全 文 ：2015　第十七卷　第三期　★Vol.17 No.3
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕550
菝葜对 TNBS 诱导的溃疡性结肠炎大鼠
TNF-α、NF-κB 的影响＊
刁建新，范　钦，王启瑞，蔡红兵，刘远亮，邵　萌，孙学刚＊＊
（南方医科大学中医药学院　广州　510515）
摘　要：目的：观察菝葜水提物对三硝基苯磺酸（TNBS）诱发大鼠溃疡性结肠炎的疗效，为寻找一种
治疗溃疡性结肠炎（UC）的新药提供实验依据。方法：48只 SD雄性大鼠随机分成 4组，每组 12只，分别
为正常对照组、模型组、菝葜组、强的松组。除正常对照组，其余各组采用 TNBS灌肠法建立 UC模型。连
续灌胃给药 7天后，处死动物，观察结肠组织形态并进行组织学评分，检测大便隐血，HE 染色观察病理变
化，免疫印迹检测 TNF-α 的表达，免疫组化、免疫印迹检测 NF-κB 的表达。结果：菝葜组能改善结肠组
织形态，提高组织学评分；菝葜组 HE 染色显示单核细胞浸润、炎症细胞渗出明显少于模型组；免疫印迹
结果显示菝葜水提物能有效降低 TNF-α 的表达（P<0.01）；免疫组化、免疫印迹显示菝葜水提物可有效
降低 NF-κB 的表达（P<0.01），与强的松组效果相当。结论：菝葜水提物对 TNBS 诱导的 UC 大鼠具有治
疗作用 ,机制可能是减少 TNF-α 的表达，抑制 NF-κB的激活，从而起到抗炎作用，菝葜可能成为治疗 UC
的良药。
关键词：三硝基苯磺酸　菝葜　强的松　结肠炎　TNF-α　NF-κB
doi：10.11842/wst.2015.03.022　　中图分类号：R285.5　　文献标识码：A　　
　　　收稿日期：2014-05-16
　　　修回日期：2014-11-06
＊　　 国家自然科学基金委面上项目（81273621）：MDSC介导的结直肠癌复发微环境脾虚病机及参苓白术散作用机制研究，负责人：孙学刚。
＊＊　通讯作者：孙学刚，教授，主治医师，主要研究方向：消化道肿瘤研究。
溃疡性结肠炎肠病（Ulcerative Colitis，UC）具
有慢性、反复发作的临床特点，发病机制尚不完全
清楚，可能与基因易感性、环境、肠粘膜免疫反应异
常有关。目前没有特异性的治疗药物，因此通过建
立结肠炎动物模型发掘有效的治疗药物具有重要
意义。菝葜为百合科植物菝葜 Smilax china  L. 的
根茎，作为药用的记载，始载于《名医别录》，具有祛
风利湿、解毒散瘀的功效，主要用于治疗妇科炎症，
且效果良好，无明显副作用[1]。动物实验也发现菝
葜具有抗炎作用[2]，但其抗炎作用在 UC 中未见报
道。本实验旨在研究菝葜水提取物在三硝基苯磺酸
（TNBS）诱导 UC 大鼠实验模型中的疗效，探讨其可
能的机制。
1　材料和方法
1.1　材料　
健康 SD  雄性大鼠 48 只，体质量 200-220  g，
由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：
4402102031，SPF 级饲养。
TNBS（美国 Sigma 公司，批号：C9801-25）；兔
抗 NF-κB 多克隆抗体、鼠抗 Actin 单克隆抗体（碧
云天生物试剂有限公司，批号：AN365、AA128），
兔抗 TNF-α 多克隆抗体（武汉博士德生物公司，批
号：BA14901）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（美
国 Cell  Signaling 试剂公司，批号：7074、7076）；免
疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒（福建迈新生物试
剂有限公司，批号：KIT5010、DAB0031）；大便隐
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 551
世界科学技术—中医药现代化★中药研究
