全 文 ： 余甘子核仁油的体外抗氧化活性
及其作用机理

葛双双，张雯雯，李坤，徐涓，刘兰香，郑华，张弘*
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局特色森林资源工程技术研究中心，
云南 昆明 650224）
摘 要：本文旨在研究余甘子核仁油的体外抗氧化作用，并探索多不饱和脂肪酸的抗氧化机理。以 DPPH·自
由基与 ABTS+·自由基为试验对象，通过余甘子核仁油对两种自由基的清除作用，评估其体外抗氧化能力。
结果表明：余甘子核仁油对DPPH·自由基清除作用的 IC50为5.08 mg/mL，最大清除率为95.91%；对ABTS+·自
由基清除作用的 IC50为 9.84 mg/mL，最大清除率为 98.58%。α-亚麻酸的清除自由基试验表明了，余甘子核
仁油中起抗氧化作用的主要物质为 α-亚麻酸等多不饱和脂肪酸。通过抗氧化前后混合脂肪酸的紫外光谱扫
描、红外光谱吸收，检测到了氧化后混合脂肪酸中共轭脂肪酸和羟基脂肪酸的生成，并在 DPPH·自由基过
量条件下，利用 GC-MS 检测到了单羟基脂肪酸的存在，从而证明了多不饱和脂肪酸清除自由基至少包括
多不饱和脂肪酸的共轭化、单分子加成、碳碳双键 α-H 氧化及环氧化等反应机理。
关键词：余甘子核仁油；体外抗氧化；多不饱和脂肪酸；α-亚麻酸；作用机理

Antioxidant Activity and Functional Mechanism in Vitro of Phyllanthus emblic L. Seed Oil

GE Shuang-shuang, ZHANG Wen-wen, LI Kun, XU Juan, LIU Lanxiang, ZHENG Hua, ZHANG Hong*
（Research Center of Engineering and Technology on Forest Resources with Characteristics, State Forestry
Administration, Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

Abstract: The purpose of this study was to reveal the antioxidant activities in vitro of Phyllanthus emblic L. seed
oil and explore the oxidation mechanism of polyunsaturated fatty acids. 1,1-dphenyl-2-picrylhydrazl (DPPH·)
radical and 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphoate) (ABTS+·) radical were employed to evaluated the
antioxidant activity by free radical scavenging. The results indicated that the scavenging capacity of Phyllanthus
emblic L. seed oil to DPPH· radical and ABTS+· radical were 95.91% and 98.58%, the IC50 to DPPH· radical and
ABTS+· radical were 5.08 mg/mL and 9.84 mg/mL respectively. Free radicals scavenging experiment of alpha
linolenic acid showed that the main antioxidant in Phyllanthus emblic L. oil were polyunsaturated fatty acids.
Conjugated fatty acid and hydroxy fatty acid were detected in mixed fatty acids after oxidation characterized by
ultraviolet scanning spectrum(UV) and fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Moreover, monohydroxy
fatty acid was detected through gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) under the condition of excessive
DPPH radical, all the above indicated that the free radicals scavenging of polyunsaturated fatty acids included
polyunsaturated fatty acid conjugation, single molecule addition, α-H oxidation of c=c double bond and
epoxidation reaction at least.

收稿日期：2016-07-14
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 (riricaf2015003M)，国家重点研发计划项目
（2016YFD0600806）
作者简介：葛双双（1990-），女，硕士研究生，研究方向为天然产物开发与利用。E-mail：
geshuangshuang0407@163.com
*通信作者：张弘（1963-），男，研究员，博士，研究方向为林业生物资源化学与工程。E-mail：
kmzhhong@163.com
2016-10-15
网络出版时间：2016-10-18 22:21:34
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20161018.2221.040.html

Key words: Phyllanthus emblic L. seed oil; antioxidant activity in vitro; polyunsaturated fatty acids; alpha
linolenic acid; mechanism of action
中图分类号：TS201.2，TS225.1 文献标志码：A 文章编号：

