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菝葜各化学部位对大鼠慢性盆腔炎模型的治疗作用



全 文 :文章编号:1000-5404(2013)12-1267-04 论著
菝葜各化学部位对大鼠慢性盆腔炎模型的治疗作用
马 云1,罗艳琴1,宋路瑶1,龚 恬2,侯连兵1 (510515 广州,南方医科大学南方医院药学部1;510500 广州,解放军 76171
部队2)
[摘要] 目的 研究菝葜乙醇总提取物及各化学部位对慢性盆腔炎疾病(chronic pelvic inflammatory diease,CPID)模
型大鼠的血液学及病理形态学改变的影响,筛选出菝葜抗慢性盆腔炎的主要活性部位。方法 160 只 SD 雌性大鼠按随
机数字表法分为 16 个组,除空白对照组和假手术组,其余各组均采用苯酚胶浆注入大鼠子宫造成大鼠 CPID 模型。其中
4 个化学部位的高、中、低剂量组,均分别灌胃给予 32. 4、16. 2、8. 1 g /kg,金刚藤胶囊组 16. 2 g /kg 灌胃给药,模型对照组、
空白对照组和假手术组均给予等体积蒸馏水。每日 1 次,连续给药 10 d。末次给药 24 h 后,各组大鼠腹主动脉采血进行
血液学指标检测;摘除双侧子宫观察大鼠子宫的病理改变。结果 菝葜的乙酸乙酯部位高、中剂量组能显著降低 CPID模
型大鼠的子宫炎症反应,较模型对照组均有统计学差异(P < 0. 01)。病理观察显示菝葜乙酸乙酯部位能明显改善大鼠子
宫肿胀程度,镜下观察其抗炎效果与菝葜乙醇提取液组相当,明显优于正丁醇组和水液组。结论 菝葜的乙酸乙酯部位
为菝葜抗慢性盆腔炎的主要活性部位。
[关键词] 菝葜;慢性盆腔炎;活性部位;化学部位
[中图法分类号] R-332;R282. 71;R711. 33 [文献标志码] A
[通信作者] 侯连兵,电话:(020)61642175,E-mail:hlianbing@ 163. com
[优先出版] http:/ /www. cnki. net /kcms /detail /51. 1095. R. 20130321. 1106. 026.
html(2013-03-21)
Therapeutic effect of chemical fractions of Smilax china on Chronic pelvic inflam-
mation disease in rats
Ma Yun1,Luo Yanqin1,Song Luyao1,Gong Tian2,Hou Lianbing1(1Department of Pharmacy,Nanfang Hospital,Southern Med-
ical University,Guangzhou,Guangdong Province,510515;276171 Guangzhou,Guangdong Province,510515,China)
[Abstract] Objective To study the effects of the total ethanol extract and separated chemical fractions
of Smilax China on hematological and pathomorphological alterations in rats with chronic pelvic inflammation
disease (CPID) ,and to identify the active sites of Smilax China for treating CPID. Methods One hundred
and sixty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into 16 groups. Rat CPID model were constructed
by intrauterine injection of phenol mucilage. Each of the four chemical fractions of Smilax China was adminis-
tered to the model rats by gavage with three different doses (32. 4,16. 2 and 8. 1 g /kg)for 10 consecutive
days,once per day. Jingangteng capsule was administered in a dose of 16. 2 g /kg as a positive control group.
The rats of model control group,control group and sham-operated group were administered with the same
amount of distilled water. Twenty-four hours after the last drug administration,the rats were killed and blood
was collected from the abdominal aorta for hematological analysis,while the two uteri were removed for patho-
morphological analysis. Results Compared with the model control group,the ethyl acetate fraction of Smilax
significantly ameliorated the inflammatory response in uterus at its high and middle dose (P < 0. 01). Patho-
logical analysis indicated that the uterus swelling extent decreased in Smilax China ethyl acetate fraction group.
