全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:651-654
文章编号:1001-6880(2015)4-0651-04
收稿日期:2013-10-31 接受日期:2014-02-17
基金项目:四川省教育厅重点项目(14ZA0003);四川省科技厅应
用基础计划项目(2014JY0113)
* 通讯作者 Tel:86-28-86291176;E-mail:crystal 0406@ qq． com
乌奴龙胆乙醇提取物不同极性部位体外抗氧化性研究
孔令茜1，梁晓霞1* ，何 敏1，阿呷尔布2，范巧佳1
1四川农业大学动物医学院天然药物研究中心，雅安 625014;2 西藏大学药学院，拉萨 850000
摘 要:本文以 BHT和 VC为对照，采用分光光度法，通过四种不同体系对乌奴龙胆乙醇提取物的各个极性部
位体外抗氧化活性进行比较研究。结果表明，各极性部位对 DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基均
有一定的清除作用，也具有一定的还原能力。其中氯仿部位、乙酸乙酯部位效果最佳，其总还原力和对 DPPH自
由基的清除作用均优于 BHT，本实验结果为扩展乌奴龙胆的应用范围和进一步研究其抗氧化活性成分及新型
天然抗氧化剂的开发提供了理论依据。
关键词:乌奴龙胆;乙醇提取物;极性部位;体外抗氧化活性
中图分类号:S859． 4 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 04． 019
Study on Antioxidant Activities of Different Polarity Fractions
of Ethanol Extract of Gentiana urnula H． Smith
KONG Ling-xi1，LIANG Xiao-xia1* ，HE Min1，AGA Er-bu2，FAN Qiao-jia1
1College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Sichuan Ya’an 625014，China;
2College of Pharmacy，Tibet University，Tibet Lhasa 850000，China
Abstract:With VC and BHT as positive control，the antioxidant activities of different polarity fractions of ethanol extract
of Gentiana urnula H． Smith were investigated． The results showed that all fractions had moderate antioxidant activity
through DPPH·，O-·2 ，·OH and reducing power assays． The chloroform extract and ethyl acetate extract had the stron-
gest effects，with better DPPH· scavenging effect and total reducing power than BHT． This study provided a scientific
basis for the further research of active constituents of G． urnula and its application as natural antioxidant．
Key words:Gentiana urnula H． Smith;ethanol extract;polar fractions;antioxidant activity
龙胆科龙胆属植物(Gentiana L． )广泛分布于
北半球温带地区和热带高山地区，包括欧洲、亚洲、
澳大利亚洲北部、新西兰及整个北美等地区，全世界
约有 500 余种。我国有 247 种，41 变种，分布遍及
全国，主产地为西南部。龙胆始载于《神农本草
经》，列为中品，其性苦寒，泻肝胆实火，除下焦湿
热。现代药理研究表明，该属植物多具有保肝、利
胆、健胃、中枢兴奋、抗炎、抗菌、抗氧化等作用［1］。
迄今为止，国内外学者已从龙胆属植物中分离得到
多种裂环烯醚萜苷、多糖、生物碱、黄酮等成分，其中
龙胆苦苷被认为是中药龙胆的主要有效成分，具有
显著的肝脏保护、抗炎、抗病原微生物、中枢神经兴
奋及健胃利胆作用［2］。
乌奴龙胆为龙胆科植物乌奴龙胆(Gentiana ur-
nula H． Smith)的干燥全草，藏名为冈噶琼，为龙胆
科龙胆属匐茎组平卧系植物，主要分布于西藏，属于
高原植物，生长于复杂而独特的自然条件，是中国藏
药的常用药之一。常用于清热解毒，止泻，治疗流感
发烧，咽喉肿痛，黄疸，热性腹泻，用于血和赤巴合并
症，木布病，血管闭塞，中毒发烧及黄疸病等。关于
乌奴龙胆的研究报道很少，主要集中于其主要化学
成分———环烯醚萜甙类的研究以及其抗菌活性的研
究［3，4］，其他方面的活性未见报道。作为特殊的高
原植物，长期生长在高海拔、高辐射、缺氧等极限环