余甘子（Phyllanthus emblic L.）属大戟科叶下珠属植物，广泛分布于中国、印度、印度尼西亚、
马来半岛的热带和亚热带地区[1]，余甘子在中国与印度的传统药物体系中已经使用了一千多年，也是
世界卫生组织指定广泛种植的 3 种保健植物之一[2]。余甘子中富含多酚类、生物碱类、类黄酮、糖类、
维生素 C 等成分[3-4]。丰富的营养成分使得余甘子具有抗衰老[5-7]、降血脂[8]、抑菌[9]、抗动脉粥样硬化
[10]、抗癌[11]等多种保健和药用功效。因此，针对余甘子果肉、叶子及其根茎的相关研究较多[12-14]，而
对余甘子核仁的研究甚少。近年来，出现了少量有关余甘子核仁的研究，主要集中在余甘子核仁油的
提取方法[15]及其脂肪酸组成的分析等方面[16-18]。从其脂肪酸组成来看，余甘子核仁油的不饱和度较高，
α-亚麻酸更是超过 50%[19]。事实上，围绕不饱和脂肪酸的研究已涵盖了诸多方面[20-23]，抗氧化无疑是
研究热点之一。然而，绝大多数抗氧化研究关注的是试材自身对不同自由基的清除活性，对试材中发
挥抗氧化作用的物质种类却多不明确，对试材中活性物的抗氧化机理研究更是鲜有报道。就油脂与不
饱和脂肪酸而言，有关其自氧化的报道较多[24-27]，然而，其抗氧化的相关报道较少。少量有关油脂与
不饱和脂肪酸抗氧化的报道，亦偏重于抗氧化活性研究 [28-29]。本文以余甘子核仁油为研究对象，在验
证了余甘子核仁油抗氧化活性的基础上，不仅揭示了油脂中抗氧化活性物质的类别，并进一步对不饱
和脂肪酸的抗氧化机理进行了探索，为油脂抗氧化的深入研究提供了参考与依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
余甘子核仁由昆明酷特利生物科技有限公司提供。
氢氧化钾、过硫酸钾 天津市风船化学试剂有限公司；正己烷、无水乙醇、乙醚、甲醇、苯、石
油醚（60~90℃） 广东光华科技股份有限公司（以上试剂均为分析纯）；1,1-二苯基-2-三硝基苯胼
（DPPH·自由基） Sigma 公司；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）(ABTS+·自由基）(100%） EMD
生物科技有限公司；抗坏血酸 国药集团化学试剂有限公司；亚麻酸甲酯（纯度≥99.5%，GC） 阿
拉丁试剂上海有限公司。
1.2 仪器与设备
AB204-S 精密型电子天平 瑞士梅特勒-托利多(中国)有限公司；116 型摇摆式六两装高速中药粉
碎机 浙江瑞安市永历制药机械有限公司；TY742X2A 纯水机 美国 Barnstead 公司；DSX-90 数显搅
拌机 杭州仪表电机有限公司；VOS-3000VD 型真空干燥箱、N1000 Rotavapor R11 型旋转蒸发仪 日
本东京理化器械株式会社；DU 800 紫外分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司；Tensor-27 傅里叶
红外光谱仪 德国布鲁克公司；Xevo TQ-S 超高压液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪 美国 Waters
公司；ITQ 900 气相色谱-质谱联用仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 余甘子核仁油的提取
取适量余甘子核仁粉碎，参照国标 GB/T 14488.1-2008 以正己烷为溶剂进行提取，提取液经旋蒸
浓缩后得到余甘子核仁油。
1.3.2 DPPH·自由基清除率的测定
以无水乙醇为溶剂，分别配制摩尔浓度为 2×10-4 mol/L 的 DPPH·自由基溶液，配制质量浓度范围
为 2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的余甘子核仁油溶液和质量浓度范围为 0.01、0.02、0.03、
0.04、0.05 mg/mL 抗坏血酸溶液。精确吸取不同浓度余甘子核仁油样品液和抗坏血酸溶液，加入 4 mL
DPPH·溶液，摇匀后在暗室下放置 30 min，在 517 nm 处测定上述溶液的吸光度值[30]。按照下式计算
其清除率：
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)0
1
A-A% 1- 100
A
 清除率（ ） （

