法制备酒精、氨基酸、高级醇及有机酸等工艺研究；（8）微生物发酵工艺及培养基发酵条件优化；（9）发酵工程菌种
的筛育与人工诱变、杂交选育及基因工程改造研究；（10）生物质能源的开发利用及规模化制备；（11）传统发酵食品生产工艺改进、
微生物菌种改良、发酵机理及规模化生产研究；（12）食品及发酵工业废水、废渣处理及综合利用；（13）益生菌及功能型发酵乳制品
研究与开发；（14）行业实用技术、政策、法规、标准及行业动态和最新举措等。
注意事项：
（1）来稿要求论点明确、数据可靠、逻辑严密、文字精炼。在文稿首页用脚注说明论文属何项目、何基金（编号）资助，本刊将优
先报道国家级、省部级及国际合作项目的科研成果；第一作者及通讯作者（一般为导师）简介（包括姓名、出生年月、性别、职称、学
位、研究方向或目前主要从事的工作、邮箱、联系电话）。（2）稿件要求8000字以内，须有中图分类号，文献标志码，中英文标题、单位、
作者，并有200～300字的中英文摘要和5～8个关键词，标题、摘要、表题、图题请用中英文对照。摘要内容应包括研究目的、方法、结
果和结论；综述文章可写指示性摘要。（3）来稿内容涉及配方时，应写明配料的名称和配比，勿用代号；工艺过程要完整，不要省
略；插图、表格需放在正文相应地方，不要集中；引用的图表要有出处，计量要用法定单位。（4）文稿参考文献一般研究论文约25篇
参考文献，不可少于20篇，综述论文不少于35篇。研究性论文和综述性论文中近5年文献不少于参考文献总数的一半，外文文献不
少于5篇，期格式请参照GT/T 7714—2005《文后参考文献著录规则》。（5）来稿必须是最新的、作者自身创造性的科研成果，且是在
中外文正式刊物上未发表的论文。本刊严禁一稿多投、重复内容多次投稿、不同文种重复投稿。（6）我刊以实现对所有来稿的文字
复制比对工作，若文字复制比超过30%的稿件我刊不予采用。（7）稿件一经录用，即被认为同意收录于《中国学术期刊（光盘版）》、
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