The anti-inflammation effect of Smilax China ethyl acetate fraction was equal to that of the total Smilax China
ethanol extract,and was much better than that of Smilax China n-butanol fraction group and water fraction
group. Conclusion The ethyl acetate fraction of Smilax China is the main active fraction against CPID.
[Key words] Smilax;chronic pelvic inflammation;active fraction;chemical fraction
Corresponding author:Hou Lianbing,Tel:86-20-61642175,E-mail:hlianbing@ 163. com
菝葜(Smilax China L.)系百合科菝葜属植物,其
根、茎、叶均可入药,尤以根茎入药最为常见。在全世
界范围内,其总提物制剂广泛应用于慢性盆腔炎、梅
毒、急性细菌性痢疾和慢性肾炎[1]。尤其对于妇科慢
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DOI:10.16016/j.1000-5404.2013.12.001
性炎症、附件炎以及调节免疫、活血化瘀等病症疗效显
著。近年来,中药有效部位研究成为中药现代化进程
的重要组成部分,有研究表明,菝葜有效部位群对慢性
盆腔炎疾病(chronic pelvic inflammatory diease,CPID)
有较好的抗炎镇痛作用[2]。该有效部位群含多个化
学部位,本研究在此基础上选用菝葜的根部,采用乙醇
提取,经乙酸乙酯、正丁醇萃取后得到的 3 个化学部
位,观察菝葜乙醇提取液及 3 个化学部位,其中包括乙
酸乙酯部位、正丁醇部位和水液部位对苯酚胶浆所致
CPID模型大鼠血液学及病理形态学改变的影响,探讨
菝葜治疗 CPID 的单一活性部位,从而使有效物质富
集度高,药效物质相对明确、药理活性相对特定、治疗
标准相对稳定,体现中药科学性和现代化[3],也为进
一步开发菝葜抗 CPID单体提供实验数据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 药物 金刚藤胶囊:湖北福人药业股份有限公司提
供,批号:20110318;醋酸泼尼松:天津药业焦作有限公司,批
号:12010211;以上药物均在实验时以蒸馏水配成所需浓度的
溶液。
1. 1. 2 实验动物 SPF级 SD大鼠160只,雌性,体质量180 ~
220 g,由南方医科大学实验动物中心提供(动物合格证号:
0108038)。实验前将动物置室内适应性饲养 3 d,室温 20 ~24 ℃。
1. 1. 3 试剂 苯酚:广东光华化学厂,批号:20101204;西黄
耆胶:上海汉光化学试剂有限公司,批号:20120109;甘油:广东
光华科技股份有限公司,批号:20110918;戊巴比妥钠:Merck公
司,批号:1212013。
1. 1. 4 仪器 BA110S 分析天平:德国 Sartorius;eclipse Ti-s
型荧光倒置显微镜:日本 Nikon。
1. 2 CPID大鼠模型制作
取 SD雌性大鼠 160 只,禁食不禁水 12 h,3%戊巴比妥钠
30 mg /kg 腹腔注射麻醉后,下腹常规消毒后于正中切口,暴露
子宫,用 0. 2 mL注射器配 0. 1 mL 注射器的针头,于子宫分岔
处进针入子宫腔内,朝右侧卵巢方向缓慢推注 25%苯酚胶浆