式中：A—试样（不同质量浓度的余甘子核仁油溶液、抗坏血酸溶液）与 DPPH·混合溶液的吸光度值；
A0—试样（同上）与无水乙醇混合溶液的吸光度值；
A1—无水乙醇与 DPPH·混合溶液的吸光度值。
1.3.3 ABTS+·自由基清除率的测定
将 ABTS+·样品及过硫酸钾用少量水溶解，再以无水乙醇为溶剂配制摩尔浓度为 7×10-3 mol/L 的
ABTS+·溶液与摩尔浓度为 2.5×10-3 mol/L 的过硫酸钾溶液，并将二者等体积混合，在暗处放置 12 h
后取混合溶液稀释 50 倍待用。配制质量浓度范围为 5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的余甘子核
仁油溶液和质量浓度范围为 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、1.0 mg/mL 抗坏血酸溶液。精确吸取不同
浓度的余甘子核仁油样品溶液或抗坏血酸样品液，分别加入 5 mL ABTS+·和过硫酸钾混合溶液，摇匀
后于室温下避光 30 min。以无水乙醇作为对照，在 734 nm 下分别测定上述溶液的吸光度值[31]。按照
下式计算其清除率：
0
1
A A% 1- ) 100
A
 清除率（ ）（

式中：A—试样（不同质量浓度的余甘子核仁油溶液或抗坏血酸溶液）与 ABTS+·和过硫酸钾混合溶液
的吸光度值；
A0—试样（同上）与无水乙醇混合溶液的吸光度值；
A1—无水乙醇与 ABTS+·和过硫酸钾混合溶液的吸光度值。
1.3.4 亚麻酸甲酯对 DPPH·自由基清除率的测定
配制质量浓度范围为 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 的亚麻酸甲酯溶液，采用 1.3.2 中的方
法，计算亚麻酸甲酯对 DPPH·自由基的清除率。
1.3.5 余甘子核仁油混合脂肪酸的制备方法
称取 30 g 余甘子核仁油加入装有 300 mL 摩尔浓度为 1mol/LKOH-乙醇溶液的烧瓶中，在 80 ℃的
水浴中加热回流 1 h，回流期间不断摇动烧瓶，皂化完全冷却至室温，得到皂化液，加入 100 mL 蒸馏
水，将其混合均匀，转移至分液漏斗，分别用 300 mL 正己烷萃取非皂化物三次，取下层水相，用 10%
HCl 调 pH 至 2-3，加入适量的正己烷进行萃取，留正己烷相，并加入无水硫酸钠脱水，经溶剂回收
得到混合脂肪酸。称取上述混合脂肪酸 200 mg，定容至 100 mL，配制浓度为 2 mg/mL 混合脂肪酸溶
液后保存备用。
1.3.6 余甘子核仁油的抗氧化作用机理研究
（1）氧化前后余甘子核仁油的组分分析
a. 余甘子核仁油及混合脂肪酸样品的甲酯化方法
余甘子核仁油与混合脂肪酸的甲酯化方法参照 GB/T 17376-2008[32]中三氟化硼法。
b. GC-MS 分析条件
气相色谱条件：色谱柱：CP7420 毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.25 mm）；升温程序：初始温度
100 ℃，保持 20 min，以 20 ℃/min 的速率升至 190 ℃，保持 20 min，然后以 1 ℃/min 的速率升温
到 210 ℃，保持 10 min，再以 4 ℃/min 的速率升温至 250 ℃，最后保持 10 min；进样口温度：250 ℃；
载气：高纯氦气，1.0 mL/min；分流比：20:1；进样量：1 μL。质谱条件：电离方式：电子轰击（EI）；
离子源温度：250 ℃；传输线温度：250 ℃；质量扫描范围：40~400 u。
（2）多不饱和脂肪酸抗氧化作用的结果验证
以 α-亚麻酸甲酯代替余甘子核仁油，按照 1.3.2 中的方法进行 DPPH·自由基的清除试验后，再按
照 1.3.5（1）b 中所示的方法进行 GC-MS 检测。
（3）多不饱和脂肪酸抗氧化作用机理研究
a. 氧化前后样品的分光光度计（UV）表征
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扫描条件：采样间隔为 1 nm，扫描速度为中速，光谱宽带为 1 nm，波长范围为 200~800 nm，每
个样品平行扫描 3 次。
b. 氧化前后样品的红外吸收光谱（FT-IR）表征
FT-IR 分析条件：扫描范围为 4000~400 cm-1，分辨率为 4 cm-1，固体试样经 KBr 压片后进行测试，
液体样品直接滴加在 KBr 片上进行测试。
c. 氧化前后样品的气质（GC-MS）分析
取上述 DPPH·自由基溶液 200 mL，与 1 mL 混合脂肪酸贮备液混合，按照 1.3.2 中所述条件进行
自由基清除反应后，浓缩上述反应液至 3-5 mL，参照文献[33]向上述反应浓缩液中加入 2 mL5%氢氧化
三甲基（间-三氟甲基）苯基铵（TMTFTH）的甲醇溶液后常温反应 24 h 后进行 GC-MS 检测。检测
条件为：DB-5MS 色谱柱，进样口温度 300 ℃，接口温度 300 ℃；升温程序：起始温度 50 ℃，保持 2
min，以 10 /min℃ 升至 310 ℃，保持 22 min，进样量 5 μL，分流比 50:1，离子源温度 250 ℃，四极
杆温度 180 ℃。
d. 氧化前后样品的 ESI 源质谱分析
取 α-亚麻酸甲酯及 1.3.5 中制备所得混合脂肪酸样品，按照 1.3.2 中所述的方法进行 DPPH·自由基
的清除试验后，在 ESI 源质谱进样检测。质谱检测条件为：α-亚麻酸甲酯标准品为正离子模式 ESI+，
混合脂肪酸为负离子模式 ESI-；锥孔电压 5 v；RF 透镜电压为 0.5 v；源温 120 ℃；脱溶剂气温度为
350 ℃；脱溶剂气流为 600 L/h；锥孔气流为 50 L/h；采集模式为 4 通道选择离子（SIR）采集模式。

