全 文 ：第 50 卷 第 10 期
Vol． 50 No． 10
山 东 大 学 学 报 (医 学 版)
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY(HEALTH SCIENCES)
2012 年 10 月
Oct． 2012
收稿日期:2012-08-09
作者简介:孟宪邑(1984 － ) ，男，博士研究生，主要从事基础免疫学研究。E-mail:mengxianyi1984@ gmail． com
通讯作者:吴震州(1979 － ) ，男，讲师，主要从事基础免疫学研究。E-mail:wuzhenzhounk@ 163． com
文章编号:1671 － 7554(2012)10 － 0081 － 05 DOI:10． 6040 / j． issn． 1671-7554． 2012． 10． 017
娃儿藤碱类化合物 DCB-3503 对 TNBS 诱导
溃疡性结肠炎的治疗作用
孟宪邑，张芸，吴震州
(南开大学生命科学学院，天津 300071)
摘要:目的 探讨娃儿藤碱类化合物 DCB-3503 对三硝基苯磺酸( TNBS) 诱导溃疡性结肠炎的治疗作用及可能的
作用机制。方法 选用 C57BL /6 野生型小鼠 24 只，分为对照( EtOH) 组、实验( TNBS + DMSO) 组、治疗( TNBS +
DCB-3503) 组。造模 3 d后，观察各组间结肠长度、病理切片以及肠系膜淋巴结中 IFN-γ +炎症性细胞和调节性 T
细胞( Treg) 的差异。分离肠黏膜上皮细胞( IECs) 总蛋白，Western blot检测 Treg 标志蛋白 Foxp3 的变化。结果
治疗组损伤较实验组明显减轻，其肠系膜淋巴结中 IFN-γ +细胞显著减少，Treg 细胞显著增多，且 IECs中 Foxp3 表
达明显上调。结论 在溃疡性结肠炎中，DCB-3503 通过诱导 T 细胞分化为 Foxp3 + Treg 细胞，从而抑制 IFN-γ +炎
症性细胞发挥作用，最终缓解肠道的炎症反应。
关键词:溃疡性结肠炎;三硝基苯磺酸; IFN-γ; Treg; Foxp3
中图分类号:R574． 62 文献标志码:A
Therapeutic effect of tylophorine analog DCB-3503 on
TNBS-induced ulcerative colitis
MENG Xian-yi，ZHANG Yun，WU Zhen-zhou
(College of Life Science，Nankai University，Tianjin 300071，China)
Abstract:Objective To evaluate the protective effect of tylophorine DCB-3503 on trinitrobenzene sulfonic acid (TN-
BS)induced ulcerative colitis and the possible molecular mechanism． Methods 24 C57BL /6 wild-type mice were di-
vided into three groups:EtOH group，TNBS + DMSO group and TNBS + DCB-3503 group． Three days after the model
was set up，the mice were killed and colon length，histological section，patterns of IFN-γ + inflammatory cells and Treg
cells were examined． Besides，the expression of Foxp3 in IECs was detected using Western blot． Results Compared
with TNBS + DMSO group，DCB-3503 treatment group displayed remarkably improved clinical symptoms． Percentage
of IFN-γ + inflammatory cells in mesenteric lymph node was significantly decreased in TNBS + DCB-3503 group．
Meanwhile the percentage of Treg cells in mesenteric lymph node and the expression of Foxp3 in intestinal epithelial
