全 文 ：第 15 卷
1 9 8 2
实 验 生 物 学 报
Ac ta B i
ol g oi毓 E xP e ri me nt a l is S i i ne a
V l o
.
15
,
N o
.
1
M a r e h 198 2
长叶车前花叶病毒 (HRVhs )外壳蛋白赖氨酸残基
经三硝基苯磺酸修饰后的空间结构变化
郁操国 王鸣岐
(上海复旦大学 生物系 )
巫爱珍 孙玉 昆
(中国科学院 上海生物化学研究所 )
引 言
前文报道了长叶车前花叶病毒颗粒外
壳蛋白经三硝基苯磺酸修饰一个赖氨酸残
基后则丧失其感染力 90 % 以上 l[] 。 修饰后
的 H R V 。 h能干扰夭然 H R V 。 、 与青莱原生
质体的结合 。 说明病毒颗粒表面的赖氨酸
残基与感染有密切关系 。 H R V hs 蛋白外壳
除了保护病毒核酸之外还具有重要的生物
功能。 关于烟草花叶病毒 ( T M V ) 的外壳
蛋白赖氨酸残基的修饰 , cS he le e 等人用过
三硝基苯磺酸 a[] , R a m ac ha n d r a n 用过 O -
甲基异尿素 3[J , 以及其他方法 [’] , 但由于
T MV 与本文所用的 H R V B b株系不同 , 其
病毒颖粒外壳蛋白表面无赖氨酸残基 , 这
些试剂必须在 SM 尿素存在下始于病毒赖
氮酸作用 , 因而对外壳蛋白功能的研究受
到限制 。
本文报道了用紫外光差光谱和圆二色
光谱研究了 H R vs h 在尿素作用下以 及 经
三硝基苯磺酸修饰后的H R ve 、病毒制剂的
外壳蛋白亚基的“ 一螺旋及紫外差光谱的变
化 。
材料与方法
试湘
尿素系分析纯试剂 , 三硝基苯磺酸系戚正武
教授赠送 , H R V 比 按前文方法纯化 .[J ,双光路分
光光度计系中科院上海生化所自制 , 国二色仪系
eJ sc 。 产品 , C 一 60 型 。
方法
不同尿素浓度条件下的 H R V 比 外壳蛋白的
差光谱测定 按 rF ae n ke l一 C on r at .1t 方法 抽提
H R V s h 蛋白。 将 H R V s h 蛋 白溶于 0 . 0 1 M, p H
7
.
8的磷酸缓冲液中 , 使蛋白溶液浓度 为 2 毫
克 /毫升 。 将尿素溶于 0 . ol M, p H 7 . 8的磷酸缓
冲液中 , 配制成 ZM 、 4M 、 6M 、 SM 的尿素溶
液 , 再将上述两种溶液等体积混合 , 使尿素最终
浓度分别为 i M 、 ZM 、 3M 、 4M 。 在样品光路
中 ,一个比色杯盛缓冲液 ,另一个比色杯含有尿素
和蛋白的溶液 , 在对照光路中 , 一个比色杯盛有
与样品同样浓度的尿素 , 另一个比色杯中含有与
样品同样浓度的 H R V 比 蛋白溶液 。 测定其 2 20
n m一 30 0 n m 的差光谱。
,
T N B S修饰的H R V sh 蛋白及H R V o h病毒制剂
的差光谱测定 在样品光路中 , 一个比 色 杯 中
含 0 . 01 M, p H 7 . 8的磷酸缓冲液 , 另一 个 比 色
杯中含用前文方法制备的三硝基苯磺 酸 修 饰 的
H R V hs 蛋白 (T N P 一 H R V s h ) , 其浓 度 为 0 . 2
毫克 /毫升。 在对照光路中 , 一个比色杯中含 与
样品光路同样蛋白浓度的 H R V s h 蛋白 , 另一个
比色杯中含有 o . 4 x 10 ~ . 毫克 /毫升 的 T N B S 溶
液。 测定其 22 0 ln 一 30 0mn 的差光谱。
称取 3 . 2 毫克 T N B S 溶于 10 毫升水中 , 使
T N B S 浓 度 为 0 . 32 毫 克 /毫 升。 将 H R V . h 与
1 9 8 1年 1月 2 4日收到 。
感谢蔡嘉坤同志协助差光谱测定 , 苏州丝绸 工 学
院丝绸化学教研组协助二色仪光谱测定 .