2 结果与分析
2.1 余甘子核仁油对 DPPH·自由基的清除能力
DPPH·自由基溶液呈紫罗兰色且在 517 nm 处有特征吸收峰，当具有抗氧化成分的物质与自由基
作用后，紫罗兰颜色褪去，通过溶液吸光度值变化来计算自由基被清除程度 [34]，因此，可以通过对
DPPH·自由基的清除能力来评价某些组分的抗氧化活性，该法被广泛应用于物质清除自由基能力的研
究中。不同质量浓度的余甘子核仁油溶液及抗坏血酸溶液对 DPPH·的清除效果如图 1 所示：
0 5 10 15 20 25 30
20
40
60
80
100
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
20
40
60
80
100
DP
PH
自
由
基
清
除
率
/（
%）
余甘子核仁油质量浓度/（mg/mL）
DP
PH
自
由
基
清
除
率
/（
%）
抗坏血酸质量浓度/（mg/mL）
图 1 余甘子核仁油对 DPPH·自由基的清除作用
Fig.1 DPPH· radical scavenging of Phyllanthus emblic L. seed oil
由图 1 可知，随着余甘子核仁油质量浓度的升高，对 DPPH·自由基清除率也逐渐增大。在 2~20
mg/mL质量浓度范围内，余甘子核仁油溶液对DPPH·自由基的清除效果由 26.28%迅速增加到 95.70%；
随着余甘子核仁油溶液质量浓度的进一步升高，清除率增加缓慢直至趋于平缓，当质量浓度在 30
mg/mL 时，清除率达到 95.91%。抗坏血酸在质量浓度为 0.02 mg/mL 时，对 DPPH·自由基的清除率已
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经达到 89.50%，最大清除率为 93.03%，其半数抑制率 IC50为 0.015 mg/mL。根据文献[35]报道，抗坏
血酸在低浓度时就有一定的清除作用，主要是因为 DPPH 溶液中有 DPPH·自由基和正离子态的 DPPH+
两种形态平衡存在，抗坏血酸对两种形态都具有清除作用，而油脂清除 DPPH 自由基的作用机理还未
明确，本研究选择抗坏血酸作为余甘子核仁油体外抗氧化研究的一个阳性对照。由图 2 看出，余甘子
核仁油对 DPPH·自由基的最大清除率与抗坏血酸相当，余甘子核仁油对 DPPH·自由基清除作用的 IC50
（半数抑制率）=5.08 mg/mL，文献[36]中葡萄籽油质量浓度为 25 mg/mL 时对 DPPH·自由基的清除率
在 80%左右，燕麦粗油[37]的 IC50=5.15，最大清除率在 80%左右，与其他油脂相比，余甘子核仁油具
有较强的抗氧化作用。
2.2 余甘子核仁油对 ABTS+·自由基的清除能力
对于检测一种物质抗氧化的能力时，由于其抗氧化原理不同，在一种检测方法中其抗氧化效果较
好，而在另一种检测方法中可能是促氧化剂[38]。因此，试验选取 ABTS+·自由基作为另一种抗氧化活
性检测方法。ABTS+·溶液呈蓝绿色，具有抗氧化活性的物质与其反应后导致溶液褪色，通过其在 734
nm 吸光度值的变化，评价物质的抗氧化能力。余甘子核仁油样品溶液及抗坏血酸溶液对 ABTS+·的清
除效果如图 2 所示：
5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
80
100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0
20
40
60
80
100
AB
TS
自
由
基
清
除
率
/（
%）
余甘子核仁油质量浓度/（mg/mL）
AB
TS
自
由
基
清
除
率
/（
%）
抗坏血酸质量浓度/（mg/mL）
图 2 余甘子核仁油对 ABTS+·自由基的清除作用
Fig.2 ABTS+· radical scavenging of Phyllanthus emblic L. seed oil
由图 2 可以看出，不同质量浓度的余甘子核仁油溶液与抗坏血酸溶液对 ABTS+·自由基均有清除
作用，且随着质量浓度的提高 ABTS+·自由基的清除率也逐渐升高。余甘子核仁油溶液在 5~20 mg/mL
质量浓度范围内，对 ABTS+·自由基的清除率由 8.41%迅速增加到 95.70%，之后趋于平缓；对于
ABTS+·自由基，抗坏血酸溶液仍有较强的清除能力，在质量浓度为 0.05 mg/mL 时，对 ABTS+·自由
基的清除率已经达到 90.51%。余甘子核仁油对 ABTS+·自由基清除作用的 IC50=9.84 mg/mL，抗坏血