血试剂盒［珠海贝索公司的贝索粪便隐血 2 号试剂
盒（Fecal OB- Ⅱ），批号：B04］。菝葜饮片（北京同
仁堂，批号：090706），强的松（广东三才医药集团）。
3K-30Z 型高速冷冻离心机（美国 Sigma 公司），垂
直电泳仪（GE 公司），半干式转膜仪、硝酸纤维素
膜（Bio-Rad 公司），ECL 发光液（Millipore 公司）、
Kodak  2000MM 柯 达 活 体 成 像 仪（Kodak 公 司），
Nikon Eoipse Ti-s 荧光显微镜（日本尼康公司）。
1.2　方法
1.2.1　药物制备
菝葜饮片由南方医科大学中医药学院中药教
研室陈兴兴老师鉴定为正品。取菝葜饮片研成粉
末，煎煮两次（1:8，w/v），将两次滤液合并，过滤，文
火浓缩成 1  g·mL-1。结合成人临床使用量与大鼠
折算的方法（大鼠使用量 = 成人使用量 ×6.28）[3]，
并参照 Shu X S 等[2] 的给药方法制备药物。
1.2.2　造模及给药
SD 雄性大鼠48只，随机分成对照组、模型组、菝葜
组、强的松，每组12只。建立TNBS诱导大鼠UC模型[4]，
造模前禁食24 h，自由饮水，10%水合氯醛（0.35 mg·kg-1）
腹腔注射麻醉，将外径 2 mm 的医用硅胶管轻缓插入
大鼠肛门 6-8 cm，用 1 mL 注射器将 1 mL TNBS/ 乙醇
混合液经硅胶管缓慢推注于结肠，拔出导管，对照组用
1 mL 生理盐水推注，大鼠仰卧，保持肛门高位，自然清
醒，自由饮水、进食。造模 24 h 后，菝葜组、强的松组分
别按 1 200 mg·kg-1、3 mg·kg-1（10 mL·kg-1）的浓度灌
胃给药，每天 1 次，连续 1 周，模型组和对照组以等量
生理盐水灌胃。
1.2.3　一般情况及大便隐血观察　
观察大鼠在饲养过程中有无死亡、精神状态、活
动情况、毛发光泽度、食欲、大便情况（血便、腹泻、
大便次数增多等）及体质量改变，并进行疾病活动
指数（Disease Activity Index，DAI）评分，DAI 评分
标准见表 1。DAI =（体质量下降分数 + 粪便性状
分数 + 隐血分数）。大便性状正常是成形大便；稀便
是糊便或者半成形大便但不黏附肛门；腹泻是水样
便并且黏附肛门。处死大鼠前，从肛门挤一颗粪便
至洁净塑料杯子，滴加 2 mL 生理盐水溶解，取粪便
检查试纸条插入粪便溶解液中，观察阳性结果（按
说明书操作）。
1.2.4　肠标本大体观及取材
取下整段大肠（从肛门至盲肠），沿肠系膜纵向
剪开，用冰生理盐水冲洗干净，普通拍照观察大鼠
结肠黏膜的色泽、溃疡、糜烂、出血点、充血等情况，
组织学评分标准采用欧阳钦等[5] 评分方法：0 分：无
损害；1 分：黏膜充血、水肿，未出现溃疡；2 分：黏膜
充血、水肿，轻度糜烂，无溃疡；3 分：黏膜充血、水
肿，中度糜烂，有单个溃疡；4 分：黏膜充血、水肿，
重度糜烂，有多处溃疡；5 分：黏膜充血、水肿，重
度糜烂，有 >1 cm 溃疡；6-10 分：如果损伤范围 >2 
cm，每增加 1 cm，评分加 1 分。取结肠部位 2 cm，
随机分成 2 份，1 份用 10% 甲醛固定，另一份冻存
于 -80℃。
1.2.5　HE 染色病理观察
常规石蜡包埋，连续切片 4 μm，60℃烤片 1 h，
组织进行脱蜡、梯度酒精水化、苏木精复染、盐酸酒
精分化、流水反蓝、伊红染色、自来水冲洗、梯度酒
精脱水、透明、封片、镜检，应用 Nikon Eoipse Ti-s
显微镜观察，病变按以下标准进行分级。Ⅰ级：基本
正常；Ⅱ级：中性粒细胞浸润，达黏膜层及黏膜固有
层；Ⅲ级：中性粒细胞浸润达黏膜下层；Ⅳ级：隐窝
脓肿，黏膜全层明显细胞浸润；Ⅴ级：糜烂、溃疡、黏
膜坏死，黏膜全层明显细胞浸润。
1.2.6　NF-κB 原位表达检测
组织切片进行脱蜡、水化、柠檬酸钠抗原修复、
3% 双氧水内源性封闭 15 min、5%BSA 外源性封闭
15 min、滴加 NF-κB（1:200）一抗，4℃孵育过夜，