郁操国 王鸣岐 巧 卷
H R V曲 外壳蛋白尿素变性是不可逆的。 这
一结果与 H R V B、 外壳蛋 白经 4M尿 素 处
理后失去与核酸重建能力相符合。
眨士歹
乙 ` 吸一 ` J U ` 性 u` 沙 U ` U O石 ` U ` 6吸矛石 廿U J U U j l U J 艺 U
波长n m
口 ( l) 不 同尿奋浓度级件下的 H R V. h 外宪
蛋 白的住光讼
在 p 7 H. 8 , O . 01 M 磷酸缓冲液中
- - 一 , H R V s h 蛋白浓度 , 1 毫克 /毫升 ;尿素浓度… … , H R V 砂h蛋白浓度 , 1毫克 /毫升 ; 尿素浓度
- 一 , H R叭 h 蛋白浓度 , 1 毫克 /毫升 ; 尿素浓度— , H R vs h 蛋白浓度 , 1毫克 /毫升 , 尿素浓度
才滋`三声l
1
内`气J三f
T N BS 在35 ’ 0 , o · I M , p H S · 5的N a : C o 。一 a H ( o 。
缓冲液中保温 2 小时。 H R V ab 最终浓度为 0 . 61
毫克 /毫升 , T N B S 最终浓度为 0 . 0 32 毫 克 /毫升
(按克分子 t 计算三倍于赖氨酸残基的浓度 ) 。 把
这反应液放入样品光路中的一个比色杯中 , 另一
个比色杯中放入 PH S . 5 的缓冲液 。而在对照光路
中 , 一个比色杯中放人经上述同样反 应 条件的
H R V .b (0
.
61 毫克 /毫升 , 在 p H S . 5 的缓 冲液
中 ) 。 另一个比色杯中放入 T N BS (0 . 03 2 毫 克 /
毫升 , 在 p砌 . 5 的缓冲液中) 。 测定其 2 20 n m一
30 0 n m 的差光谱 。
T N B S修饰的H R V o h病毒制剂的圆二色光谱
测定 T N P 一 H R V . h 蛋白及天然 H R V sb 蛋白(浓
度与差光谱测定中相同》。 分别在 esJ co C 一 60 型
日二色仪上测定其 20 一26 0mn 的光谱 。
T N BS 修饰的 H R V蛋白圆二色光谱测定 用
上述差光谱测定中同一T N 一P H R V o h 及天然 H R
V sb 样品测定其 Zo n m一 26 Ourn 的圆二色光谱。
结 果
ó .2
-lu.1, e|
|I
0一
白.0
(一 )不同尿幸浓度条件下的 H R V 。
外充盆 白的位光 ,
如图 ( 1 )所示 。 当尿素浓度从 IM增
加到 3M 时 , 蛋 白的差光谱并不明显 , 当
尿素浓度达 4 M 时 , 2 37 n m 、 2 8 7 n m 及 2 9 5
nI 处出现明显的高峰
。
2 65 lun 附近的 负
值增大 。 通常蛋白在变性时 2 37 n m 出现高
峰 [ , ] , Z s 7mn , 2 9 6mn 的高峰分别表示 酪
氨酸残基和色氛酸残基在空间结构中的变
化 [8 ] 。
与 4 M 尿素作用后经透析除去尿素的
H R vs
、 蛋白的差光谱如图 ( 2 )所示 。 H R
V
. 、 蛋白与 4 M 尿素作用后 , 虽透析除去
了尿素 , 但其差光谱在 2 37 晒 、 2 87 n m
及 2 9 5 l u n 仍保持着变性蛋白的特征 ,表明
? 40 全已0 280 3 00 3 2 . )
波长u m
与尿 班作用后组析除去尿班的 H R V比
盈白的位光讼
在 p H 7 . 8 , O . OI M 的磷酸缓冲液中 , 蛋白浓度为
0
.
68毫克 /毫升 .
(二 ) T N BS 修饰的 H R V 。 h 受白及 H
R V
。 h 病毒制荆的位光讼
如图 ( 3 )所示 ,当完整的 H R vs h 颗粒
经 T N B S 修饰其外壳蛋白表面的一个赖氨
酸残基后 , 2 60 lun 出现一个宽的差光谱带 ,
2 3 o n rL n 及 2 87 nIU 两处有肩状突起 。表明空
间结构发生了某些改变 。
T N B S 修饰后的 H R V B h 蛋 白的 差 光
谱在 2 30 mn 处呈现一 高峰 ,另外在 2 4 0 n m
1 期 长仆卜车前花叶病毒( H R Vs h )外壳蛋白赖氨酸残基
一 2 o 6n m 及 Zs o n m 一2 o 9n l n 区域有 二 个 冲 。 一 ,
肩状突起 。
十 1 0 0
一 10 0
一2 0 0
乏叮。三ùP`·auJ创`ū仍目
一 3 0 0
圈 (3) 三硝若笨劝吐修饰的 H R V 日h 受白及
H R V
s h 病 . 翻荆的位光讼
— , T N P一H R Vs h 蛋白的差 光 谱 , 在 p H 7 . 8,心 . ol M的磷酸缓冲液中 , T N P一H R 、 飞b 蛋白浓度为0 . 2
毫克/毫升 , T N B S 浓度为 O. 4 x 1O , 毫克 /毫升 , H R
V心 蛋白浓度为0 . 2 毫克/毫升 ; — ·— ·— T N P -H RV 曲 病毒制剂的差 光 谱 , 在 p H S . 5 , 0 . I M 的 N、
C仇 一N aH C q 缓冲液中 , H R 、 飞b 浓度为0 . 61 毫克/毫
升 , T N B S浓度0 . 0 3 2毫克 /毫升 .
