全 文 ：大孔吸附树脂富集纯化布渣叶总黄酮的研究
李坤平1, 2 ,潘天玲 1 ,高崇凯 1 ,李卫民 2
(1.广东药学院 ,广东 广州 510006;2.广州中医药大学 ,广东 广州 510405)
　　摘要　目的:对大孔树脂富集纯化布渣叶总黄酮的工艺条件及参数进行优化。方法:先以总黄酮比吸附量和
解吸率为指标 , 通过静态和动态吸附-解吸附试验筛选出合适的树脂;再通过单因素试验考察最佳洗脱剂浓度 ,利
用均匀设计对富集纯化工艺参数进行优化;并用液相色谱对处理前后的试样进行定性分析。结果:D101树脂具有
良好的吸附分离性能;选择 70%乙醇为洗脱剂 ,以总黄酮收率为指标 ,优选的工艺参数为:上样流速 1.0BV/h、洗脱
流速 2.0BV/h、上样浓度 7.88mg/mL、洗脱剂用量 2.0BV和 pH值 4.8,其收率达到 90.18%,纯度 54.37%;以总黄
酮纯度为指标 , 优化的工艺参数为:上样流速 1.0 BV/h、洗脱流速 2.0 BV/h、上样浓度 2.0 mg/mL、洗脱剂用量 2.8
BV和 pH值 7.8,其纯度为 61.77%, 收率 80.25%。色谱分析结果表明 ,大孔树脂处理前后布渣叶总黄酮主成分相
同。结论:D101大孔树脂吸附分离工艺能有效地对布渣叶总黄酮进行富集。
关键词　布渣叶;总黄酮;大孔树脂;均匀设计;富集纯化
中图分类号:R248.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)04-0601-04
StudyontheEnrichmentandPurificationofTotalFlavonoidsinMicrocos
paniculatabyMacroporousAdsorptionResin
LIKun-ping1, 2 , PANTian-ling1 , GAOChong-kai1 , LIWei-min2
(1.GuangdongPharmaceuticalUniversity, Guangzhou510006, China; 2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine, Guangzhou
510405, China)
Abstract　Objective:ToestablishanoptimumenrichmentandpurificationprocessoftotalflavonoidsinMicrocospaniculataby
macroporousresins.Methods:Fivekindsofresinswerecomparedandthebestonewaschosen.Thentheparametersoftheprocesswere
optimizedbysinglefactortests, uniformdesignandstatisticalmethods.Results:D101wasselectedforitsexcellentadsorptionandde-
sorptionproperties, 70% ethanolwasfoundtobethebestelutionsolution.Asfarastheyieldwasconsidered, thebestresultwasbased
onthefolowings:feedrate-1.0 BV/h, elutionflowrate-2.0 BV/h, sampleconcentration-7.88 mg/mL, elutingagentamount-2.0 BV,
pHvalue-4.8;thentheyieldreached90.18% andthepuritywas54.37%.Ifthepuritywasconsidered, thebestparameterswereas
folows:feedrate-1.0 BV/h, elutionflowrate-2.0 BV/h, sampleconcentration-2.0 mg/mL, elutingagentamount-2.8 BV, pHvalue-
7.8;thenthepurityreached61.77%andtheyieldwas80.25%.Conclusion:ThetotalflavonoidsofMicrocospaniculatacanbeeffec-
tivelypurificatedandseparatedbyD101macroporousresin.