PBS 洗涤 3 次，每次 5 min，滴加二抗，加生物素，
DAB 显色，苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检，随
机选取 5 个高倍（×200）视野观察拍照，采用 ipp6
图片分析软件分析，读出每一张图的阳性结果的灰
度值，灰度值的高低代表阳性的强弱。
1.2.7　Western blotting 检测 TNF-α、NF-κB 的表达
结肠组织剪碎后，液氮研磨，加入 Western 及 IP
细胞裂解液抽提蛋白，BCA 法蛋白定量，12% SDS-
PAGE，上样量 60 μg。将胶上蛋白用半干转移法转
印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，孵育一抗：
分数 体质量减少 /% 大便性状 隐血情况
0 0 正常 正常
10 1-5
20 5-10 稀便或糊便 隐血阳性
30 10-20
40 ＞ 20 腹泻性水样便 肉眼可见血样
表 1　疾病活动指数的评分标准
2015　第十七卷　第三期　★Vol.17 No.3
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕552
Actin（1：1 000 稀释）、TNF-α（1：500 稀释）、NF-κB
（1：500 稀释）4℃孵育过夜，抗鼠、抗兔二抗（1：2 000
稀释）常温孵育 1 h，利用 Kodak 2000 MM 图像工作站
进行检测。图像用 Molecular Imaging Software Version 
4.0（Kodak）进行蛋白条带灰度分析。每一个样品的
灰度值与对应的样品内参 Actin 比较，比值作为该样
品相对蛋白的表达量。
1.3　统计学方法
应用 Spss13.0 软件，数值用均数±标准差（x±s）
表示，采用 One-way ANOVA 分析，方差齐时，两组
比较采用 LSD；当方差不齐时，采用 Welch 稳健估
计，再采用T3方法两两比较。P<0.05有统计学意义。
2　结果
2.1　一般指标的观察及检测
模型组大鼠造模后活动差，进食减少，腹泻，肛
周毛粪染，黄色稀便伴血便，粪便可见少量鲜血，粪
便隐血试验阳性（表 2，表 3），体质量较造模前下
降，病变累及全部大结肠， 呈节段性改变，出现肠壁
增厚、肠腔狭窄、与周围组织粘连、可见粘膜充血水
肿、糜烂，形成浅表大溃疡（图 1）。强的松组、菝葜
组大鼠造模后第 1、2 天出现活动差，进食减少，之
后活动较模型组活跃，便血大鼠比较少。
2.2　菝葜对溃疡性大鼠直肠病理的影响
镜下可见模型组糜烂、溃疡、黏膜坏死，黏膜全
层明显细胞浸润，达到Ⅴ级损伤；强的松组和菝葜
组与模型组比较，炎症细胞减少，中性粒细胞浸润
达黏膜下层并出现溃疡，未出现糜烂达到Ⅲ - Ⅳ级
损伤；菝葜组与强的松组效果相当。如图 2。
2.3　菝葜对 NF-κB 原位表达的影响
NF-κB 主要表达在结肠粘膜固有层浆细胞、单
核细胞、中性粒细胞中，模型组中胞浆和胞核均可
见 NF-κB 的表达，与模型组比较，菝葜组和强的松
组 NF-κB 在胞核中的表达明显减少（P<0.01）。如
图 3，表 4。
2.4　菝葜对 TNF-α、NF-κB 表达的影响
Western  blotting 分析显示，TNF-α、NF-κB 与
对应的 Actin 的比值代表 TNF-α、NF-κB 的表达量。
与模型组相比，菝葜组 TNF-α、NF-κB 的表达水平
显著降低（P<0.01），与强的松组的表达相似，且与
免疫组化结果相一致，如图 4，表 4。
3　讨论
UC 是一种病因尚不明确的慢性肠道炎症性疾
病，主要临床表现以反复发作的腹痛、腹泻、黏液脓
表 2　各组大鼠疾病活动指数和组织学评分结果
（x±s，n=12）
组别 疾病活动指数 组织学评分
对照组 80.7±7.1** 1.4±0.5**
模型组 109.9±15.7 6.1±1.8
菝葜组 96.6±13.6** 4.8±1.6**