境下，必然具有其独特的生化机制，有望从中发现高
效的抗氧化成分。因此本文对乌奴龙胆乙醇提取物
不同极性部位的体外抗氧化活性进行研究，为乌奴
龙胆的抗氧化活性成分和天然抗氧化剂的开发提供
理论依据。
1 材料与方法
1． 1 主要试剂
乙醇(95% )、30%过氧化氢;无水乙醇、邻苯三
酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水杨酸、盐酸、正丁醇、
乙酸乙酯、氯仿、石油醚、抗坏血酸标准品(VC)、三
氯乙酸、FeCl3 等试剂均(购于成都市科龙化工试剂
厂);FeSO4·7H2O(西陇化工股份有限公司)、铁氰
化钾(天津博迪化工股份有限公司)、Tris Base(Bei-
jing Solarbio Science＆Technology);二丁基羟基甲苯
标准品(BHT，食品级)、DPPH自由基等试剂均为分
析纯。
1． 2 仪器
SC-D3 低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有
限公司);ＲE2000B旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器
厂);SHZ-ⅢD 循环水真空泵(上海亚荣生化仪器
厂);WFZ UV-2000 紫外分光光度计［尤尼柯(上海)
仪器有限公司］;ESJ200-4 电子天平(沈阳龙腾电子
有限公司)。
1． 3 乌奴龙胆简介
乌奴龙胆购于西藏拉萨，由西藏大学药学院教
研室生药学硕士阿呷尔布老师鉴定为龙胆科植物
Gentiana urnula H． Smith。
2 实验方法
2． 1 乌奴龙胆乙醇提取不同溶剂萃取物的制备
2． 1． 1 样品的提取流程
取乌奴龙胆草粉末 40 g，按质量体积比为 1∶ 20
加入 95%乙醇浸泡 12 h，室温超声助溶提取 1 h，过
滤，滤液于 50 ℃减压浓缩成浸膏。将浸膏加水混
悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每
个极性部位萃取 3 次。减压浓缩后，分别得到石油
醚部分浸膏(Ⅰ)2． 42 g、氯仿部分浸膏(Ⅱ)0． 47 g、
乙酸乙酯部分浸膏(Ⅲ) 1． 59 g、正丁醇部分浸膏
(Ⅳ)1． 71 g、水层浸膏(Ⅴ)0． 8 g。
2． 1． 2 供试样品溶液的制备
将上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部分萃取物浸膏用
95%乙醇溶解为以下浓度:0． 0125、0． 025、0． 05、
0. 1、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8、1． 0、1． 2、1． 6、2． 0 mg /mL，
密闭保存备用。
2． 2 总还原能力的测定
乌奴龙胆各极性部位还原能力测定依照文
献［5］进行。取 1． 0 mL 不同浓度的各个样品溶液与
0． 2 mol /L，pH 为 6． 6 的磷酸盐缓冲液 2． 5 mL 和
1%的铁氰化钾溶液 2． 5 mL，50 ℃保温 20 min，加入
10%的三氯乙酸(TCA)溶液加入 2． 5 mL，3000 rpm
离心 10 min，取 2． 5 mL的上清液，加入 2． 5 mL蒸馏
水和 0． 5 mL FeCl3(0． 1% )，于 700 nm 处测定吸光
值，以吸光度值大小表示还原能力大小。以 VC 和
BHT为对照，每组实验平行 3 次，求其平均值。
2． 3 对超氧阴离子自由基的清除作用
采用邻苯三酚反应体系，参照文献［6，7］稍作修
改，测定乌奴龙胆各个极性部位对超氧阴离子自由
基(O-·2 )的清除能力。取 pH 为 8． 2 的 Tris-HCl 缓
冲液 8． 0 mL置于 25 ℃已水浴 20 min，分别加入不
同质量浓度乌奴龙胆各极性部位溶液 1． 0 mL，加入
25 ℃预热过的 25 nmol /L 邻苯三酚盐酸溶液 0． 5
mL，迅速摇匀，混匀后精确反应 4 min，用 0． 5 mL浓
盐酸终止反应，总反应体系为 10 mL测 320 nm处吸
光度值 A1。空白对照组以相同体积的蒸馏水代替
样品，测其吸光度值 A0。样品参照组以 0． 5 mL 的
蒸馏水代替邻苯三酚，测其吸光度值 A2。以 VC 和
BHT作为阳性对照，每组重复 3 次，求其平均值。
样品的 O-·2 清除能力可表示为:
清除率(% ) =［A0-(A1-A2)］/A0 × 100%
2． 4 对 DPPH·的清除作用
分别取各浓度的样品溶液 2． 0 mL置于试管中，
加入·DPPH(0． 04 mg /mL)溶液 2 mL，摇匀后于室
温暗室静置 30 min。于 517 nm 波长处测定各反应
液的吸光度 A1。用无水乙醇代替样品，测定·DP-
PH 溶液 2 mL与无水乙醇 2 mL混合液的吸光度，作
为空白吸光度值 A2，，以及样品溶液 2 mL 与无水乙
醇 2 mL混合液的吸光度 A3。以 VC和 BHT作为阳
性对照，以上实验平行测定 3 次，求其平均值［8］。
DPPH自由基的清除率计算公式为:
Y =［A2-(A1-A3)］/A2 × 100 %。
2． 5 对羟基自由基(·OH)的清除作用
