全 文 ：基金项目:吉林省教育厅科技发展计划项目(编号:吉教科合字
[ 200660] )
作者简介:解耸林(1963 -), 男 , 长春工业大学实验师。 E-m ail:
xiesonglin@m ail.ccut.edu.cn
通信作者:刘洪霞
收稿日期:2009-12-25
第 26卷第 2期
2 0 1 0 年 3 月
Vo l.26 , No.2
Mar .2 0 1 0
粪鬼伞多糖脱蛋白方法的研究
Study on deproteinization fromCop rinus sterqulinus Fr .polysaccharide
解耸林
X IE Song-lin 　
王志兵
WANG Zhi-bing 　
刘洪霞
L IU Hong-xia
(长春工业大学化学与生命科学学院 ,吉林 长春　130012)
(S chool o f Chemistry and L i f e Science of Changchun University o f Technology , Changchun , J i lin 130012 , China)
摘要:探讨粪鬼伞多糖提取过程中的脱蛋白方法与工艺。以
蛋白质去除率和多糖损失率为考察指标 , 比较 Sevag 法 、酶
法 、三氯乙酸法 、酶-Sevag 法脱蛋白效果。结果表明 ,酶-
Sevag 法脱蛋白效果较好且多糖得率较高 ,脱蛋白的最佳工
艺条件为:酶用量 2%, 温度 40 ℃, 脱蛋白时间 2 h , pH 值
5.0;Sevag 试剂浓度 20%, 脱蛋白次数 3 次 , 在此条件下 , 蛋
白质去除率和多糖损失率分别为 70.95%和 6.58%。
关键词:粪鬼伞;多糖;脱蛋白;酶-Sevag 法
Abstract:Inves tigated the method of deproteini zation in Copr inus
sterqu linus F r .polysaccharide ext raction.Th e ef fect of dep roteiniza-
ti on w ith diff erent m ethods(such as S evag , en zyme , TCA and en-
zyme-S evag method)w ere evalu ated in terms of the rat io of p rotein
removal and polysaccharide loss.The result s howed that the enzy me-
Sevag method could be the best , wi th less protein remain and poly-
sacch aride loss.T he op timum technological condi tion s of dep rotein-
ization w ere:enzyme u sage 2%, t em perature at 40 ℃, pH value
5.0 , dep roteinization time 2 h , Sevag concent ration 20%, dep rotein-
ization t imes 3 t imes.The ratio of deproteinizat ion and poly saccha-
ride los s w ere 70.95% and 6.58%, respect ively .Conclusion:En-
zyme-S evag method could be used for Cop rinus sterqu linus F r .poly-
sacch aride deproteiniz at ion.
Keywords:Cop rinus sterqul inu sF r .;poly saccharide;removal of pro-
t ein;en zyme-Sevag method
粪鬼伞(Coprinus sterqulinus F r.)别名粪生鬼伞 , 属担
子菌亚门层菌纲伞菌目鬼伞科鬼伞属[ 1] 。据《全国中草药汇
编》记载 ,粪鬼伞能益肠胃 , 化痰理气 、解毒 、消肿 [ 2] ,并对肿
瘤细胞有一定的抑制作用[ 3] , 从深层发酵的菌丝体中提取的
粪鬼伞多糖具有抗肿瘤 、抗病毒 、抗菌等多种生物活性 [ 4] ,