酸对 ABTS+·自由基清除作用的 IC50=0.035 mg/mL，二者差异较大，不过余甘子核仁油对 ABTS+·自由
基的最大清除率（98.58%）与抗坏血酸（90.51%）相近，表明余甘子核仁油具有一定的 ABTS+·自由
基清除能力。
2.3 余甘子核仁油体外抗氧化作用机理研究
2.3.1 氧化前后余甘子核仁油的组分对比
由 2.1 和 2.2 结果可知，余甘子核仁油对 DPPH·自由基和 ABTS+·自由基均显示出了一定的清除能
力。从化学反应本质上看，清除自由基为氧化还原反应，自由基为氧化剂，作为还原剂的余甘子核仁
油清除自由基后的氧化产物是分析其抗氧化机理的直接有力证据。因此，以 DPPH·自由基为例，采用
三氟化硼甲酯化方法，对氧化前后余甘子核仁油的脂肪酸组成进行 GC-MS 检测，结果如表 1 所示：
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表 1 DPPH·自由基处理前后余甘子核仁油中的脂肪酸的组成及相对含量
Table 1 Components and relative contents of fatty acids in Phyllanthus emblic L. seed oil before and after DPPH· radical
scavenging
峰号 化合物名称
氧化前后余甘子核仁油中的脂肪酸组成及含量/%
余甘子核仁油
DPPH·自由基处理后的
余甘子核仁油
1 十六烷酸（棕榈酸） 9.22 9.45
2 十八烷酸（硬脂酸） 6.85 6.86
3 9-十八碳烯酸（油酸） 8.43 8.32
4 13-十八碳烯酸 1.51 1.49
5 9,12-十八碳烯（亚油酸） 18.49 18.53
6 9,12,15-十八碳烯酸（α-亚麻酸） 54.46 54.07
7 多不饱和脂肪酸 72.95 72.60
8 合计 98.96 98.72
注：图中显示结果为相对百分含量大于 1%的化合物。
由表 1 可知，DPPH·自由基氧化前后余甘子核仁油的脂肪酸含量发生变化。氧化前，余甘子核仁
油中主要有 6 种脂肪酸，总含量占所检测出总成分的 98.96%，其中多不饱和脂肪酸含量占 72.95%，
9,12,15-十八碳烯酸（α-亚麻酸）占检出化合物的 54.46%。而氧化后，多不饱和脂肪酸和 α-亚麻酸含
量分别下降至 72.60%和 54.07%。尽管 DPPH·自由基氧化前后多不饱和脂肪酸的含量降低幅度不大，
但必须指出的是，在该抗氧化试验中，DPPH·自由基的用量水平仅为混合脂肪酸的用量水平的
1/375~1/25（依据 1.3.2 中数据计算）。依据余甘子核仁油的组成，并结合相关报道[39-40]的研究结果可
推测，余甘子核仁油中，体外抗氧化作用的主要物质为多不饱和脂肪酸，而余甘子核仁油中多不饱和
脂肪酸主要是 α-亚麻酸。可见，α-亚麻酸可能就是余甘子核仁油中抗氧化的活性物质。为进一步验证
该推论，以 α-亚麻酸甲酯为还原剂的验证试验很有必要。
2.3.2 多不饱和脂肪酸的抗氧化作用验证
0 2 4 6 8 10
20
40
60
80
100
DP
PH
自
由
基
清
除
率
/（
%）
亚麻酸甲酯的质量浓度/(mg/mL)
图 3 α-亚麻酸甲酯对 DPPH·自由基的清除作用
Fig.3 DPPH· radical scavenging of methyl linolenate
由图 3 可以看出，α-亚麻酸甲酯对 DPPH·有较好的清除作用，其作用效果及趋势与余甘子核仁油
高度一致。主要区别在于相同质量浓度条件下，α-亚麻酸的清除率明显高于余甘子核仁油，这初步说
明了 α-亚麻酸在余甘子核仁油清除自由基中的主体作用。此外，以半数抑制率 IC50为例，α-亚麻酸甲
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酯对 DPPH·自由基清除作用的 IC50=2.81 mg/mL，2.1 节中余甘子核仁油对 DPPH·清除作用的 IC50=5.08
mg/mL，其占比为 55.3%，与余甘子核仁油中亚麻酸的相对含量为 54.46%高度接近，可推断，余甘子
核仁油中对 DPPH·自由基有清除作用的可能正是 α-亚麻酸。
2.3.3 α-亚麻酸的抗氧化作用机理探索
为进一步探索 α-亚麻酸对 DPPH·自由基的作用机理，以混合脂肪酸为样品，经 DPPH·自由基氧
化前后的相关表征结果及分析如下：
1）紫外光谱扫描
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
515326
257
251
245吸
光
度
/A
bs
波长/nm
DPPH
混合脂肪酸
混合脂肪酸+DPPH
240