波长( n m )
圈 (4) 三峭若笨 . 吸修饰的 H R叭 1: 蛋 白的 . 二
色光讼在 p H 7 . 8 , 0 . 01 M 的确 . 妞冲液中
-一 T N P一 H R V hs 蛋白 , 浓度为 0 . 2 毫克 /毫升 :— H R V ` b蛋白 ,浓度为 0 . 2 2毫克 /毫升 . … … T N B S浓度为 O. 4 x 1 O一 , 毫克 /毫升 .
如图 ( 6 )所示 , T N P一 H R V 。、 的圆二
色光谱与天然 H R V o h 相比 , 其 2 4 4 m n 一 2 9 0
n m的正吸收峰消失 “ 同 H R vs h蛋 白的圆二
(三 ) T N B S 修饰的 H R V s h 蛋白的 -
二色光讼
如 图 ( 4 )所示 , T N B S 无圆二色光谱
吸收 。 H R V o h 蛋 白于 Z o 6 n m , Z 1 6 n m 处为
负的圆二色光谱吸收峰 , 与 TM V 普通 株
不完全相同 9j[ 。
当 H R V S、 蛋 白经 T N B S 修饰后 , T N
P一 H R V s , , 蛋白于 2 0 6 n m 一 2 1 6 n m 区域 内
与天然 H R巩 h 蛋白不 同 , 20 6m n一21 6n m
的负圆二色光谱稍有变化 。 结果表明 “ 一螺
旋虽经 T N B S 修饰变化很小 。
(四 ) T N B S 修饰的 H R V S 、 病毒制 荆
的曰二色光讼
X 1 0
十 I (
,召了花昌B。创忿ù
波长 ( n m )
口 ( 5) 三硝基攀嘴吸修 饰的 H R V山 病 . 制
剂 的 圆二色光讼 , 在 p H S . 5 , 0 . 1几l
的 N a 留C O a一N a H C O : 妞 冲液中
… … T N P一 H R V 山 , 病毒浓度为0 . 61 毫克/毫升 ;
— H R v 止 , 病毒浓度为 0 . 61 毫克 /毫升 。
郁操国 王鸣岐 巧 卷
色性光谱相似 , 在 2 07 ln
、
2 16 ln 处的
吸收峰也变化很小 , 表明完整病毒顺粒经
T N B S 修饰的一个赖氨酸残基后 , 其少螺
旋变化很小。
讨 论
长叶车前花叶病毒 ( H R vs 、 )于 4M 尿
素存在下 , 其外壳蛋白亚基的 琉 基才 与
D T N B (5
,
5一二硫二 (2 硝基苯甲酸 , )反
应 , 而三硝基苯磺酸与 H R V a b 的反 应 却
与 TM V 不同 , 不需要尿素存在 , 表面的
一个赖氨酸残 基 就能 被 T N B S 修 饰。
T N BS 修饰后的 H R V hs 制剂仍保持 着 病
毒城粒的完整 , 但丧失其感染力达 90 %以
上 , 并能干扰天然 H R V . h 的感染 , 表明
T N B S 修饰的 H R vs h 首先是丧失了 赖 氨
酸 卜氛基的正 电荷 , 其次是空间结构是否
发生了变化?了解 T N B S 修饰后的 H R V 。 。
外壳蛋白在空间结构的变化与功能的关系
是本文的 目的 。 H R矶、 外壳蛋白亚 基 于
l
、
2
、
3M 尿素存在下的紫外光差光谱变
化很少 , 当尿素增加到 4 M时 , 在 2 37 n m 、
28 7 lun 和 2 9 6 n m 分别呈现三个差光 谱的
吸收高峰 , 2 37 ln 高峰出现为一般蛋白质
变性时所常见 , 2 87 ln 、 2 95 n m 的高峰分
别反映了蛋白亚基中的空间结构受尿素作
用松散后 ,酪氨酸和色氨酸残基的变化 (图
1)
。 当 4M尿素透析去除后 , H R v s 、 外壳
蛋白亚基仍呈现变性状态的差光谱 (图2) 。
表明尿素变性过程是不可逆的 , 这一结果
和 H R V . 。 外壳蛋白经 4M尿素处理透析除
去尿素后仍不能与核酸重建形成病毒颗粒
的结果相一致 .