0. 06 mL,左侧子宫不注射作为自身对照。造模完成后分层关
腹,消毒术区。保留 10 只仅进行开腹和关腹手术,未注射苯酚
胶浆造模,作为假手术对照组[4]。
1. 3 分组及给药
将 160 只 SD 大鼠按随机表法分为 16 组:菝葜乙醇提取
液,乙酸乙酯层,正丁醇层和水液层的高、中、低剂量组,均分别
灌胃给予 32. 4、16. 2、8. 1 g /kg(按生药量计,即相当于临床等
效剂量的 4、2、1 倍) ,金刚藤胶囊组按生药量计以16. 2 g /kg 灌
胃给药(相当于临床等效剂量的 2 倍) ,模型对照组、空白组和
假手术组均给予等体积蒸馏水。于造模后第 7 天开始给药,每
日 1 次,连续给药 10 d。
1. 4 观察指标
于第 11 天,即末次给药 24 h后,各组大鼠以 3%戊巴比妥
钠 30 mg /kg 腹腔注射麻醉后,腹主动脉采血进行血常规、血流
变检测;肉眼观察大鼠子宫造模侧的形态变化;摘除双侧子宫
置 10%甲醛固定液浸泡,HE常规染色,镜下观察大鼠子宫的病
理改变:腔壁结构改变,上皮细胞增生的程度;上皮细胞是否变
性坏死;慢性炎症细胞浸润的范围、数量及内膜有无充血水肿。
根据炎症病变的程度,每项为正常(-)、轻度(+)、中度(++)
和重度(+++) ,分别评分为 0、1、2、3 分[5],以各组评分之和为
炎性评分结果进行统计学分析。
1. 5 统计学处理
所有数据采用 SPSS 13. 0 统计软件对数据进行分析,计量
资料统计结果用 珋x ± s表示,完全随机设计资料的多个样本均数
比较采用单因素方差分析;组间两两比较,方差齐性时采用
Least-significant Difference法(LSD) ,方差不齐时采用Dunnett’s
T3法;病理评分采用非参数检验的秩和检验进行统计学处理。
2 结果
2. 1 慢性盆腔炎模型大鼠血液学指标的变化
由表 1 可知,模型对照组各项血液学指标较空白对照组有
显著增高(P < 0. 01)。菝葜乙醇提取液组与乙酸乙酯层组的
高、中剂量能显著降低大鼠增高的全血黏度,与模型对照组相
比,差异有统计学意义(P < 0. 01) ;乙酸乙酯层的高剂量可使大
鼠血浆黏度显著降低(P < 0. 01) ;同时菝葜乙醇提液组的高剂
量和乙酸乙酯部位的高剂量组均能降低大鼠红细胞聚集指数
和变形指数(P < 0. 01,P < 0. 05) ,效果与阳性对照药相当;除
正丁醇部位和水液部位,其余各组均能显著降低大鼠白细胞水
平(P < 0. 01)。总体来说,菝葜乙醇提取液组抗大鼠 CPID 作
用与乙酸乙酯层相当;正丁醇层高剂量效果与乙酸乙酯层中剂
量抗大鼠 CPID效果相当,其余各组与模型对照组比较无显著
性差异(P > 0. 05)。
2. 2 形态观察
肉眼观察模型对照组大鼠右侧子宫(注入苯酚胶浆侧)明
显水肿、炎性包快,与周围组织几乎完全粘连,而大鼠左侧子宫
光滑成条状,无粘连(图 1A)。菝葜乙醇提取部位与乙酸乙酯
部位大鼠子宫炎症反应和粘连情况明显好转,子宫腔通畅(图
1B、C) ,而正丁醇部位和水液部位效果不明显(图 1D)。
A B
C D
A:模型对照组;B:菝葜乙醇提取液组(32. 4 g /kg) ;C:菝葜乙酸乙
酯层组(32. 4 g /kg) ;D:菝葜正丁醇层组(32. 4 g /kg)
图 1 各组大鼠给药 10 d后大鼠双侧子宫大体观察
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表 1 菝葜各化学部位对慢性盆腔炎大鼠血液学指标变化的影响 (珋x ± s,n = 10)
全血黏度(mPa·s)
组别
血浆黏度
(mPa·s)
红细胞聚
集指数
红细胞变
形指数
白细胞计数
(×109 /L)高切(100) 中切(60) 低切(10)