强的松组 82.7±10.8** 5.2±1.2**
注：与模型组比较，**P<0.01。
表 3　各组大鼠溃疡的个数及隐血的阳性百分率
（x±s，n=12）
组别 疾病活动指数 组织学评分
对照组 0 0
模型组 83.30% 8.2±2.3
菝葜组 50%** 5.3±1.6**
强的松组 50%** 4.8±3.4**
注：与模型组比较，**P<0.01。   ₏፤ᄥ⚓Ὅಷ㏰㤉㦈㏰ᑦ⮰Ც㏰
图 1　结直肠组织普通拍照的结果
图 2　HE 染色观察病理损伤的结果（×200）
₏፤ᄥ⚓㏰ Ὅಷ㏰㤉㦈㏰ ᑦ⮰Ც㏰
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 553
世界科学技术—中医药现代化★中药研究
血便及里急后重为特征，属于中医“痢疾”、“滞下”、
“肠癖”等范畴，治疗上多采用益气活血、清热利湿
解毒之法[6]。菝葜具有祛风利湿、解毒散瘀的功效，
现代药理学研究表明，菝葜主要有效成分是黄酮类化
合物，还含有酯类、甾醇类、茋类和矿物元素等，其中白
藜芦醇是芪类的一种，具有明显的抗炎作用[7]。本实
验结果显示菝葜可以增强 UC 大鼠的活动力，饮食
增多，腹泻减少，粪便隐血试验阳性率少，体质量增
加，病理病变明显改善，提示菝葜对 UC 有一定的治
疗作用。
核因子（NF-κB）是一类能与多种基因启动子或
增强子部位 κB 位点发生特异性结合并促进其转录的
蛋白质。一般状态下 NF-κB 二聚体与一种被称为 IκB
的抑制蛋白结合形成三聚体，以无活性形式存在于细
胞浆中，当细胞受到刺激时，IκB 激酶被磷酸化，IκK
即从无活性状态转为活性状态，进而磷酸化 IκB，磷酸
化、泛酸化的 IκB 再被 26S 蛋白酶小体降解，受其抑制
的 NF-κB 得以释放，脱离 NF-κB-IκB 三聚体，由胞质
进入核内，与相应靶基因中的启动子或增强子 κB 位
点结合，诱导靶基因的转录，从而直接参与机体对炎
症及免疫反应的调控[8，9]。NF-κB 是 UC 炎症级联放
大效应及“瀑布样效应”的开关[10]，NF-κB 可促进多
种炎性细胞因子，如 IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α
等基因的转录[11，12]，NF-κB 活化可能是 UC 病理生理
过程的枢纽。TNF-α 是一个比较重要的前炎症因子
及抗肿瘤因子，TNF-α 激活的炎症反应主要通过 2 个
不同的跨膜受体即 TNFR1 和 TNFR2 来完成[13]。其
中 TNFR1-TRADD 复合物能招募下游的 NIK（NF-κB 
图 3　NF-κB 免疫组化的结果
注：与模型组比较，**P<0.01。
图 4　Western boltting 检测菝葜对 TNBS 诱导的 UC 大鼠
TNF-α、NF-κB 的影响
注：与模型组比较，**P<0.01。
₏፤ᄥ⚓㏰ Ὅಷ㏰㤉㦈㏰ ᑦ⮰Ც㏰₏፤ᄥ⚓㏰Ὅಷ㏰㤉㦈㏰ᑦ⮰Ც㏰  
表4　各组大鼠NF-κB、TNF-α的表达情况（x±s，n=12）
组别 IHC-NF-κB（IOD） WB-NF-κB（IOD） WB-TNF-α（IOD）
对照组 3.2±0.86** 0.49±0.01** 0.24±0.02**
模型组 12.3±2.07 0.85±0.05 0.67±0.04
菝葜组 6.8±0.67** 0.71±0.04** 0.31±0.03**
强的松组 6.8±0.79** 0.69±0.03** 0.33±0.01**
注：与模型组比较，**P<0.01。     
₏፤ᄥ⚓㏰₏፤ᄥ⚓㏰ Ὅಷ㏰Ὅಷ㏰ 㤉㦈㏰㤉㦈㏰ ᑦ⮰Ც㏰ᑦ⮰Ც㏰/κ#5/αDUJO     
α

2015　第十七卷　第三期　★Vol.17 No.3
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕554
1  沈慧敏,杨越波,方莉,等.金刚藤胶囊治疗慢性盆腔炎临床疗效观
察.中药材,2007,30(10):1340-1343.