Keywords　MicrocospaniculataL.;Totalflavonoids;Macroporousresins;Uniformdesign;Enrichmentandpurification
收稿日期:2008-10-16基金项目:广东省科技计划项目(2006B35605004)作者简介:李坤平(1978-),男,讲师 ,博士生 ,研究方向:中药制药工程。
　　布渣叶系椴树科植物破布树(Microcospanicula-
taL.)的叶 ,其味甘 、淡 ,性微寒 ,有清热消滞 、利湿
退黄的功效 ,收载于广东省中药材标准 ,是 “广东凉
茶 ”、“王老吉 ”、“六和茶 ”、“仙草爽凉茶 ”和 “甘和
茶 ”等中成药的原料 ,民间亦常采之晒干泡水作茶
饮 〔1, 2〕。经研究发现布渣叶富含黄酮类化合物 〔3〕 ,
黄酮类化合物是一类重要的天然产物 ,具有多种生
理活性 ,是许多中药的有效成分;但迄今为止 ,布渣
叶主要用作凉茶和一些低端制剂产品的原料 ,其药
用价值亟待进一步开发。本文在前期研究的基础上
对利用大孔树脂富集纯化布渣叶总黄酮的工艺进行
了研究 ,并对其工艺参数进行了优化 ,以期为其开发
利用提供参考。
1　材料与仪器
1.1　材料　布渣叶 ,购自广州致信中药饮片有限
公司(批号:080320),由广州中医药大学中药学院
李卫民教授鉴定为椴树科植物破布树(Microcospan-
iculataL.)的叶 ,粉碎 , 过 20目筛 , 备用 。大孔树
脂:D101(天津市海光化工有限公司), NKA、NKA-
9、X-5和 AB-8(南开大学化工厂)。芦丁对照品购
自中国药品生物制品检定所(批号:050923)。氢氧
化钠 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、甲醇 、乙醇等均为市售分析
纯。乙腈 、甲酸为色谱纯 。
1.2　仪器　AcquityUPLC超高效液相色谱 ,二元
梯度输液泵和自动进样器(美国 Waters公司),紫外
可见分光光度计(TU-1810,北京普析通用仪器有限
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.04.044
责任公司),空气恒温振荡器(KYC-100,上海福玛实
验设备有限公司),蠕动泵(BT00-100M,常州市诚合
卫生设备厂)。
2 　方法
2.1 　布渣叶总黄酮供试液的制备〔4〕　总黄酮浓度
C0 =3.334 mg/mL。
2.2 　总黄酮浓度的测定〔4, 5〕 　采用 Al(NO3)3-
NaNO2 -NaOH体系比色法测定 。
2.3 　静态吸附 -解吸附试验　准确称取经预处理
的树脂各 5.0 g,置于 100 mL三角瓶中 ,加入 “2.1”
项的供试液 30 mL(C0 =3.334 mg/mL), 30℃、150
r/min振荡 24 h,静置 ,测定总黄酮平衡浓度 Ce;再
滤出上述已吸附平衡的树脂 ,用 50 mL去离子水冲
洗后用滤纸吸干 ,加入 30mL95%乙醇 , 30℃、150 r/
min解吸附 2 h,测其总黄酮浓度 Cd,按公式(1)、
(2)计算静态比吸附量和静态解吸附率。
Qe/(mg/g)=(C0 -Ce)V0m (1)
De/% = CdVd(C0 -Ce)V0 ×100% (2)
式中:Qe-静态比吸附量 (mg/g);C0 -初始浓度
(mg/mL);Ce-平衡浓度 (mg/mL);V0 -吸附液体积
(mL);m-树脂重量(g);De-静态解吸附率;Cd-洗脱
液浓度(mg/mL);Vd-洗脱液体积(mL)。
2.4 　动态吸附 -解吸附试验　准确称取经预处理
的大孔树脂各 50.0 g,装柱 ,以 2 mL/min的流速上
样(C0 =3.334mg/mL, V0 =300mL),并将吸附后的
试液再上柱吸附 1次 ,测其平衡吸附后的总黄酮浓
度 ,再用 200mL去离子水洗去杂质 ,最后用 200 mL
95%乙醇洗脱 , 测其总黄酮浓度 Cd, 按公式 (3)、
(4)计算动态比吸附量和动态解吸附率。
Qe′/(mg/g)=(C0 -Ce′)V0′m′ (3)
De′/%= Cd′Vd′(C0 -Ce′)V0′×100% (4)
式中:Qe′-动态比吸附量(mg/g);C0-初始浓度
(mg/mL);Ce′-平衡浓度(mg/mL);V0′-吸附液体积
(mL);m′-树脂重量(g);De′-动态解吸附率;Cd′-洗