图 4 DPPH·自由基氧化混合脂肪酸后的全波长扫描
Fig.4 Full wave scanning of mixed fatty acids after DPPH· radical scavenging
如图 4 所示， DPPH·自由基样品分别在 326 nm、515 nm 有两处特征吸收峰，这与文献[41]报道的
323 nm 和 517 nm 吸收峰基本一致；混合脂肪酸样品在 200 nm-800 nm 范围内并无特征吸收峰，而经
DPPH·自由基氧化后的混合脂肪酸在 240 nm、245 nm、251 nm、257 nm 处分别有明显的特征吸收峰，
这与相关报道共轭脂肪酸在 230-240 nm 范围内有特征吸收峰的结果吻合[42]，且随着共轭结构的不同
和共轭双键数目的增多，特征吸收峰发生红移[43]。
2）红外吸收光谱

注：a. 固体 DPPH；b. 混合脂肪酸；c. DPPH·自由基氧化后的混合脂肪酸
图 5 DPPH·自由基氧化前后混合脂肪酸的红外光谱图对比
500 100015002000250030003500
波长/ cm-1
30
40
50
60
70
80
90
100
透
光
率
/%
a
b
c
3458cm-1
1740 cm-1 1639 cm
-1
1710 cm-1
1657 cm-1
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Fig.5 FTIR of mixed fatty acids after DPPH· radical scavenging
对比图 5 中固体 DPPH、混合脂肪酸、DPPH·自由基氧化后的混合脂肪酸的红外吸收谱图可发现：
①氧化后的混合脂肪酸 3458 cm-1处的羟基吸收峰，相对前两者明显变宽变强，这说明氧化后的混合
脂肪酸中的羟基数量明显增多；②混合脂肪酸 1710 cm-1处的羰基吸收峰，平移至 1740 cm-1，且原 1657
cm-1处的非共轭-C=C-的伸缩振动吸收峰，平移至 1639 cm-1共轭-C=C-C=C-的伸缩振动吸收峰[44]，这
充分说明氧化后的混合脂肪酸样品中有新的共轭结构生成。
3）气质分析
在 2.3.1 中，通过 GC-MS 分析了经 DPPH·自由基氧化前后余甘子核仁油的脂肪酸组成差异，除
质谱数据外，其他检测方法并未发现相关氧化产物的存在，原因在于，以余甘子核仁油清除 DPPH·自
由基时，核仁油过量（相同浓度条件下，DPPH·自由基与核仁油的加入体积比例为 1:1），即核仁油为
DPPH·自由基用量的 25-375 倍，因此，即使反应转化率为 100%条件下，氧化产物的占比也极小，仅
为 0.26%-3.8%，加之羟基脂肪酸仅为自由基氧化的中间产物，在其生成的同时，还必然伴随有深度
氧化反应的消耗，因此存在于反应体系中的羟基脂肪酸的量极少，在 GC-MS 谱图中极易被掩盖。而
在过量 DPPH·自由基氧化时，DPPH·自由基与核仁油的加入体积比例为 200:1（如上文 1.3.6（4）c 中
所示），即 DPPH·自由基的用量为混合脂肪酸的 7.88 倍。以 DPPH·自由基过量的方式，通过 GC-MS
检测氧化前后混合脂肪酸成分的差异，如图 6 所示：
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
30 35 40 45 50 55 60 65 70
0
3000000
6000000
9000000
12000000
1500000
a
e
d
cb
混合脂肪酸
相
对
丰
度
a
50 52 54 56 58 60
e
时间/min
f
ef
c
b
时间（min）
混合脂肪酸+DPPH