2  Shu X S, Gao Z H, Yang X L. Anti-inflammatory and anti-nociceptive 
activities of Smilax china L. aqueous extract. J Ethnopharmacol, 2006, 
103(3):327-332.
3  孙靖.北京实验动物学会第四届工作总结.实验动物科学与管
理 ,1998(3):69-70.
4  刘震泽,严惠敏,王维刚.小鼠动物实验方法系列专题 ( 三 )——三硝
基苯磺酸诱导的 C57/BL6 小鼠结肠炎模型的建立方法.中国细胞生
物学学报,2011,33(3):237-243.
5  谢艳,魏兵,欧阳钦.疾病活动指数在炎症性肠病诊治中的应用.中华
消化杂志,2001,21(9):43-44.
6  彭月芹,倪秀军,杨耀文,等.溃疡性结肠炎中医治疗临床研究进展.辽
宁中医杂志,2010(3):565-567.
7  郝利君,冯芳,郝小芳.菝葜的研究进展.现代中药研究与实践,2010,24(1):
         70-73.
8  顾培青,沈洪,刘丽,等.清肠化湿方对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠
TLR-4、NF-κBp65 蛋白表达的影响.中国中医急症,2010,19(1):99-
101.
9  Liu  X,  Mei  Z,  Qian  J,   et al.   Puerarin  partly  counteracts  the 
inflammatory response after cerebral ischemia/reperfusion via activating 
the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neural Regen Res, 2013, 
8(34):3203-3215.
10  Mcgovern D P, Hysi P, Ahmad T, et al. Association between a complex 
insertion/deletion polymorphism in NOD1 (CARD4) and susceptibility to 
inflammatory bowel disease. Hum Mol Genet, 2005, 14(10):1245-1250.
11  Sen P, Wallet M A, Yi Z, et al. Apoptotic cells  induce Mer  tyrosine 
kinase-dependent blockade of NF-kappaB activation in dendritic cells. 
Blood, 2007, 109(2):653-660.
12 Baghel K, Srivastava R N, Chandra A, et al. TNF-alpha,  IL-6, and 
IL-8  cytokines  and  their  association with  TNF-alpha-308 G/A 
polymorphism and postoperative  sepsis. J Gastrointest Surg, 2014, 
18(8):1486-1494.
13 Bradley  J R. TNF-mediated  inflammatory disease. J Pathol,  2008, 
214(2):149-160.
14 Razani B, Reichardt A D, Cheng G. Non-canonical NF-kappaB 
signaling  activation  and  regulation:  principles  and  perspectives. 
Immunol Rev, 2011, 244(1):44-54.