cells (IECs)were significantly increased after DCB-3503 treatment． Conclusion The increase of Treg cells and de-
crease of IFN-γ + inflammatory cells in DCB-3503 treatment group suggest that DCB-3503 can ameliorate the ulcerative coli-
tis induced by TNBS via the growing number of Foxp3 + Treg cells and their suppression on IFN-γ + inflammatory cells．
Key words:Ulcerative colitis;Trinitrobenzene sulfonic acid;IFN-γ;Treg;Foxp3
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)又称非特
异性溃疡性结肠炎，是炎症性肠病(inflammatory
bowel disease，IBD)的一种，其临床发病率在国内
外均有逐年上升的趋势。UC 患者临床表现为持续
或反复发作的腹泻、黏液脓血便，伴腹痛和不同程度
的全身症状。UC 的具体病因和发病机制尚不清楚，
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但人类流行病学和基因学的研究结果显示，遗传因
素和肠道微生物引起的免疫应答改变综合影响了溃
疡性结肠炎的发生和发展［1-2］。DCB-3503 属于娃
儿藤碱类化合物，Gao 等［3］最早报道其显著的抗肿
瘤作用。此外，You 和 Choi 等［4-5］研究发现，DCB-
3503 可以通过抑制相关细胞因子的分泌治疗关节
炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病。本研究通过探讨
DCB-3503 在三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic
acid，TNBS)诱导的溃疡性结肠炎模型中的治疗作
用，为炎症性肠病的药物靶点治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验动物 C57BL /6 野生型小鼠，雌性，
6 ～ 8周，购自北京军事医学科学院。
1． 1． 2 主要试剂 三硝基苯磺酸、佛波酯、离子霉
素购自美国 Sigma公司;PerCP标记的抗小鼠 CD4、
PE 标记的抗小鼠 IFN-γ、PE 标记的抗小鼠 Foxp3
购自美国 Biolegend 公司;兔抗鼠 Foxp3、β-actin 多
克隆抗体购自美国 CST 公司;细胞因子和 Foxp3 胞
内染色试剂盒购自美国 Ebioscience 公司。RPMI-
1640培养基和血清购自美国 Gibco 公司。DCB-3503
由南开大学化学学院合成并用二甲亚砜(dimethyl
sulfoxide，DMSO)溶解。
1． 2 方法
1． 2． 1 实验模型及分组 将 24 只 C57BL /6 野生
型小鼠分为 3 组:对照(EtOH)组、实验(TNBS +
DMSO)组和治疗(TNBS + DCB-3503)组。异氟烷
麻醉小鼠，将 3． 5 F 粗塑料导管插入小鼠肛门 4 cm
处，缓缓注入 120 μL 乙醇或 2． 5 mg TNBS 灌肠剂。
保持小鼠头朝下，倒悬 3 min。灌肠 2 h 后实验组和
治疗组分别腹腔注射溶剂 DMSO 和剂量为 5 mg /kg
的 DCB-3503，此后每天注射药物并测量小鼠体质
量，3 d后处死小鼠。
1． 2． 2 组织损伤程度评估 取近肛门 1 cm 处一段
组织标本，石蜡包埋，切片，HE 染色，观察组织学改
变，按照 Ito 等［6］提出的标准评分。上皮损坏:正常
形态为 0 分，杯状细胞缺损为 1 分，杯状细胞大面积
缺损为 2 分，隐窝缺损为 3 分，隐窝大面积缺损为 4
分。炎症细胞浸润:无细胞浸润为 0 分，浸润围绕隐
窝基部为 1 分，浸润到黏膜肌层为 2 分，大量浸润到
黏膜肌层、黏膜增厚并大面积水肿为 3 分，浸润到黏
膜下层为 4 分。
1． 2． 3 肠系膜淋巴结细胞提取及流式抗体染色
将小鼠处死后剪开小鼠腹部皮肤，在大肠附近系膜
上找到 4 ～ 5 个肠系膜淋巴结，逐个将其放入细胞筛