是良好的生物效应调节剂。
在提取粪鬼伞多糖时 , 提取物中蛋白质含量很高 , 这给
纯化带来了很大困难。为了提高粪鬼伞多糖生物活性 , 得到
较纯的多糖 , 必须脱去粪鬼伞中的蛋白质。目前 , 有关脱蛋
白的方法主要有 Sevag法 、三氯乙酸法 、氯化钠法 、氯化钙法
和盐酸法。本试验以蛋白质去除率和多糖损失率为考察指
标 , 对几种粪鬼伞多糖脱蛋白方法进行了对比研究 , 以确定
最佳脱蛋白方法。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
粪鬼伞菌丝体:由长春工业大学功能食品与生物技术研
究所提供;
木瓜蛋白酶:酶活力 35 万 U/g , 广西南宁庞博酶制
剂厂;
苯酚 、浓硫酸 、蒽酮 、考马斯亮蓝G-250、三氯乙酸 、丙酮 、
正丁醇 、氯仿等试剂均为国产分析纯。
1.2　仪器与设备
紫外分光光度计:UV1102 , 上海天美科学仪器公司;
水浴恒温振荡器:SH A-BA , 江苏金坛荣华仪器制造有
限公司;
冷冻干燥机:LGJ1.5 型 , 北京四环科学仪器厂:
旋转蒸发器:RE-52 ,上海安荣仪器有限公司;
高速组织捣碎机:JJ-2 ,金坛市鑫鑫实验仪器有限公司;
离心机:TDZ5-WS ,湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司;
电子恒温水浴锅:DK-98-Ⅰ , 天津市泰斯特仪器有限
公司。
1.3　方法
1.3.1　多糖和蛋白质的测定
(1)多糖含量的测定:苯酚-硫酸法[ 5] , 以葡萄糖作标
准曲线;
5
(2)蛋白质含量的测定:考马斯亮蓝 G-250 法[ 6] , 以牛
血清蛋白作标准曲线。
1.3.2　工艺流程
(1)多糖的提取工艺[ 7]
粪鬼伞菌丝体干品(10 g)※粉碎※浸泡(24 h)※热水浸
提(4 倍体积水 , 80 ℃)※上清液※真空浓缩(至 1/ 4 体积)※
乙醇沉淀(4 倍于多糖体积)※沉淀物(粗多糖)※溶解
(20 m L水)※粗多糖溶液※脱蛋白※较纯的粪鬼伞多糖
(2)酶法脱蛋白工艺
粗多糖溶液※调节底物浓度※调节水浴温度※调节 pH
值※加酶※混合均匀※调 pH 值 、保温 、酶解※灭酶※冷却
※离心※脱蛋白后的粗多糖溶液
1.3.3　Sevag 法脱蛋白试验　向粗多糖溶液中加入该溶液
体积 20%的 Sevag试剂(氯仿∶正丁醇 = 4∶1), 磁力搅拌
2 h , 经离心(4 000 r/ min , 20 min , 离心 4 次)去除沉淀物后 ,
分别测定每次离心后溶液的蛋白质和多糖含量[ 8] 。
1.3.4　酶法脱蛋白试验　选取温度 、时间 、酶用量 、pH 值为
主要因素[ 9] , 通过单因素试验得出各因素水平取值 , 进行
L 9(34)正交试验 , 以粗多糖溶液中的蛋白质含量为考察指
标 , 优化酶法脱蛋白工艺参数。因素水平见表 1。
表 1　L9(34)正交试验因素水平表
Table 1　The factor level of L9(34)o rthogonal test
水平 A 酶用量/ % B 温度/ ℃ C 时间/ h D pH 值
1 1 40 0.5 5
2 2 45 1.0 6
3 3 50 2.0 7
1.3.5　三氯乙酸法脱蛋白试验　向粗多糖溶液中加入三氯
乙酸溶液 , 并不断振摇 ,然后离心(4 000 r/ min , 20 min)去除
沉淀物 , 测定离心后的蛋白质含量。为选出最佳的振摇时间
和三氯乙酸用量 , 根据预试验 , 设定振摇时间为 10 , 15 , 20 ,
25 , 30 , 35 min;三氯乙酸用量分别为 5%, 10%, 15%, 20%,
进行单因素试验。
1.3.6　酶法和 Sevag 法相结合脱蛋白试验　酶法和 Sevag
法相结合交替使用脱蛋白 , 测定蛋白质和多糖含量。
1.4　蛋白质去除率和多糖损失率的计算
蛋白质去除率按式(1)计算 ,多糖损失率按式(2)计算:
蛋白质去除率 = R0 -R x
R 0
×100% (1)
式中:
R0 ——— 粗多糖溶液中蛋白质的百分含量 , %, 本试验粗
多糖溶液中蛋白质的百分含量为 6.54%;
R x——— 脱蛋白液中蛋白质的百分含量 , %。
多糖损失率 = T0 -T x
T 0
×100% (2)
式中:
T0 ——— 粗多糖溶液液中多糖的百分含量 , %, 本试验粗