15 Ghosh S, Karin M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell, 2002, 
109(Suppl):S81-S96.
inducingkinase）信号分子，并通 NF-κB 信号分子来
开启下游的炎症反应和细胞凋亡[14]。TNF-α 介导的
炎症反应主要是通过激活 NF-κB 的活性，NF-κB 被
激活就会发生核转位进入细胞核中，进而介导相关细
胞因子、趋化因子及黏附因子的产生[15]，而 TNF-α 又
可再作用细胞介导炎症信号的表达，周而复始形成
放大的炎症反应，加速病情的发展。因此，通过阻断
TNF-α 介导的炎症反应，对治疗 UC 具有重要的临床
意义。实验结果显示菝葜组能改善结肠组织形态和
组织学评分，减少单核细胞浸润、炎症细胞渗出，降低
TNF-α、NF-κB 的表达（P<0.01），结果提示菝葜的抗
炎作用机制可能是阻断 TNF-α 的表达，抑制 NF-κB
的激活，而 NF-κB 的抑制又减少 TNF-α 的表达，从而
阻断 TNF-α 介导的炎症反应，最终起到抗炎的作用，
阳性对照药强的松大剂量常常用于治疗 UC，但大剂量
容易引起糖尿病、类柯兴综合征，因此不能经常使用。
菝葜组与强的松组在治疗 UC 方面效果相当，且不会
出现强的松的不良反应。
综上所述，菝葜能有效减轻 TNBS 诱导的 UC，
增强大鼠的活动能力，改善结肠病理改变。可能的
机制是阻断 TNF-α 的表达，抑制 NF-κB 的激活，
而 NF-κB 的抑制又减少 TNF-α 的表达，从而阻断
TNF-α 介导的炎症反应，最终起到抗炎的作用。菝
葜抗炎作用明确，毒副作用小，可能成为治疗 UC 的
良药。
Effects of Smilax L. on TNF-α and NF-κB for TNBS Induced Ulcerative Colitis Rats
Diao Jianxin, Fan Qin, Wang Qirui, Cai Hongbing, Liu Yuanliang, Shao Meng, Sun Xuegang
(School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)
Abstract: This  study was aimed  to observe  the effects of Smilax L. water extraction on TNBS  induced ulcerative 
参考文献
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕 555
世界科学技术—中医药现代化★中药研究
colitis  (UC)  rats  in order  to provide animal experiment basis  for  a new drug  in UC  treatment. A  total  of 48 male 
SD rats were  randomly divided  into 4 groups, which were  the normal control group, model group, Smilax L. group, 
and  the prednisone group, with 12  rats  in each group. Except  the normal control group, TNBS enema was applied 
in  the UC rat model establishment. Successive  intragastric administration was given  for 7 days. And  then,  the  rats 
were  sacrificed. Colon  tissue morphology was observed and  the histological  score was evaluated. The  fecal occult 
blood was detected. HE staining was observed for pathological changes. Western blotting was used to detect TNF-α 
expression.  Immunohistochemistry  (IHC) and western blotting were used  to detect NF-κB expression. The  results 
showed that Smilax L. improved the colon morphological structure and increased the histological score. HE staining 
of the Smilax L. group indicated that the mononuclear cell infiltration and inflammatory cell exudation were obviously 
less than the model group. Western blotting showed that Smilax L. water extraction can effectively reduce the TNF-α 
expression  (P < 0.01).  IHC and western blotting showed  that Smilax L. water extraction can effectively  reduce  the 
NF-κB expression. There was significant difference compared to the model group (P < 0.01). The effect was similar 
to the prednisone group. It was concluded that Smilax L. water extraction had treatment effect on TNBS induced UC 
rats. The possible mechanism was to reduce TNF-α expression, inhibit NF-κB expression, in order to have the anti-
inflammatory effect. Smilax L. may be a good medicine for UC treatment.
Keywords: TNBS, Smilax L., prednisone, colitis, TNF-α, NF-κB
（责任编辑：李沙沙　张志华，责任译审：王　晶）