注：a.棕榈酸甲酯；b.硬脂酸甲酯；c.油酸甲酯；d.亚油酸甲酯；e. α-亚麻酸甲酯；f.2-羟基亚麻酸甲酯
图 6 过量 DPPH·自由基氧化前后混合脂肪酸的 GC-MS 谱图对比
Fig.6 Comparison of GC-MS plot of fatty acid mixture before and after oxidized by excess DPPH·
由图 6 可知，氧化前后混合脂肪酸的组成在 DPPH·自由基过量的条件下表现出了明显的差异，氧
化前混合脂肪酸中分别为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和 α-亚麻酸，而经 DPPH·自由基氧化后，
亚油酸的气质峰（d）消失，α-亚麻酸峰（e）急剧降低，且在氧化后的气质检测图中产生了 2-羟基亚
麻酸。这再次说明余甘子核仁油中抗氧化的主要物质为 α-亚麻酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸，且抗氧
化产物中确有羟基脂肪酸生成，而 2 号位羟基的存在则可能是部分双键发生转移的结果[45]。此外，这
里必须指出的是，为降低多羟基脂肪酸的沸点，使得其在 GC-MS 中能够顺利汽化，本文参照文献[33]
中所采用的氢氧化三甲基(间-三氟甲基)苯基铵（TMTFTH）完全甲氧基化方法，但实际操作中发现
TMTFTH 与 DPPH·自由基间会优先发生反应，使得 DPPH·自由基溶液产生明显的褪色现象，这使得
TMTFTH 的甲氧基化效力降低，故而也仅检测到了单羟基脂肪酸的甲酯化产物（f）。
4） ESI 源质谱分析
为全面地得到氧化产物信息以印证上述分析结果，氧化前后混合脂肪酸和 α-亚麻酸甲酯的 ESI
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源质谱检测结果图 7 所示：