模型对照组 6. 24 ± 0. 62d 7. 29 ± 1. 05d 14. 62 ± 2. 7c 1. 36 ± 0. 08d 2. 43 ± 1. 19 1. 26 ± 0. 09 13. 34 ± 5. 69
空白对照组 4. 98 ± 0. 89b 5. 56 ± 0. 79b 10. 78 ± 2. 50b 1. 08 ± 0. 07b 2. 19 ± 0. 09bd 1. 17 ± 0. 06a 4. 28 ± 4. 05b
假手术组 5. 15 ± 0. 68b 5. 60 ± 0. 95b 12. 41 ± 1. 68a 1. 14 ± 0. 20b 2. 35 ± 0. 29 1. 19 ± 0. 13 4. 36 ± 4. 26b
菝葜乙醇提取液 32. 4 g /kg组 5. 12 ± 0. 58b 5. 64 ± 0. 64b 11. 07 ± 1. 32b 1. 16 ± 0. 09a 2. 22 ± 0. 09b 1. 16 ± 0. 07a 5. 78 ± 3. 01b
菝葜乙醇提取液 16. 2 g /kg组 5. 32 ± 0. 84b 6. 04 ± 1. 08b 11. 68 ± 2. 72b 1. 17 ± 0. 18a 2. 38 ± 0. 09 1. 19 ± 0. 08 7. 65 ± 5. 79b
菝葜乙醇提取液 8. 1 g /kg组 5. 42 ± 0. 47b 6. 24 ± 0. 66b 12. 65 ± 1. 95a 1. 27 ± 0. 11 2. 43 ± 0. 12 1. 23 ± 0. 09 7. 32 ± 5. 98b
乙酸乙酯层 32. 4 g /kg组 5. 28 ± 0. 60b 6. 10 ± 0. 69bd 11. 07 ± 1. 32b 1. 13 ± 0. 35b 2. 23 ± 0. 09a 1. 17 ± 0. 07a 2. 59 ± 2. 89b
乙酸乙酯层 16. 2 g /kg组 5. 44 ± 0. 75b 6. 48 ± 0. 83ad 12. 36 ± 1. 73a 1. 16 ± 0. 21a 2. 37 ± 0. 18 1. 19 ± 0. 07 3. 39 ± 3. 70b
乙酸乙酯层 8. 1 g /kg组 5. 72 ± 0. 78 6. 66 ± 0. 56 14. 94 ± 2. 07c 1. 28 ± 0. 09 2. 43 ± 0. 24 1. 23 ± 0. 10 5. 96 ± 3. 29b
正丁醇层 32. 4 g /kg组 5. 56 ± 0. 49b 6. 29 ± 0. 63b 11. 40 ± 1. 59b 1. 21 ± 0. 16a 2. 40 ± 0. 33 1. 22 ± 0. 11 7. 93 ± 3. 47a
正丁醇层 16. 2 g /kg组 5. 68 ± 0. 68 6. 49 ± 0. 79ad 12. 82 ± 2. 14 1. 29 ± 0. 08 2. 51 ± 0. 11 1. 24 ± 0. 11 11. 71 ± 4. 99d
正丁醇层 8. 1 g /kg组 5. 96 ± 0. 79d 7. 29 ± 0. 82d 13. 33 ± 1. 65 1. 33 ± 0. 12c 2. 54 ± 0. 19c 1. 26 ± 0. 08 11. 69 ± 7. 67d
水液层 32. 4 g /kg组 6. 05 ± 0. 51d 7. 00 ± 0. 66d 14. 34 ± 1. 98d 1. 27 ± 1. 15d 2. 57 ± 0. 20d 1. 29 ± 0. 05c 9. 64 ± 4. 64d
水液层 16. 2 g /kg组 6. 21 ± 1. 05d 7. 34 ± 1. 08d 14. 60 ± 2. 53d 1. 28 ± 1. 10d 2. 57 ± 0. 13d 1. 30 ± 0. 13c 13. 24 ± 7. 15d