网中，再用玻片将其磨碎。溶解红细胞并计数后将细
胞浓度调整为 2． 5 ×106 /mL，取 500 μL 放于 48孔板
并添加佛波酯(200 ng /mL)、离子霉素(1 μg /mL)。
再刺激 6 h后收集细胞并用 Ebioscience细胞因子染
色试剂盒染色。其余细胞用 Ebioscience公司 Foxp3
染色试剂盒染色。流式细胞仪检测实验结果。
1． 2． 4 肠黏膜上皮细胞蛋白提取及 Western blot 检
测 将小鼠结肠装入50 mL 离心管中，加入 20 mL 用
PBS 配制的 16 mmol /L EDTA 溶液，200 r /min摇床
中孵育 20 min。剧烈振荡 20 s，将含有上皮细胞的
消化液离心。用 1 mL PBS 重悬并转入新的 1． 5 mL
EP管中，离心后沉淀即为黏膜上皮细胞蛋白。沉淀
加入蛋白裂解液，在冰上放置 10 min，收集各组蛋
白，测定浓度后将各组蛋白稀释至同一浓度，取
20 μg蛋白样品进行蛋白凝胶电泳，电转移法将蛋白
转移至 NC 膜上，5%脱脂牛奶封闭 1 h，分别加兔抗
鼠 Foxp3 多克隆抗体(1∶ 2 000)或兔抗鼠 β-actin 抗
体(1∶ 5 000) ，4 ℃孵育过夜。洗涤后，加入 HRP 标
记的山羊抗兔二抗(1∶ 5 000) ，37 ℃孵育 2 h，洗涤
后再经过显色、曝光、显影、定影得到实验结果。
1． 3 统计学处理 采用 GraphPad Prism 4． 0 软件，
数据以 珋x ± s 表示，两组间比较采用 t检验，P ＜ 0． 05
为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 小鼠体质量及结肠长度变化 造模成功后，每
天给药并观察小鼠体质量，发现治疗组小鼠比实验
组小鼠体质量下降减少(P ＜ 0． 05) ，提示 DCB-3503
对 TNBS 诱导的急性结肠炎具有治疗作用。此外，
造模成功后第 3 天处死小鼠，发现两组小鼠结肠长
度和炎症程度也有显著差异。实验组小鼠的结肠出
现缩短、水肿等症状;而治疗组小鼠结肠则与对照组
小鼠的结肠相似，较为细长，颜色均一。该结果进一
步表明，DCB-3503 对 TNBS 诱导的急性结肠炎有
一定的治疗作用。见图 1。
2． 2 小鼠组织损伤切片评分 实验组小鼠与对照
组小鼠相比，肠壁增厚，隐窝缺失严重，黏膜层脱落，
黏膜下层淋巴细胞浸润增多;而治疗组小鼠虽然较
对照组小鼠肠壁增厚，但黏膜层完整，黏膜下层淋巴
细胞浸润较少。治疗组小鼠较实验组小鼠结肠炎严
重程度轻。见图 2。
孟宪邑，等．娃儿藤碱类化合物 DCB-3503 对 TNBS 诱导溃疡性结肠炎的治疗作用 83
图 1 TNBS 诱导溃疡性结肠炎小鼠的体质量曲线和结肠长度(*P ＜ 0． 05)
A:造模成功后小鼠的体质量曲线;B:结肠照片;C:结肠长度。
Fig． 1 Body weight change and colon length of the colitis model induced by TNBS(*P ＜ 0． 05)
A:Body weight change of the mice colitis model;B:Colon photos;C:Colon length．
图 2 结肠切片及病理损伤评分(*P ＜ 0． 05)
A:结肠切片 HE染色(× 200) ;B:切片病理损伤评分。
Fig． 2 Colon sections and histological scores(*P ＜ 0． 05)
A:Colon sections staining with HE(× 200) ;B:Histological scores．
2． 3 肠系膜淋巴结中 IFN-γ +炎症细胞 实验组小
鼠肠系膜淋巴结中分泌 IFN-γ的淋巴细胞数量比对
照组小鼠显著增多，治疗组小鼠肠系膜淋巴结中分
泌 IFN-γ的淋巴细胞数量则比实验组小鼠显著减少
(P ＜ 0． 05) ，见图 3。
2． 4 肠系膜淋巴结中 Foxp3 + Treg 变化及肠黏膜
上皮细胞中 Foxp3 的表达 流式染色及数据统计结
果显示，治疗组小鼠较实验组小鼠肠系膜淋巴结中
Treg 数量显著增多(P ＜ 0． 05) ，见图 4。IECs 中
Foxp3 检测结果显示，治疗组小鼠 Foxp3 的表达量
显著增多。
图 3 肠系膜淋巴结中 IFN-γ的分泌(*P ＜ 0． 05)
A:小鼠肠系膜淋巴结中淋巴细胞 CD4 和 IFN-γ流式染色结果;B:IFN-γ +淋巴细胞统计结果。
Fig． 3 Secretion of IFN-γ in mesenteric lymph nod(*P ＜ 0． 05)