注：a. α-亚麻酸甲酯；b. DPPH·自由基氧化后的 α-亚麻酸甲酯；c. 混合脂肪酸；d. DPPH·自由基氧化后的混合脂肪酸。
图 7 DPPH·自由基氧化前后 α-亚麻酸甲酯及混合脂肪样品的质谱图
Fig.7 Mass spectrum of α-methyl linolenate and mixed fatty acids after DPPH· radical scavenging
由图 7 可知，氧化后 α-亚麻酸甲酯及混合脂肪样品的质谱图中分子离子峰明显增多，现以 α-亚麻
酸甲酯（M=292）和混合脂肪酸中的 α-亚麻酸（M=278）为目标物，分析样品分子离子峰的变化规律
如表 2 所示：
表 2 氧化后 α-亚麻酸甲酯和 α-亚麻酸的分子量变化规律
Table 2 Molecular weight variation of α- linolenic acid methyl ester and α- linolenic acid after oxidation
氧化后的样品 M M+16 M+34 M+50 M+68 M+84 M+102 M+118 M+136
增加的原子种类和数量 0 1O 2H+2O 2H+3O 4H+4O 4H+5O 6H+6O 6H+7O 8H+8O
α-亚麻酸甲酯 292 308 326 342 360 376 394 410 428
质谱图中分子离子峰（正
离子模式）
291 307 329 347 361 379 395 411 428
α-亚麻酸 278 294 312 328 346 362 380 396 414
质谱图中分子离子峰（负
离子模式）
278 293 311 - - - - 395 -
由表 2 可知，氧化后的 α-亚麻酸及 α-亚麻酸甲酯的分子离子峰出现了较为明显的规律性变化，以
混合脂肪酸中的 α-亚麻酸为例，质谱图中存在 M+16 及 M+16+18 的分子量交替增长的变化规律，依
据此规律，395 处的分子离子峰亦能较好吻合；而除个别分子量有偏差外，α-亚麻酸甲酯的分子离子
峰与上述分子量变化规律几乎完全吻合。可见，该体外抗氧化试验在 DPPH·自由基氧化 α-亚麻酸的
过程中，必然伴随着羟基脂肪酸的生成，且由分子量 M+16 和 M+18 的交替增长方式来看，α-亚麻酸
的氧化首先以非共轭双键的共轭化反应开始，这与 Buege 的研究报道相符[46]，但与油脂自氧化不同的
是，该氧化过程由于 DPPH·自由基的存在而更加迅速，因此，一次氧化后的稳定终产物为 α-亚麻酸
的单羟基脂肪酸。随后的二次氧化，则是由自由基进攻共轭双键开始的，抛开反应历程，单从反应产
物来看，二次氧化与一分子 H2O 对-C=C-的加成反应类似，生成 H-C-C-OH 结构的羟基脂肪酸，第三
c d
a b
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次氧化与第一次氧化类似，继续发生的是剩余两个非共轭双键重排为共轭双键[47]，同时生成三羟基脂
肪酸的过程，以此类推，直至双键消耗完全。然而，按照上述反应机理，最多只能产生 5 羟基脂肪酸，
无法解释质谱中 8 羟基脂肪酸的存在，因此，在 α-亚麻酸生成共轭脂肪酸的过程中，还应伴随有 α-H
氧化及环氧化反应的存在[26,48-49]，使得部分双键环氧化后，水解为双羟基脂肪酸。该反应机理示意图
可表示如图 8：
COOH
COOH
OH
COOH
OH OH
COOH
OH OH
OH
COOH
OH OH
OH OH OH
COOH
OH OH
OH OH
COOH
COOH
OH OH
COOH
OH OH
O
COOH
OH OH
OH
OH
COOH
OH OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
共轭化与单分子加成机理推测示意图 共轭化与环氧化反应机理推测示意图
α-H 氧化

图 8 以 α-亚麻酸为代表的体外抗氧化机理推测示意图
Fig.8 Suppositional schematic diagram of antioxidation mechanism in vitro take alpha linolenic acid as represented sample
在此必须指出的是，图 8 仅为以 α-亚麻酸为还原剂清除 DPPH·自由基的反应中，α-亚麻酸的氧化
机理示意图，并不意味着羟基脂肪酸即为氧化终产物。事实上，所生成的多羟基脂肪酸仅可视为 α-
亚麻酸抗氧化的中间产物，只是该中间产物能在一定时间内稳定存在，而随着反应时间的延长，该中
间产物将继续氧化使得脂肪酸碳链断裂而生成小分子的醛、酮、酸类物质。

3 结 论
余甘子核仁油对 DPPH·自由基的最大清除率为 95.91%，其半数抑制率 IC50为 5.08 mg/mL；核仁油对
ABTS+·自由基的最大清除率为 98.58%，IC50为 9.84 mg/mL。与葡萄籽油、核桃油等不饱和脂肪酸含量较高
的油脂相比，余甘子核仁油具有较强的抗氧化活性。
余甘子核仁油中，抗氧化活性物质为多不饱和脂肪酸，即 α-亚麻酸和亚油酸，其总含量占余甘子核
仁油脂肪酸含量的 72.95%，其中 α-亚麻酸含量达 54.46%。
以 α-亚麻酸为目标物，通过对比氧化前后混合脂肪酸样品的紫外光谱扫描、红外光谱吸收，检测
到了氧化后混合脂肪酸样品中共轭脂肪酸和羟基脂肪酸的生成，并在 DPPH·自由基过量条件下以
GC-MS 检测到了单羟基脂肪酸的存在，并依据 ESI 源质谱的检测结果，提出多不饱和脂肪酸清除自
由基是一个复杂反应过程，至少包括了多不饱和脂肪酸的共轭化、单分子加成、碳碳双键 α-H 氧化及
环氧化等反应机理。

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