水液层 8. 1 g /kg组 6. 39 ± 1. 06d 7. 45 ± 1. 39d 15. 46 ± 2. 50d 1. 31 ± 1. 19d 2. 57 ± 0. 13d 1. 33 ± 0. 15d 15. 31 ± 7. 03
金刚藤胶囊 16. 2 g /kg组 5. 43 ± 0. 70b 6. 33 ± 0. 96b 12. 15 ± 2. 49b 1. 21 ± 1. 15b 2. 26 ± 0. 10a 1. 18 ± 0. 10 6. 33 ± 2. 74b
a:P < 0. 05,b:P < 0. 01,与模型对照组比较;c:P < 0. 05,d:P < 0. 01,与假手术组比较
A B C D
E F G H
A:空白对照组;B:假手术组;C:模型对照组;D:金刚藤胶囊组;E:菝葜乙醇提取液高剂量组;F:乙酸乙酯高剂量组;G:正丁醇高剂量组;H:水液
层高剂量组
图 2 各组大鼠给药 10 d后子宫组织标本病理学变化 (HE ×100)
2. 3 病理学观察
镜下观察显示:空白对照组腔壁各层结构清晰,子宫腺体
结构正常,子宫黏膜上皮细胞间质疏松,细胞形态正常,内膜无
充血水肿,宫腔内无脱落物(图 2A) ;假手术组腔壁各层结构完
整、清晰,黏膜上皮细胞呈低柱状,有少量慢性炎症细胞浸润,
无内膜充血水肿(图 2B) ;模型对照组,腔壁结构紊乱,腺体萎
缩变形,内部有大量分泌物,黏膜上皮细胞密集增生呈低乳头状
突入宫腔,全层可见大量慢性炎症细胞浸润,内膜充血水肿明
显(图 2C) ;中药阳性对照组,黏膜上皮细胞变性呈空泡状,固
有层和肌层可见中等量慢性炎症细胞浸润,内膜部分充血、水
肿(图 2D) ;菝葜乙醇提取液高剂量组:黏膜上皮细胞呈低柱状
排列整齐,局部上皮细胞变性坏死脱落,内膜浆膜层组织水肿
情况显著降低,子宫病变基本恢复正常(图 2E) ;乙酸乙酯高剂
量组:腔壁结构基本正常,少量慢性炎症细胞散在黏膜上皮细
胞,形态基本正常,内膜轻度水肿(图 2F) ;正丁醇高剂量组:宫
腔扩张,腔壁结构损害,中等量慢性炎症细胞浸润,膜内上皮细
胞形态及分布基本正常,内膜部分充血水肿(图 2G) ;水液高剂
量组:宫腔粘连、扩张,腔壁结构紊乱,腺体萎缩变形,黏膜上皮
细胞密集增生以低柱状为主,慢性炎症细胞多数散在浸润,内
膜部分充血水肿(图 2H)。通过病理评分可知:菝葜乙醇提取
液组和乙酸乙酯层组能明显改善上述症状,减少慢性炎症细胞
浸润,改善充血、水肿和宫壁各层结构,大部分腺体结构清晰完
整,随着剂量增高,效果越明显。正丁醇层高剂量组炎症改善
不如乙酸乙酯层明显。水液层与模型对照组比较镜下观察无
明显差异。见表 2。
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表 2 菝葜各化学部位对各组慢性盆腔炎大鼠子宫病理组织积分
的影响 (n = 10)
病变等级(分)
组别 秩平均值
- + ++ +++
模型对照组 0 8 14 28 628. 00
假手术组 29 12 6 3 218. 85b
空白对照组 40 9 1 0 115. 71b
金刚藤胶囊组 14 21 17 2 322. 94b
菝葜乙醇提取液 32. 4 g /kg组 11 25 11 3 318. 42b
菝葜乙醇提取液 16. 2 g /kg组 7 33 7 3 388. 43b
菝葜乙醇提取液 8. 1 g /kg组 6 25 12 7 454. 22b
乙酸乙酯层 32. 4 g /kg组 3 19 20 8 302. 21b
乙酸乙酯层 16. 2 g /kg组 6 37 5 2 398. 14b
乙酸乙酯层 8. 1 g /kg组 4 26 14 6 498. 35b
正丁醇层 32. 4 g /kg组 1 16 23 10 381. 06b