脱液浓度(mg/mL);Vd′-洗脱液体积(mL)。
2.5　洗脱剂乙醇浓度的选择　称取筛选出的性能
最好的大孔树脂 50.0 g,装柱 ,按照 “2.4”项下方法
上样(C0 =3.334mg/mL, V0 =300mL)并洗脱;先用
180 mL水洗 ,每 30 mL收集 1份 ,再依次用 10%、
30%、50%、70%、95%乙醇各 60mL以 2mL/min的
流速洗脱 ,每 10mL收集 1份 ,分别测定各流份的总
黄酮浓度 ,绘制动态梯度洗脱曲线 ,根据不同浓度乙
醇脱附能力的大小选择合适的洗脱剂浓度。
2.6　均匀设计优化工艺参数 〔6〕　采用 DPS软件
生成 U12(42 ×63)混合水平均匀设计表安排试验条
件;每次称取 50.0 g树脂 ,装柱 ,上样 ,对大孔树脂
吸附分离的影响因素(包括试样的 pH值 、上样浓度 、
上样流速 、洗脱流速和洗脱剂用量等)进行优化。
2.7　布渣叶总黄酮的超高效液相色谱分析　将布
渣叶总黄酮配制成 0.5 mg/mL甲醇溶液 ,过 0.25
μm膜后进样分析。选择 AcquityUPLCTMBEHC18
(50 mm ×2.1mm, 1.7μm)色谱柱;流动相为甲醇
(A)-水(含 0.1%甲酸 , B),流速为 0.2mL/min,依
下列程序梯度洗脱:0※7.6 min, 85% ※60% (B);
7.6※10 min, 60% ※60% (B);10 ※ 12 min, 60%
※30% (B);12 ※15min, 30%※20% (B);自动进
样 ,进样量 1.0 μL,检测波长 276 nm。
3　结果与分析
3.1　大孔吸附树脂的筛选　大孔树脂种类较多 ,
不同型号树脂的结构和性状对其吸附分离性能影响
较大 〔7〕。表 1为大孔树脂静态和动态吸附-解吸附
的试验结果 。由表 1可知 ,大孔树脂 D101和 NKA
的静态比吸附量分别达到了 18.86 mg/g和 18.48
mg/g,相应的静态解吸附率也达到了 95.92%和
89.01%,对布渣叶总黄酮均具有良好的吸附分离性
能;但相比而言 D101的动态比吸附量和动态解吸
附率均高于 NKA,达到了 12.66 mg/g和 94.51%,
故选用 D101树脂用于布渣叶总黄酮富集纯化工艺
研究 。
　　表 1 　大孔树脂静态和动态吸附-解吸附试验结果
树脂 极性 比表面积 /(m2 /g) 平均孔径 /nm Qe/(mg/g) De/% Q′e/(mg/g) D′e/%
D101 非极性 480 ～ 550 90 ～ 100 18.86 95.92 12.66 94.51
NKA 非极性 570 ～ 590 200 ～ 220 18.48 89.01 12.27 90.24
X-5 非极性 500 ～ 600 290 ～ 300 17.71 87.17 11.55 82.94
AB-8 弱极性 480 ～ 520 130 ～ 140 17.36 83.54 11.78 76.88
NKA-9 极性 250 ～ 290 155 ～ 165 16.60 69.28 10.74 65.76
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3.2 　大孔吸附树脂的动态洗脱曲线 　图 1是
D101大孔吸附树脂柱吸附后的洗脱过程中总黄酮
量的变化曲线。由图 1可以看出 ,不同浓度的乙醇
的解吸附能力差别较大 ,且随着乙醇浓度的增加洗
脱能力加大 。在 10% ～ 30%乙醇洗脱区间内 ,总黄
酮洗脱量较小;而在 50%和 70%乙醇洗脱区间 ,其
洗脱量占总上样量的 84.96%。因此在后续工艺优
化研究中 ,洗脱工艺定为上样后先用 2BV水洗脱 ,
再用 1.0 BV30%乙醇洗脱 ,最后用 70%乙醇洗脱
并收集布渣叶总黄酮 。
图 1　D101大孔树脂吸附布渣叶
总黄酮动态洗脱曲线
3.3　均匀设计试验结果与分析　按照 “ 2.6”项下
U12(42 ×63)混合水平均匀设计表的试验条件 ,上样
吸附并洗脱;70%乙醇洗脱液分成两等份 ,一份测其
总黄酮浓度 ,另一份回收溶剂 ,干燥后测定称重 ,计
算总黄酮纯度及其收率 ,结果如表 2所示。
　　以布渣叶总黄酮试液经大孔树脂柱上样吸附 、
洗脱后的收率和所得总黄酮的纯度为评价指标 ,将
表 2数据由 DPS数据处理系统经二次多项式逐步
回归分析 ,结合吸附分离传质过程原理 ,得到回归方
程 1:Y1 =52-39.83X1 +5.43X3 +50.59X4 -0.14X23