本实验采用可见光分光光度法，以水杨酸作为
Fenton试剂反应产生的羟基自由基的捕剂，对乌奴
龙胆极性部位的抗氧化活性进行筛选。向试管中加
入乌奴龙胆各极性部位不同质量浓度的样品溶液
1． 0 mL，1． 8 mmol /LFeSO4 溶液 2． 0 mL，1． 8 mmol /L
水杨酸-乙醇 1． 5 mL，最后加 H2O2(0． 03% )0． 1 mL
启动反应，振荡混合，37 ℃水浴保温 30 min，在波长
为 510 nm下测量各自的吸光度值。用蒸馏水代替
样品做空白对照，并用 VC 和 BHT 代替样品做阳性
对照，每组做 3 个重复，求其平均值［9，10］。自由基清
除率计算公式为:
256 天然产物研究与开发 Vol. 27
D =［(A0-AS) /A0］× 100%
式中，A0 为用空白管的吸光度，AS 为加入样品
后的吸光度。
3 结果与分析
3． 1 乌奴龙胆各极性部位还原力的测定
乌奴龙胆各极性部位还原能力测定见图 1，结
果表明其各部位均具有一定的还原能力，且还原能
力随着浓度的增大而增强，并成正相关性，但均低于
VC。其中氯仿部和乙酸乙酯部的总还原能力最佳，
浓度为 1． 9 mg /mL 时，吸光度分别达到了 1． 004、
0. 99，与 BHT相当;正丁醇部位次之，石油醚部位和
水部位较差。
图 1 乌奴龙胆各极性部位、VC、BHT的还原能力测定
Fig. 1 Ｒeducing power of VC，BHT and fractions of G． urnu-
la with different polarities
3． 2 乌奴龙胆提取物各极性部位对超氧阴离子自
由基的抑制作用
由图 2 中可知，在实验所取的浓度范围内提取
物对超氧自由基有一定的抑制作用，与标准品 BHT
对超氧阴离子自由基的抑制作用相当，但低于 VC
对超氧阴离子的抑制作用。总体上随着提取物质量
浓度的增加，各极性部位对超氧自由基的抑制作用
变化不明显，可说明其对超氧阴离子的抑制作用不
具有较强的浓度依赖性，并且各个极性部位对超氧
自由基的抑制作用差异不明显。其中乙酸乙酯部位
效果最佳，在质量浓度为 1． 0 mg /mL时，清除率达
图 2 乌奴龙胆各极性部位和 BHT 对超氧阴离子的抑制
作用
Fig. 2 O-·2 inhibitory effects of BHT and fractions of G． ur-
nula with different polarities
到 26． 81%。
3． 3 乌奴龙胆提取物各极性部位对 DPPH 自由基
的清除作用
乌奴龙胆各极性部位萃取物清除 DPPH自由基
的作用如图 3 所示:各极性部位的萃取物清除 DP-
PH自由基的能力随质量浓度增加而增强。结果表
明，氯仿部位对 DPPH 自由基的清除作用是优于其
他极性部位，其 IC50为 0． 166 mg /mL;乙酸乙酯部位
和正丁醇部位次之，当质量浓度达到 0． 2 mg /mL 时
其对 DPPH 的清除率分别为 49． 35%、45． 65%，清
除作用远大于标准品抗氧化剂 BHT的 12． 22%。由
此可见，乌奴龙胆氯仿部和乙酸乙酯部对 DPPH 自
由基具有很好的清除作用。
图 3 乌奴龙胆各极性部位、VC、BHT 对 DPPH 自由基的
清除作用
Fig. 3 Scavenging effect of VC，BHT and fractions of G． ur-
nula with different polarities on DPPH radical
3． 4 乌奴龙胆提取物各极性部位对羟基自由基
(·OH)的清除作用
从图 4 中可知，乌奴龙胆各极性部位对羟基自
由基的清除均有一定作用，但均低于 VC 和 BHT 的
效果。其中氯仿部位效果最佳，乙酸乙酯部位和石
油醚部位次之，当质量浓度为 1． 0 mg /mL 时，其对
羟基自由基的清除率分别达到了 49． 88%，46． 63%
和 45． 52%。水部位和正丁醇部位清除效果较差，
且随浓度剃度变化不明显，分别在 30% ～ 40%和
10% ～20%范围内波动波动。
图 4 乌奴龙胆各极性部位、VC、BHT 对羟基自由基的清
除作用
Fig. 4 Scavenging effect of VC，BHT and fractions of G． ur-
nula with different polarities on hydroxyl radical
356Vol. 27 孔令茜等:乌奴龙胆乙醇提取物不同极性部位体外抗氧化性研究
4 结论
本研究首次采用四种体外抗氧化活性测定方法
对乌奴龙胆乙醇提取物 5 个极性部位进行体外总抗
氧化活性的研究，结果显示各个部位种提取物均具
有一定的抗氧化活性，但各部位抗氧化能力差异较
大，并且相同极性部位在不同测定体系中作用效果
也不同。其中，在相同的浓度范围内，氯仿部和乙酸
乙酯部体外抗氧化活性最佳，二者作用相当，且对
DPPH自由基的清除能力均大于 BHT，对 O-·2 的抑
制能力也与 BHT相当，有望从中发现高效天然抗氧
化剂。本研究为乌奴龙胆抗氧化活性成分的开发利
用提供理论依据，而其抗氧化活性成分及其抗氧化
机理还有待进一步的研究。
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