正丁醇层 16. 2 g /kg组 6 24 16 4 556. 37a
正丁醇层 8. 1 g /kg组 1 10 23 16 589. 64
水液层 32. 4 g /kg组 1 7 22 20 622. 91
水液层 16. 2 g /kg组 1 4 21 24 586. 17
水液层 8. 1 g /kg组 2 9 15 24 564. 87
a:P < 0. 05,b:P < 0. 01,与模型对照组比较
3 讨论
慢性盆腔炎属于妇科常见病、多发病,该病病情顽
固,复发率高。在发展中国家,因该病的住院率在生育
年龄组已经高达 40%[6],主要临床表现为低热、倦怠
乏力、腹痛、月经不调、痛经、不育。如已形成慢性附件
炎,则可触及肿块[7]。目前西医的药物治疗主要用二
联以上抗生素。但对于 CPID 长期炎症刺激引起的周
围器官粘连、组织增厚、疤痕粘连、局部血液循环障碍
者,抗生素难以渗入组织发挥作用。同时由于抗生素
滥用,易造成严重耐药,致使病情反复发作。慢性盆腔
炎的中医临床表现为出现血证、痛证及癓瘕肿块,月经
不调等,主要表现在血液呈现“浓、黏、凝”的状态,也
即是血液流变学的改变。血液流变学改变是血液循环
和微循环障碍发生的原因和基础,从而导致一系列疾
病。目前,血液流变性、血液黏度的异常被认为是血瘀
证的病理基础之一[8]。
本实验通过血液学研究结果表明,菝葜乙醇提取
液组和乙酸乙酯部位的中、高剂量组均能显著降低炎
症大鼠的全血黏度、血浆黏度,表明该化学部位能促使
大鼠盆腔血流速相对加快,局部血流灌注增加,同时促
进毛细血管增生,改善局部病灶的血液循环,促进局部
水肿的消退和炎症的吸收;通过改善红细胞的弹性和
变形性,降低红细胞在微血管流动时的黏度,缓解血液
“浓、黏、聚、凝”状态,缓解血瘀症状,起到治疗慢性盆
腔炎的作用。此外还能降低 CPID 大鼠血液中白细胞
指标,从而改善炎症反应。然而,引起血液学指标改变
的因素很多,感染、冠心病、恶性肿瘤、白血病等均可使
血液黏度增高。因此,本课题同时对大鼠子宫进行了
大量病理观察,进一步判定菝葜抗 CPID的有效部位。
本实验对苯酚胶浆所致 CPID 大鼠子宫病理切片
均从子宫中轴竖切,观察子宫中段宫腔周围组织的病
理改变,结果表明:菝葜乙醇提取液组和乙酸乙酯部位
能明显减少炎症细胞的浸润,促进组织修复,更好的改
善病变子宫的炎症状态,且当乙酸乙酯部位浓度高于
临床等效剂量的 2倍以上时,效果尤为明显。正丁醇高
剂量组有明显的充血水肿,且腔内有散见上皮细胞坏死
脱落至宫腔,中、低剂量及水液部位 3 个剂量组大鼠子
宫均明显水肿,周围粘连程度较高,抗炎效果不明显。
本研究通过血液学和病理学研究结果证明菝葜乙
醇提取液组和乙酸乙酯部位均具有良好的抗炎作用,
但乙酸乙酯部位比乙醇提取液含生药量更高,如果开
发成制剂,可减少患者服用次数和服用剂量,且有效部
位比总提取液质量更可控,符合中药现代化的研究
目标。
本实验通过大孔树脂对乙酸乙酯部位进行进一步
分离、纯化,经 HPLC 测定其所含物质主要为落新妇
苷、黄杞苷和芦丁,其含量可达 30%左右,其余成分还
在进一步分离验证中。我们认为乙酸乙酯部位可作为
菝葜治疗 CPID的主要活性部位,可进一步开发成临
床疗效确切、毒副作用低、质量可控的菝葜有效成分
新制剂。
参考文献:
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(收稿:2012-11-26;修回:2013-03-10)
(编辑 张 维)
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第 35 卷第 12 期
2013 年 6 月 30 日
第 三 军 医 大 学 学 报
J Third Mil Med Univ
Vol. 35,No. 12
Jun. 30 2013