A:Result of lymphocytes in mesenteric lymph nod staining with CD4 and IFN-γ;
B:Statistic result of IFN-γ + lymphocytes in mesenteric lymph nod．
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图 4 肠系膜淋巴细胞中 Treg 数量变化以及 IECs中 Foxp3 的表达变化(*P ＜ 0． 05)
A:肠系膜淋巴细胞中 Treg 染色;B:Treg 细胞数量差异;C:IECs中 Foxp3 的表达。
Fig． 4 Change of Treg cells in mesenteric lymph nod and Foxp3 expression in IECs(*P ＜ 0． 05)
A:Treg staining in mesenteric lymph nod;B:Change of Treg cells number;C:Foxp3 expression in IECs．
3 讨 论
溃疡性结肠炎被认为由过强的免疫反应所介
导，在这一炎症的发生发展过程中，T 淋巴细胞起到
重要作用。日本学者 Sakaguchi 等［7］报道，在机体
中存在一群具有抑制功能的 CD4 + CD25 + Treg 细
胞，这类 T 细胞所介导的免疫调节反应是维持自身
免疫耐受的关键。Treg 细胞主要分布于人体胸腺、
外周血、淋巴器官及脐静脉血中，在健康人体中占外
周 CD4 +细胞的 5% ～ 10%［8-10］。研究显示，CD4 +
CD25 +调节性 T 细胞可以通过细胞接触依赖或细
胞因子依赖两种途径抑制炎症性细胞亚群的增
殖［11］。Fontenot 等［12］研究发现，Foxp3 在 Treg 细
胞上特异性表达，且是 Treg 细胞发育和发挥功能所
必需的。Scurfy 小鼠由于 Foxp3 基因缺陷，导致
CD4 + T 细胞介导的淋巴细胞增殖疾病。人类同源
的 Foxp3 突变可引起基因性疾病的免疫失调、内分
泌疾病和肠病［13-15］。谭至柔等［16］研究发现，在溃疡
性结肠炎患者外周血中 CD4 + CD25 + Treg 的比例
无显著变化，但 CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg 在 CD4 +
细胞中的比例与对照组相比则有明显下降趋势，提
示溃疡性结肠炎发病可能与 Foxp3 + T 细胞的数量
减少或功能障碍有关。此外，Powrie 等［17］研究发
现，将分离纯化的 Foxp3 + T 细胞过继转移到肠炎模
型小鼠中，不仅可以降低肠炎的损伤程度，而且可以
治愈已经发生的炎症，提示可以通过外来药物的干
预上调 Foxp3 基因的表达，促进外周 Treg 细胞的分
化，最终达到治愈肠炎的目的。
娃儿藤生物碱为菲骈吲哚里西啶的衍生物，主
要存在于萝摩科娃儿藤属植物中，鹅绒藤属植物催
吐白前中也含有菲骈吲哚里西啶类生物碱。娃儿藤
生物碱最早在 1935 年被发现并纯化，此后一批娃儿
藤碱类化合物被合成出来，其中某些具有较强的抗
肿瘤、抗炎症、抗真菌等生物学活性［18-20］。但是有
关娃儿藤碱类化合物在机体免疫调节方面的作用研
究较少。
本研究利用化合物三硝基苯磺酸建立模拟人溃
疡性肠炎的小鼠模型，该模型具有操作简便、造模周
期短、实验重复性高等优点。实验结果表明，实验组
小鼠体质量明显下降，结肠切片显示肠壁增厚，隐窝
缺失严重，黏膜层脱落，黏膜下层有大量淋巴细胞浸
润。治疗组小鼠体质量降低程度轻，结肠切片显示
黏膜层完整，淋巴细胞浸润较少。流式细胞术和
Western blot检测结果显示，治疗组小鼠分泌 IFN-γ
的淋巴细胞数量比实验组小鼠显著减少，肠系膜淋
巴结中 Foxp3 + Treg 显著增多，而且肠黏膜上皮细
胞中 Foxp3 蛋白表达也明显升高。这些实验结果显
示，娃儿藤碱类化合物 DCB-3503 对溃疡性结肠炎
具有治疗作用，其机制可能是 DCB-3503 通过上调
Foxp3 基因的表达，使 Treg 细胞增多，从而降低炎
症的程度。
综上所述，娃儿藤碱类化合物 DCB-3503 作为
一个潜在的免疫调节抑制剂，可以使 Foxp3 表达上
调，Treg 细胞增多，炎症性细胞减少，并最终缓解
TNBS 诱导的溃疡性肠炎。
孟宪邑，等．娃儿藤碱类化合物 DCB-3503 对 TNBS 诱导溃疡性结肠炎的治疗作用 85
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