T N B S 在无尿素存在下仅修饰一个赖
氨酸残基后的 H R V . h 外壳蛋白的差 光 谱
除了在 2 30 n m 呈现高峰 之 外 , 在 2 80 、
2 9 0
lun 有二个肩状突起 , 而完整的 H R V小
病毒顺粒制剂除 2 60 n m 呈现较宽的 差 光
谱高峰外 ,在 2 30 mn 和 2 87 mn 呈现肩状
起 。 2 30 ln 一 2 35 mn 的峰和肩状突起以叠
2 8 6 n m 的肩状突起分别反映了肤链和酪氮
酸残基在蛋白三级结构中的局部变化 , 反
映了 T N BS 修饰后的H R V .b外壳蛋白和完
整的 H R V B、 颗粒都发生了空间结构的变
化 。 但值得指出的是 T N BS 修饰的H R V必
蛋白和完整病毒颖粒制剂在 2 0 5一 2 15 n m
的圆二色光谱的变化却很小。而 T N R S 修
饰的完整病毒颗粒制剂在 24 一 2 9 0 n m 的
圆二色光谱呈现较小的正值峰 , 尚不知其
变化的意义 。
上述结果说明 T N B S修饰一个赖氨酸
残基后的 H R Y B h 外壳蛋白和 H R ve h 完整
顺粒的“ 一螺旋变化很小 , 紫外差光谱反映
的空间结构的局部变化可能导致病毒顺粒
感染力的丧失。
摘 要
用紫外光差光谱和圆二色性光谱研究
了长叶车前花叶病毒 R R V S、 在尿素作 用
下以及经三硝基苯磺酸 ( T N BS ) 修饰后外
壳蛋白亚基空间结构的变化。 T N B S 修饰
一个赖氨酸残基后的 H R V曲外壳蛋 白 和
H R V 必完整顺粒的 “ 一螺旋变化很 小 。 空
间结构的变化是局部的。 讨论了空间结构
变化与生物活力的关系 。
1 期 长叶车前花叶病毒( H R V sh) 外壳蛋白赖氨酸残基
株 ( H R V sh ) 的研究
刊 , 1 98 0 年第一期 .
[ 6 ] F
r a e n k e l一 C o n r a t H
,
5
l 纯化及性质 . 病毒学集
参 考 文 献
1 9 5 7
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株外壳蛋白赖氨酸残基的修饰对感染及重建的
影响 . 实验生物学报 , 14 .
忆2 ] R o r比 r t B . S e h e e le a n d M a x A L a u fe r
19 6 9
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R es t ir e t e d r e a e t iv i t y o f 卜 a m in o
a c id g r o u P of t
o b a e e o m o s a ie v i r u s P r o t e in
t o 、 v a r d s t r i n i t r o b e n z e n s u lof n i e a e id B玄。 -
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[ 3 ] R
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.
3 2 : 5 5 7
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[ 4 ] F
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〔 5】郁操国等 , 1 9 7 9 . 长叶车前花叶病毒上海分离
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[ 8 ] D
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n e e s P e e tar a n d c h r o m o P h o r e e n v i r o n l n e n t
.
A如 . 尸阳份 in 以 。 m i s t夕 1 7: 3 4 6一 3 7 5 .
[ 9 ] H
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s e d i m
e n t io n s t u d ie s o n t h e r e c o n s t i t u t io n
o f t o b a e c o m o s a ie v ir u s
.
A几 h . B `o ` h亡仇 .
B i op 勺, . 1 6 5: 3 4一 一3 5 .
C IR C U L A R D I C H R O I SM A N D D I F F E R E N C E S P E C T R U M
S T U D I E S O N H R V
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。 , , sh o w e d t h a t t h e r e a r e a P e a k
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r e s P e e t i v e l y
.
T h e T N P -
H R V
s h s h o w s a d ife
r e n e e s P e e t r a P e a k
a t 2 6 0 n m
a n d t w o s h o u ld e r s a t 2 3 0 n m
a n d 2 8 7 n m
,
T h e s e r e s u l t s i n d i e a t e d
t h a t t h e m
o d i if e a t i
o n o f a ly s i n e r e s id u e
o f H R V
o h w i t h T N BS e a u s e d s o m e
l o e a l a l t e r a t i o n o f t e r t i a r y s t r u e t t 一r e o f
H R V
o h w h i c h l e d t o t h e 10 55 o f i t s i n
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fe e t i v i t y
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