多糖溶液中多糖的百分含量为 4.85%;
T x ——— 脱蛋白液中多糖的百分含量 , %。
2　结果与分析
2.1　Sevag法脱蛋白结果
Sevag 法脱蛋白次数与粗多糖溶液中蛋白质含量的关系
见图 1。
图 1　Sevag 法脱蛋白次数与粗多糖
溶液中蛋白质含量的关系
F igure 1　The relationship between times of pro tein
r emoval and pro tein content of c rude
polysaccha ride so lution by sevag method
由图 1 可知 , 随着脱蛋白次数的增加 , 粗多糖溶液中蛋
白质的含量不断减少 , 经过 4 次脱蛋白后粗多糖中蛋白质百
分含量仅为 1.4%。根据 1.4 的计算公式 , 得出蛋白质的去
除率为 78.6%, 多糖损失率为 21.11%, 说明此法脱蛋白效
果较好 , 但同时多糖的损失率也较高。
2.2　酶法脱蛋白结果
酶解温度 、时间 、酶用量 、pH 值对粗多糖溶液中蛋白质
含量的影响表 2。
从表 2 可以看出 , 参试因素对试验指标影响的主次顺序
是 D ﹥ A ﹥ B ﹥ C ,即 pH 值对脱蛋白的影响最大 , 其次是
酶用量和温度 , 最后是脱蛋白时间。正交试验所得的酶法脱
蛋白最优组合是 A 2B1C3D1 ,即酶用量 2%, 温度 40 ℃, 时间
2 h , pH 值 5 , 在此条件下进行 3 次验证试验 , 测得粗多糖中
的蛋白质平均含量为 3.14%, 多糖损失率为 6.32%。
2.3　三氯乙酸法脱蛋白结果
2.3.1　三氯乙酸浓度对脱蛋白效果的影响　在多糖溶液中
加入一定浓度的三氯乙酸 , 振摇 25 min , 研究三氯乙酸浓度
对脱蛋白效果的影响 , 结果见图 2。由图 2可知 , 随三氯乙酸
用量的逐渐增加 , 蛋白质含量不断减少。当三氯乙酸浓度为
10%时 ,蛋白质的含量几乎不再降低 , 考虑到经济成本 , 选三
氯乙酸浓度 10%为最佳用量。
2.3.2　振摇时间对脱蛋白效果的影响　在多糖溶液中加入
10%三氯乙酸 , 研究振摇时间对脱蛋白的影响 ,结果见图 3。
6
基础研究 　 2010年第 2期
表 2　酶法脱蛋白正交试验结果
Table 2　The o rthogonal te st result of pro tein
removal by enzyme me thod
组别 A B C D 蛋白质含量/ %
1 1 1 1 1 4.32
2 1 2 2 2 5.28
3 1 3 3 3 4.86
4 2 1 2 3 3.82
5 2 2 3 1 3.69
6 2 3 1 2 5.17
7 3 1 3 2 4.38
8 3 2 1 3 4.75
9 3 3 2 1 3.88
K 1 14.46 12.52 14.24 11.89
K 2 12.68 13.72 12.98 14.83 T = 40.15
K 3 13.01 13.91 12.93 13.43
k1 4.82 4.17 4.75 3.96
k2 4.23 4.57 4.33 4.94
k3 4.34 4.64 4.31 4.48
R 0.59 0.47 0.44 0.98
图 2　三氯乙酸浓度对脱蛋白的影响
Figure 2　Effects of TCA concent ration on pro tein removal
图 3　振摇时间对脱蛋白的影响
Figure 3　Effects of shaking time on pro tein removal
由图 3 可知 , 振摇时间从 10 min 增加到 20 min 时 ,蛋白
质含量降低较显著 , 而从 20 min 到 35 min 时 ,其含量降低甚
微 , 综合考虑脱蛋白效果的和时间成本 , 选择振摇时间为
20 min。
在三氯乙酸浓度为 10%, 振摇时间为 20 min 下 , 进行 3
次脱蛋白验证试验 , 测得粗多糖中蛋白质平均含量为
3.96%,多糖损失率为 15.9%。
2.4　酶-Sevag法脱蛋白结果
在粗多糖溶液中加入 2%的木瓜蛋白酶 , 调节 pH 值为
5.0 , 在 40 ℃下保温 2 h ,灭酶 ,流水降温后 , 按照 1.3.2 (2)
进行 Sevag 法脱蛋白。
从图 4可以看出 ,采用酶法和 Sevag 法相结合脱蛋白, 当