-13.44X24 -0.26X25 +5.99X1X5 -0.05X2X3 +
0.53X3X4 -0.85X3X5 (F=1405.028 , P=0.021, R
=0.996)和回归方程 2:Y2 =174.18 -26.76X1 -
71.29X2 - 3.0X3 - 4.04X4 +5.74X21 +16.98X22 +
1.73X24 +0.92X1X3 +0.64X2X3 -0.31X3X4 (F=
237.375, P=0.013 , r=0.998),从各方程的统计
量看出两个方程拟合度良好 , 均具有统计学意
义 。
　　表 2 　D101型大孔树脂 U
12
(42 ×63)混合水平均匀设计试验结果
试验号 X1上样流速/(BV/h) X2洗脱流速 /(BV/h) X3上样浓度 /(mg/mL) X4洗脱剂量 /(BV) X5 pH值 Y1收率 /% Y2纯度 /%
1 2.4 2.4 9.2 1.2 7.2 74.201 56.74
2 0.6 1.6 12.8 2.8 7.2 62.957 50.04
3 0.6 2.4 2.0 2.0 5.4 95.369 66.11
4 1.2 1.2 5.6 1.6 7.8 83.925 62.50
5 1.8 1.2 9.2 2.4 4.8 81.591 57.32
6 0.6 1.2 16.4 1.2 6.0 58.499 50.48
7 1.8 1.6 2.0 0.8 6.6 71.552 56.59
8 1.2 2.4 20.0 2.4 6.6 47.357 44.19
9 2.4 1.6 20.0 1.6 5.4 49.020 52.11
10 2.4 2.0 5.6 2.8 6.0 74.538 54.75
11 1.2 2.0 12.8 0.8 4.8 62.923 50.07
12 1.8 2.0 16.4 2.0 7.8 54.022 46.12
　　注:上样量均为 2BV;1BV按 80mL计算;所有试验均在室温操作
　　由 DPS软件预测的 Y1max=96.29%及其各因素
组合为:X1 =0.6, X2 =2.0, X3 =7.88, X4 =2.0, X5 =
4.8和 Y2max=68.47%及其各因素组合为:X1 =0.6,
X2 =2.4, X3 =2.0, X4 =2.8, X5 =7.8。二者皆要 X1
取最小值 ,但实际操作中 X1值太小 ,即上样流速太
小会造成树脂柱富集分离的效率和能力降低;所以
后续工艺中 X1取值 1.0,此时由回归方程计算得
Y1max′=91.86%, Y2max′=63.44%。
综上所述 ,若以总黄酮收率为评价指标 ,优选的
工艺参数为:上样流速 1.0 BV/h、洗脱流速 2.0 BV/
h、上样浓度 7.88 mg/mL、洗脱剂用量 2.0 BV和 pH
值 4.8。若以总黄酮纯度为评价指标 ,优化的工艺
参数为:上样流速 1.0 BV/h、洗脱流速 2.0 BV/h、上
样浓度 2.0 mg/mL、洗脱剂用量 2.8 BV和 pH值
7.8。
3.4　工艺参数的验证与布渣叶总黄酮的色谱分析
　按照 “ 3.3”项的优选工艺参数 ,上样吸附并洗脱 ,
结果以布渣叶总黄酮收率为评价指标的试验组 2次
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试验结果的平均收率为 90.18%,纯度 54.37%;以
布渣叶总黄酮纯度为评价指标的试验组 2次试验结
果的平均纯度为 61.77%,收率 80.25%。验证试验
结果与回归方程预测值基本吻合 ,说明前期试验设
计合理 ,优选的工艺参数稳定可靠。
经过大孔树脂处理 ,布渣叶总黄酮的液相色谱
指纹图谱基本没有变化 ,但各峰的浓度均较处理前
变大了 ,这说明 D101大孔树脂处理过程中主要成
分没有损失 ,同时其总黄酮部位得到了富集纯化 ,其
吸附分离过程的传质规律正在进一步的研究中 。
4 　小结
D101大孔树脂对布渣叶总黄酮具有良好的吸
附分离性能 ,其动态比吸附量和动态解吸附率分别
达到了 12.66 mg/g和 94.51%。 UPLC分析结果表
明 ,大孔树脂处理前后布渣叶总黄酮液相色谱指纹
图谱基本没有变化 ,通过大孔树脂吸附分离工艺能
够对其进行有效的富集纯化。
参 考 文 献
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册)[ M] .广州:广东科技出版社 , 2004:66-67.