重复 3次试验后 ,蛋白质含量明显减少 , 综合考虑蛋白质的去
除和多糖的损失 , 确定脱蛋白次数 3 次为最佳。经 3 次验证
试验 ,测得蛋白质平均含量仅为 1.9%,多糖损失率为 6.58%。
图 4　酶-Sevag 法脱蛋白次数与粗多糖
溶液中蛋白质含量的关系
F igure 4　The relationship between times of pro tein
r emoval and pro tein content of c rude po ly-
saccha ride so lution by enzyme-sevag me thod
2.5　4 种方法脱蛋白效果比较
通过蛋白质的去除率和多糖的损失率 , 考察 4 种方法对
粪鬼伞粗多糖的脱蛋白效果[ 10 -11] , 结果见表 3。由表 3 可
知 , 酶法-Sevag 法联用不但脱蛋白效果好 , 多糖损失也很
小 , 因此 ,适用于粪鬼伞多糖脱蛋白。
表 3　4 种方法脱蛋白效果比较
Table 3　The comparison o f four methods
fo r pro tein remova l / %
方法 脱蛋白工艺参数 蛋白质含量
多糖
含量
蛋白质
去除率
多糖
损失率
S evag
法
Sevag 试剂浓度 20%;
脱蛋白 3次; 1.40 3.83 78.60 21.11
三氯乙
酸法
三氯乙酸浓度 10%;振
摇时间 20 min; 3.96 4.08 39.45 15.90
酶法 酶用量 2%;温度 40 ℃;时间 2 h;pH 值 5.0; 3.14 4.54 51.99 6.32
酶 -
S evag
法
酶用量 2%;温度 40 ℃;
时间 2 h;pH 值 5.0;
Sevag 试剂浓度 20%;
脱蛋白 3次;
1.90 4.53 70.95 6.58
　　 　粗多糖中蛋白质含量为 6.54%,多糖含量为 4.85%。
(下转第 12页)
7
第 26卷第 2期 解耸林等:粪鬼伞多糖脱蛋白方法的研究 　
度和 pH 值也存在相关关系[ 14] 。内聚性受斩拌速度影响很
小。随着斩拌速度的变化 , 乳化肠的质构的咀嚼性呈现倒抛
物线状态 , 这与硬度的相关性很大。随着斩拌速度的增加 ,
回复性变化不大 , 在此还不能解释该现象 ,有待进一步研究。
3.2　斩拌时间对乳化肠质构的影响
在低斩拌速度的条件下 , 随着斩拌时间的增加 , 乳化肠
的硬度逐渐降低;在高斩拌速度情况下 , 随着斩拌时间的增
加 , 乳化肠的硬度逐渐降低 , 斩拌速度和斩拌时间对乳化肠
的硬度存在交互作用;乳化肠的弹性受斩拌时间的影响很
小 , 这与孔保华等的研究[ 3]不同 , 可能还受到 pH 值的影响 。
内聚性和咀嚼性受斩拌时间影响很小。随着斩拌时间的增
加 , 回复性先增加后呈减小趋势 , 可能的原因是当肌原纤维
的溶解度达到一定值时 , 凝胶的弹性不再随蛋白质溶解量
的增加而增大。
4　结论
(1)斩拌速度对乳化肠的硬度 、弹性和回复性均有显著
影响 , 斩拌时间对回复性有显著的影响 , 斩拌速度和斩拌时
间的交互作用对硬度和回复性有显著的影响。
(2)斩拌速度最大 ,斩拌时间 、硬度 、咀嚼性和内聚性在
合适的范围内 , 弹性和回复性最大 , 得到乳化肠质构的优化
配比为:斩拌速度为 6 000 r/ min ,斩拌时间为 9 min 时 , 形成
的乳化肠的硬度 、弹性 、内聚性 、咀嚼性和回复性最好。
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(上接第 7 页)
3　结论
试验发现 , 采用酶法和 Sevag 法联用脱蛋白效果较好 ,
其最佳工艺参数为:在温度为 40 ℃, pH 值为 5 的条件下 , 木
瓜蛋白酶用量为 2%,脱蛋白时间 2 h;Sevag试剂浓度 20%,
脱蛋白次数 3 次 , 其蛋白质去除率达到 70.95%, 多糖损失率
仅为 6.58%。
但无论采用单一方法还是采用酶法和 sevag 法相结合
脱蛋白 , 多糖溶液中仍含少量蛋白质。可能是这部分蛋白质
与多糖牢固结合形成了糖复合物 , 如要获得纯多糖制品 , 还
需要经过其他一系列提纯工序。
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第 26卷第 2期 崔艳飞等:斩拌速度和时间对乳化肠质构的影响