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分的研究 [ J] .热带亚热带植物学报 , 2008, 16(1):51-
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[ 4] 潘天玲 , 李坤平 ,贲永光 , 等.正交试验法优化布渣叶总
黄酮提取工艺的研究 [ J] .广东药学院学报 , 2008, 24
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的富集纯化特性研究 [ J] .广东药学院学报 , 2008, 24
(6):539-542.
收稿日期:2008-08-14作者简介:西娜(1982-),女 ,主管药师 ,在读博士研究生 ,研究方向:天然药物的纳米制剂;E-mail:xfiona224@yahoo.com.cn。＊通讯作者:侯连兵 , Tel:020-61642175, E-mail:hlianbing@ 163.com。
羟基喜树碱两亲性嵌段共聚物纳米粒的制备及性质
西　娜 ,侯连兵＊
(南方医科大学南方医院药学部 ,广东 广州 510515)
　　摘要　目的:制备羟基喜树碱(hydroxycamptothecin, HCPT)的两亲性嵌段共聚物纳米粒并进行初步的性质考
察。方法:本文合成了聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物(polyethyleneglycol-polycaprolatone, PEG-PCL), 用 1H-NMR对
其结构进行了表征 , 并以此为载体材料 , 采用溶剂扩散法制备了羟基喜树两亲性嵌段共聚物纳米粒(HCPT-PEG-
PCL-NPs), 并对其进行初步的质量评价及稳定性考察。结果:制备的 HCPT-PEG-PCL-NPs平均粒径为 164.5nm,多
分散系数为 0.14, 载药量为 5.49%, 包封率为 83.2%, ξ电位为 -26.1 mV;冻干粉剂的稳定性较好 , 但高温环境不
利于保存。结论:本文制备的纳米粒大大增加了 HCPT的水溶性 , 是一种值得研究开发的 HCPT的新剂型。
关键词　羟基喜树碱;两亲性嵌段共聚物;长循环;聚乙二醇-聚己内酯;抗癌药物
中图分类号:R293/R979.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)04-0604-04
PreparationandCharacterizationofHydroxycamptothecinNanoparticlesof
AmphiphilicBlockCopolymer
XINa, HOULian-bing
(DepartmentofPharmacy, NanfangHospital, SouthernMedicalUniversity, Guangzhou510515, China)
Abstract　Objective:Topreparehydroxycamptothecinnanoparticlesofamphiphilicblockcopolymerandstudyitscharacterization
initially.Methods:Polyethyleneglycol-polycaprolactone(PEG-PCL)wassynthesizedanditsstructurewascharacterizedby1H-NMR.
TheHCPT-PEG-PCL-NPswerepreparedbysolvent-difusionmethodusingPEG-PCLblockcopolymerasamatrixandHCPTasananti-
tumoragent.ThentheobtainedNPswereevaluatedandthephysicalstabilitiesofbothsusplandfreezedryingpowderwereinvestiga-
ted.Results:ThemeanparticlesizeofthepreparedNPswas164.5nm, polydispersityindex(PI)was0.14, drugloading(DL)was
5.49%, entrapmenteficiency(EE)was83.2%, ξpotentialwas-26.1mV.Thephysicalstabilityoffreezedryingpowderwasbet-
·604· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 4期 2009年 4月